CN102086235A

CN102086235A - 3种葵花籽多糖及葵花籽水溶性多糖的提取、分离纯化方法

Info

Publication number: CN102086235A
Application number: CN 201010569607
Authority: CN
Inventors: 王文侠; 宋春丽; 李文娟
Original assignee: Qiqihar University
Current assignee: Qiqihar University
Priority date: 2010-11-27
Filing date: 2010-11-27
Publication date: 2011-06-08
Anticipated expiration: 2030-11-27
Also published as: CN102086235B

Abstract

本发明属于食品技术领域。以脱脂葵花籽粕为原料提取、分离纯化水溶性多糖。采用碱性亚硫酸氢钠溶液浸提、离心除渣、无机酸酸沉除蛋白、碱中和的方法提取葵花籽粗多糖；所得的葵花籽粗多糖采用超滤分离得浓缩液，浓缩液经酶法结合有机酸法除蛋白、离子交换脱色、醇沉及柱层析的方法制备葵花籽多糖。利用该法制备的葵花籽水溶性多糖包含三个组分，其中一个糖组分分子量约为37KD，其余糖组分分子量小于10KD。该水溶性多糖具有较高的抗氧化活性，在食品和医药工业具有广泛的应用前景。

Description

3种葵花籽多糖及葵花籽水溶性多糖的提取、分离纯化方法

发明领域

本发明属于食品技术领域。本发明涉及葵花籽水溶性多糖及葵花籽水溶性多糖的提取、分离纯化方法，所说的水溶性多糖含有三个组分，其中一个组分的分子量约为37KD，其余组分的分子量小于10KD，该水溶性多糖具有较强的抗氧化活性。

发明背景

向日葵在全球广泛种植，不仅是一种经济食用作物，而且是一种值得开发利用的药用植物。向日葵的花盘、杆、叶子和种子都有药用价值。我国向日葵的生产已由过去零星种植发展成为仅次于油菜、大豆、棉籽和花生的第五大油料作物，年栽培面积已达9.5×10hm²，年总产量位居世界第六位。

葵花籽为向日葵籽实，葵花籽仁低聚糖含量达到10％以上，水不溶性以及水溶性多糖类2.7％。我国尽管是向日葵的生产大国，但是向日葵的基础研究工作却显得十分薄弱，目前大部分的研究主要集中在品种资源和种植等方面，而对葵花籽的加工仅局限于油脂、蛋白质以及绿原酸等酚类化合物等方面，例如，01111025.2葵花籽水剂一步法分离油蛋白提取技术，89104414.0从葵花籽中提取并提纯蛋白质提取物的方法，200510047693.0从葵花籽饼中提取绿原酸及葵花蛋白的方法，但是国内对葵花籽水溶性多糖及其提取纯化方面的专利及研究未见报道。

葵花籽多糖具有抗肿瘤、抗病毒、抗炎活性、免疫调节作用、抗氧化及抗衰老作用、降血糖作用、保肝作用及抗凝血作用。本发明的目的是将来源广、成本低的葵花籽充分利用，以脱脂葵花籽粕为原料，提取、分离纯化水溶性多糖，并对其性质进行初步研究，这为进一步了解葵花籽糖类物质的结构与生物活性关系提供理论基础，填补国内该项研究空白，丰富了糖类科学，为葵花籽糖类物质的开发利用提供理论依据。该研究成果对提升葵花籽的产业价值，拓展葵花籽深加工途径具有重要的理论和实践价值。

发明内容

本发明的目的是提供葵花籽水溶性多糖的提取、分离纯化方法。

以下将具体描述该发明的实施方法。

以脱脂葵花籽粕为原料提取、分离纯化水溶性多糖的工艺流程如附图所示。

要点如下：

1.浸提：

脱脂葵花籽粕中有大量的酚类物质，其含量为3％～4％，其中绿原酸是对葵花籽蛋白质质量影响最大的酚类物质。在提取过程中，由于多酚氧化酶和空气中氧的作用，在中性或者碱性条件下提取时，绿原酸很容易被氧化成醌，使得提取出来的蛋白质变色，并且影响了多糖和低聚糖的色泽。亚硫酸氢钠作为抑制多酚氧化酶酶促褐变的高效抑制剂，既可直接作用于酶本身，降低酶对单酚和二酚类的催化反应活性，又可与第一步酶促反应生成的醌类物质发生不可逆的结合形成无色物质，同时，亚硫酸盐有漂白的作用；碱性条件有利于蛋白质的溶出。采用碱性亚硫酸氢钠法浸提脱脂葵花籽粕低聚糖有利于产品的精制。浸提条件：浸提温度40～70℃(例如40～70℃，如约50℃)；液固比5～20∶1v/w(液固比指亚硫酸氢钠溶液体积与葵花籽粕的质量之比，亚硫酸氢钠浓度以0.1％～2％w/v(例如，0.1％，0.2％，0.3％或0.5％w/w)存在)；pH值7.5～10.0(例如，7.5，8.0，8.5或9，如约8.0)；浸提时间0.5～6h(例如，1，2，4，5或6h，如约5h)；

2.离心除渣：

在转速为5000r/min的条件下离心10min，收集上清液。

3.酸沉除蛋白：

用0.1～2mol/L盐酸调节上清液pH至4.0～4.5后，3000～5000r/min离心10～30min，收集上清液。

4.碱中和：

用0.1～2mol/L氢氧化钠调节上清液pH至7.0。

5.超滤：

在压力为0.01～0.1Mpa(例如0.02～0.06MPa，如约0.05MPa)、温度为10～40℃(例如20～30℃，如约25℃)的条件下对上清液进行超滤处理，收集浓缩液。

6.酶法结合三氯乙酸(TCA)法除蛋白

采用酶法结合三氯乙酸(TCA)法除蛋白。首先利用碱性蛋白酶法除蛋白：酶解温度40～65℃，pH值7.5～9.0，加酶量1％～4.0％w/w，酶解时间0.5～2h；酶解结束后，TCA处理酶解液进一步除蛋白：TCA浓度以0.1％～3％w/w(例如，0.1％，0.5％，1.0％或1.5％w/w)存在，时间以0.5～3h(例如，0.5，1，2或3h)存在；

7.脱色：

采用D296型树脂对多糖进行脱色；脱色柱为Φ1.0×10cm，树脂填装量为5ml。上样量为0.5～10ml(例如，2，3，4或5ml)，蒸馏水洗脱，流速为0.1～2ml/min(例如，0.5，1，1.5或2ml/min)；

8.醇沉：

乙醇浓度为80％v/v存在；温度1～20℃(例如4～10℃，如约4℃)；时间以12～36小时(例如，15，20，24或36小时)存在；离心转速为1000～8000r/min(例如1000～6000r/min，如约5000r/min)；时间以15～30min(例如，15，20，25或30min)存在；

9.柱层析：

采用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析分离葵花籽多糖，分离条件为：层析柱为Φ2.6×20cm，上样量为0.5～10ml(例如，0.5，1，2或5ml)；洗脱流速为0.1～3ml/min(例如，0.5，1，1.5，2或3ml/min)；以蒸馏水、0.1～0.4mol/L NaCl溶液阶段梯度洗脱；蒸馏水洗脱分离得到DPW组分，0.1～0.4mol/L NaCl溶液洗脱分离得到DPN1组分；采用Sepharose CL-6B柱层析进一步分离糖组分，分离条件为：层析柱为Φ1.6×100cm，上样量为0.1～5ml(例如，0.1，0.5，1或5ml)，洗脱流速为1～5ml/min(例如，1，2，3或5ml/min)，洗脱液为0.1mol/L NaCl溶液，最终得到三个组分，其中，DPW为单一组分，DPN1含有两个组分，分别为DPN1-S1和DPN1-S2。

附图说明

图1以脱脂葵花籽粕为原料提取、分离纯化水溶性多糖的工艺流程

实施例1

本发明还将通过具体实施例的方式作进一步说明，这些实施例仅仅是举例说明性的而没有限制本发明范围的意思。

取1kg过60目筛的脱脂葵花籽粕置于容器中，按照液固比10∶1v/m加入亚硫酸氢钠溶液(其中亚硫酸氢钠溶液的浓度为0.30％m/v)，用2mol/L氢氧化钠将固液混合物pH至8.0，55℃条件下搅拌提取5h。浸提结束后，在5000r/min的条件下离心10min去除渣子，收集上清液。用2mol/L盐酸调上清液pH至4.5，在5000r/min的条件下离心20min，收集上清液。用2mol/L氢氧化钠调节上清液pH值至中性。在压力为0.05Mpa，20℃对上清液进行超滤处理，收集浓缩液；在温度55℃，pH值8.0，碱性蛋白酶添加量4.0％w/w条件下对超滤所得浓缩液进行酶解处理1h；用浓度为1.5％TCA w/w处理酶解液2h，收集上清液。用D296型树脂洗脱上清液，对多糖进行脱色：上样量5ml，蒸馏水洗脱，流速为1ml/min；洗脱液用80％v/v乙醇，4℃醇沉12h，5000r/min离心20min，收集沉淀。沉淀于-50℃，真空度为80Pa进行真空冷冻干燥。利用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析法分离多糖：上样量6ml，流速2ml/min，以蒸馏水、0.1mol/L NaCl溶液阶段梯度洗脱，蒸馏水洗脱分离得到DPW组分，0.1mol/L NaCl溶液洗脱分离得到DPN1组分；利用Sepharose CL-6B柱层析法进一步分离混合组分：上样量0.5ml，流速0.5ml/min，洗脱液为0.1mol/L NaCl溶液，最终得到三个组分，其中，DPW为单一组分，分子量小于10KD。DPN1含有两个组分，分别为DPN1-S1和DPN1-S2，前者分子量约为37KD，后者分子量小于10KD。

Claims

1.一种以脱脂葵花籽粕为原料提取、分离纯化水溶性多糖的方法，其特征包括以下步骤：

(a)采用浸提、离心除渣、酸沉除蛋白、碱中和的方法提取葵花籽粗多糖；

(b)对步骤(a)处理所得的物料进行超滤浓缩、酶法结合三氯乙酸(TCA)法除蛋白、脱色、醇沉、柱层析的方法分离纯化葵花籽多糖；

2.权利要求1所述的提取方法，浸提工艺其特征在于：

温度40～70℃(例如40～70℃，如约40℃)；液固比5～20∶1v/w(液固比指碱性亚硫酸氢钠溶液体积与葵花籽粕的质量之比，亚硫酸氢钠浓度以0.1％～2％w/v(例如，0.1％，0.2％，0.3％或0.5％w/w)存在；pH值7.5～10.0(例如，7.5，8.0，8.5或9，如约8.0)；浸提时间0.5～6h(例如，1，2，4，5或6h，如约5h)；

3.权利要求1所述的提取方法，离心除渣、酸沉除蛋白及碱中和工艺其特征在于：

(a)0.1～2mol/L盐酸调节上清液pH至4.0～4.5后，3000～5000r/min离心10～30min；

(b)0.1～2mol/L氢氧化钠调节上清液pH至7.0。

4.权利要求1所述的多糖分离方法，超滤工艺其特征在于：

超滤压力为0.01～0.1Mpa(例如0.02～0.06MPa，如约0.05MPa)；温度为10～40℃(例如20～30℃，如约25℃)。

5.权利要求1所述的多糖分离方法，酶法结合三氯乙酸(TCA)法除蛋白工艺其特征在于：

(a)碱性蛋白酶法除蛋白：温度40～65℃，pH值7.5～9.0，酶添加量为1％～4.0％w/w，时间0.5～2h。

(b)TCA处理酶解液进一步除蛋白：TCA浓度以0.1％～2％w/w(例如，0.1％，0.5％，1.0％或1.5％w/w)存在；时间以0.5～3h(例如，0.5，1，2或3h)存在；

6.权利要求1所述的多糖分离方法，采用D296型树脂对多糖进行脱色，其特征在于：

上样量为0.5～10ml(例如，2，3，4或5ml)；洗脱液为蒸馏水；洗脱流速为0.1～2ml/min(例如，0.5，1，1.5或2ml/min)；

7.权利要求1所述的多糖纯化方法，采用DEAE Sepharose Fast Flow柱层析法分离葵花籽多糖，其工艺特征在于：

上样量为0.5～10ml(例如，2，3，4或5ml)；洗脱流速为0.1～4ml/min(例如，0.5，1，1.5，2或3ml/min)；以蒸馏水、0.1～0.4mol/LNaCl溶液阶段梯度洗脱；蒸馏水洗脱分离得到DPW组分，0.1～0.4mol/LNaCl溶液洗脱分离得到DPN1组分。

8.权利要求1所述的多糖纯化方法，采用Sepharose CL-6B柱层析法分离葵花籽多糖组分——DPW及DPN1，其工艺特征在于：

上样量为0.1～5ml(例如，0.1，0.5，1或5ml)；洗脱流速为0.1～2ml/min(例如，0.1，0.5，1或2ml/min)；洗脱液为0.1mol/L NaCl溶液；分离得到三个糖组分，其中DPW为单一组分，分子量小于10KD。DPN1含有两个组分，分别为DPN1-S1和DPN1-S2，DPN1-S1分子量约为37KD，DPN1-S2分子量小于10KD。

9.利用前述权利要求的方法获得的三种葵花籽水溶性多糖。