JP7104635B2 - 食用燕の巣抽出物および抽出方法 - Google Patents
食用燕の巣抽出物および抽出方法 Download PDFInfo
- Publication number
- JP7104635B2 JP7104635B2 JP2018567559A JP2018567559A JP7104635B2 JP 7104635 B2 JP7104635 B2 JP 7104635B2 JP 2018567559 A JP2018567559 A JP 2018567559A JP 2018567559 A JP2018567559 A JP 2018567559A JP 7104635 B2 JP7104635 B2 JP 7104635B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- ebn
- extract
- antibody
- cell
- minutes
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Active
Links
Images
Classifications
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K35/00—Medicinal preparations containing materials or reaction products thereof with undetermined constitution
- A61K35/56—Materials from animals other than mammals
- A61K35/57—Birds; Materials from birds, e.g. eggs, feathers, egg white, egg yolk or endothelium corneum gigeriae galli
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
- A61K47/30—Macromolecular organic or inorganic compounds, e.g. inorganic polyphosphates
- A61K47/36—Polysaccharides; Derivatives thereof, e.g. gums, starch, alginate, dextrin, hyaluronic acid, chitosan, inulin, agar or pectin
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P13/00—Drugs for disorders of the urinary system
- A61P13/12—Drugs for disorders of the urinary system of the kidneys
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P17/00—Drugs for dermatological disorders
- A61P17/16—Emollients or protectives, e.g. against radiation
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P19/00—Drugs for skeletal disorders
- A61P19/02—Drugs for skeletal disorders for joint disorders, e.g. arthritis, arthrosis
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P25/00—Drugs for disorders of the nervous system
- A61P25/28—Drugs for disorders of the nervous system for treating neurodegenerative disorders of the central nervous system, e.g. nootropic agents, cognition enhancers, drugs for treating Alzheimer's disease or other forms of dementia
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P27/00—Drugs for disorders of the senses
- A61P27/02—Ophthalmic agents
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P29/00—Non-central analgesic, antipyretic or antiinflammatory agents, e.g. antirheumatic agents; Non-steroidal antiinflammatory drugs [NSAID]
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/06—Antihyperlipidemics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P3/00—Drugs for disorders of the metabolism
- A61P3/08—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis
- A61P3/10—Drugs for disorders of the metabolism for glucose homeostasis for hyperglycaemia, e.g. antidiabetics
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P37/00—Drugs for immunological or allergic disorders
- A61P37/02—Immunomodulators
- A61P37/04—Immunostimulants
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P43/00—Drugs for specific purposes, not provided for in groups A61P1/00-A61P41/00
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P5/00—Drugs for disorders of the endocrine system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61P—SPECIFIC THERAPEUTIC ACTIVITY OF CHEMICAL COMPOUNDS OR MEDICINAL PREPARATIONS
- A61P9/00—Drugs for disorders of the cardiovascular system
-
- A—HUMAN NECESSITIES
- A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
- A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
- A61K2236/00—Isolation or extraction methods of medicinal preparations of undetermined constitution containing material from algae, lichens, fungi or plants, or derivatives thereof, e.g. traditional herbal medicine
- A61K2236/10—Preparation or pretreatment of starting material
- A61K2236/19—Preparation or pretreatment of starting material involving fermentation using yeast, bacteria or both; enzymatic treatment
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Pharmacology & Pharmacy (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Animal Behavior & Ethology (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Public Health (AREA)
- Veterinary Medicine (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
- General Chemical & Material Sciences (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Nuclear Medicine, Radiotherapy & Molecular Imaging (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Diabetes (AREA)
- Epidemiology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Hematology (AREA)
- Obesity (AREA)
- Inorganic Chemistry (AREA)
- Neurosurgery (AREA)
- Neurology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Dermatology (AREA)
- Rheumatology (AREA)
- Endocrinology (AREA)
- Toxicology (AREA)
- Emergency Medicine (AREA)
- Orthopedic Medicine & Surgery (AREA)
- Physical Education & Sports Medicine (AREA)
- Ophthalmology & Optometry (AREA)
- Pain & Pain Management (AREA)
- Heart & Thoracic Surgery (AREA)
- Hospice & Palliative Care (AREA)
- Cardiology (AREA)
- Urology & Nephrology (AREA)
- Psychiatry (AREA)
- Pharmaceuticals Containing Other Organic And Inorganic Compounds (AREA)
- Medicines That Contain Protein Lipid Enzymes And Other Medicines (AREA)
Description
[1]燕の巣抽出物を調製する方法であって、上記抽出物が、食用燕の巣(EBN)から得られた少なくとも1つの分子を含み、上記方法が、
(a)未加工のEBNを洗浄するステップと;
(b)洗浄したEBNをろ過するステップと;
(c)上記EBNから上記分子を抽出するステップと;
(d)上記分子を単離するステップと
を含む方法。
[2]洗浄するステップが、上記EBNを第1の酵素溶液に、室内温度で約5分間曝露し、上記EBNおよび酵素溶液を水にさらに5分間浸漬することを含む、上記[1]に記載の方法。
[3]上記第1の酵素溶液が亜硝酸還元酵素を含む、上記[2]に記載の方法。
[4]上記抽出ステップの前に、上記洗浄したEBNを121℃で約10分間滅菌することをさらに含む、上記[1]から[3]のいずれか一項に記載の方法。
[5]上記分子を抽出するステップが、上記洗浄したEBNを、
(a)抗Nグリカンおよび抗Oグリカンを含む溶液;
(b)抗ヘパラン硫酸、抗コンドロイチン、抗ケラタン、および抗デルマタンを含む溶液;ならびに
(c)抗ロイシンジッパー、抗ヘリックスターンヘリックス、および抗ジンクフィンガーを含む溶液
を含む群から選択される抽出溶液のうちのいずれか1つに曝露することによって行われる、上記[1]から[4]のいずれか一項に記載の方法。
[6]各溶液中に存在する量が、
(a)50%抗Nグリカンおよび50%抗Oグリカン;
(b)25%抗ヘパラン硫酸、25%抗コンドロイチン、25%抗ケラタン、および25%抗デルマタン;ならびに
(c)37%抗ロイシンジッパー、33%抗ヘリックスターンヘリックス、および30%抗ジンクフィンガー
である、上記[5]に記載の方法。
[7]上記抽出ステップが酸存在下で行われる、上記[5]に記載の方法。
[8]抽出が、25℃から37℃の間で約20~120分間行われる、上記[1]から[7]のいずれか一項に記載の方法。
[9]上記分子を単離するステップが、第2の酵素溶液存在下で行われる、上記[1]から[8]のいずれか一項に記載の方法。
[10]上記第2の酵素溶液が、野菜または果物プロテアーゼを含む、上記[9]に記載の方法。
[11]上記第2の酵素溶液の濃度が10μg/mlから100ng/mlの間である、上記[9]に記載の方法。
[12]上記分子を単離する上記ステップが、pH6.5~9.0、45℃で60分間行われる、上記[9]に記載の方法。
[13]混合物を70℃で5分間加熱して、上記第2の酵素溶液中の酵素を不活性化することをさらに含む、上記[9]から[12]のいずれか一項に記載の方法。
[14]抽出混合物を脱水するステップをさらに含む、上記[1]から[13]のいずれか一項に記載の方法。
[15]上記脱水ステップがフリーズドライである、上記[14]に記載の方法。
[16]上記[1]から[15]のいずれか一項に記載の方法から得られた燕の巣抽出物。
[17]上記[16]に記載の抽出物を含む組成物。
[18]マルトデキストリンをさらに含む、上記[17]に記載の組成物。
[19]上記組成物中に存在するマルトデキストリンの量が、30wt%から75wt%の間である、上記[18]に記載の組成物。
[20]医薬品における、上記[16]に記載の抽出物の使用。
[21]状態および/または疾患を治療および/または予防するための医薬の製造における、上記[16]に記載の抽出物の使用。
[22]上記[16]に記載の抽出物および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
本発明の第1の態様において、燕の巣抽出物を調製する方法であって、抽出物が食用燕の巣(EBN)から得られた少なくとも1つの分子を含み、方法が、(a)未加工のEBNを洗浄するステップと;(b)洗浄したEBNをろ過するステップと;(c)EBNから分子を抽出するステップと;(d)分子を単離するステップとを含む方法が提供される。
(a)EBN抽出物1
20%Nグリカン
30%Oグリカン
50%シアル酸結合Ig様レクチン14
(b)EBN抽出物2
70%ジンクフィンガー
15%パールカン
15%Nグリカン
(c)EBN抽出物3
15%Nグリカン
25%ヘリックスターンヘリックス
15%ヒアルロナン
35%デコリン
10%デルマタン
(d)EBN抽出物4
10%デルマタン
15%コンドロイチン
55%ヒアルロナン
20%ルミカン
(e)EBN抽出物5
10%ケラタン
25%シンデカン
35%コンドロイチン
30%ヒアルロナン
(f)EBN抽出物6
35%ロイシンジッパー
30%デコリン
35%ルミカン
(g)EBN抽出物7
25%ヘパラン硫酸
15%ブレビカン
20%ニューロカン
20%バーシカン
20%デコリン
(a)抗Nグリカンおよび抗Oグリカンを含む溶液;
(b)抗ヘパラン硫酸、抗コンドロイチン、抗ケラタン、および抗デルマタンを含む溶液;ならびに
(c)抗ロイシンジッパー、抗ヘリックスターンヘリックス、および抗ジンクフィンガーを含む溶液
を含む群から選択される抽出溶液のうちのいずれか1つに曝露することによって行われる。
(a)50%抗Nグリカンおよび50%抗Oグリカン;
(b)25%抗ヘパラン硫酸、25%抗コンドロイチン、25%抗ケラタン、および25%抗デルマタン;ならびに
(c)37%抗ロイシンジッパー、33%抗ヘリックスターンヘリックス、および30%抗ジンクフィンガー
であってもよい。
(a)組成物1
20%抗Nグリカン(分子量20kDaから1000kDaの間)
30%抗Oグリカン(分子量30kDaから3000kDaの間)
50%抗シアル酸結合Ig様レクチン14(分子量20kDaから700kDaの間);または
(b)組成物2
70%抗ジンクフィンガー(分子量10kDaから200kDaの間)
15%抗パールカン(分子量50kDaから10000kDaの間)
15%抗Nグリカン(分子量20kDaから700kDaの間);または
(c)組成物3
15%抗Nグリカン(分子量20kDaから700kDaの間)
25%抗ヘリックスターンヘリックス(分子量10kDaから300kDaの間)
15%抗ヒアルロナン(分子量100kDaから3000kDaの間)
35%抗デコリン(分子量10kDaから200kDaの間)
10%抗デルマタン(分子量50kDaから500kDaの間);または
(d)組成物4
10%抗デルマタン(分子量50kDaから500kDaの間)
15%抗コンドロイチン(分子量30kDaから700kDaの間)
55%抗ヒアルロナン(分子量100kDaから3000kDaの間)
20%抗ルミカン(分子量20kDaから250kDaの間);または
(e)組成物5
10%抗ケラタン(分子量25kDaから500kDaの間)
25%抗シンデカン(分子量20kDaから100kDaの間)
35%抗コンドロイチン(分子量30kDaから700kDaの間)
30%抗ヒアルロナン(分子量100kDaから3000kDaの間);または
(f)組成物6
35%抗ロイシンジッパー(分子量10kDaから300kDaの間)
30%抗デコリン(分子量10kDaから200kDaの間)
35%抗ルミカン(分子量20kDaから250kDaの間);または
(g)組成物7
25%抗ヘパラン硫酸(分子量30kDaから300kDaの間)
15%抗ブレビカン(分子量10kDaから300kDaの間)
20%抗ニューロカン(分子量20kDaから300kDaの間)
20%抗バーシカン(分子量50kDaから500kDaの間)
20%抗デコリン(分子量10kDaから200kDaの間)
本特有の組成物は、H1N1およびH3N2に関してそれぞれ、最小濃度0.5g/lおよび1g/lで血球凝集を阻害することができるEBN抽出物を提供する。シアル酸のみを含む類似した抽出物は、H1N1およびH3N2に関して、それぞれ最小濃度5g/l~160g/lのみで血球凝集を阻害することができた。
本特有の組成物は、腎細胞成長を、本GO専売EBN抽出物組成物を含まない対照と比較すると、濃度依存的様式で促進するEBN抽出物を提供する。3.3g/lの本組成物存在下で、腎細胞は、コンフルエントな細胞密度に3日目で達し(~5×105個細胞/cm2)、対照よりも早い(4日目)。成長促進は、本特有のEBN抽出物で認められる活性分子の存在と関連し得る。
本抽出物組成物は、in vitroで細胞増殖中のヒト幹細胞増殖における増加を誘発することができるEBN抽出物を提供する。
本組成物は、in vitroで軟骨形成性分化の過程中のヒト幹細胞増殖において統計的に有意な増加を誘発することができるEBN抽出物を提供する。これは、DNA(細胞増殖)において、増加だけではなく統計的に有意な増加も示す最初の研究であるため、新規である。
組成物5
本組成物は、1ペレットあたりのコラーゲンII含量およびコラーゲンII/DNA比率を、主に分化の21日目から28日目で増加させるEBN抽出物を提供する。1ペレットあたりのコラーゲンII含量における増加は、1.25%EBNに関しては分化の7日目から14日目で、ならびに2.5%EBNに関しては21日目から28日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンII/DNA比率における増加は、1.25%EBNを使用した分化の7日目から28日目で最も有意でありかつ最も一貫している。コラーゲンIIは、関節軟骨組織で通常認められる主要なタイプのコラーゲン分子または原線維である。1ペレットあたりのコラーゲンII含量は、in vitroでの幹細胞由来軟骨細胞様細胞の総産生機能(functional output)の指標である。コラーゲンII/DNA比率は、細胞1個あたりのコラーゲンII産生を表し、かつ幹細胞が軟骨細胞様細胞へいかによく分化しているかの機能的指標として使用される。点線は、EBN抽出物が添加されなかったときの、1ペレットあたりのコラーゲンII、およびコラーゲンII/DNA比率を指す。
組成物7
GlcA=β-D-グルクロン酸
IdoA=α-L-イズロン酸
ldoA(2S)=2-O-スルホ-α-L-イズロン酸
GlcNAc=2-デオキシ-2-アセトアミド-α-D-グルコピラノシル
GlcNS=2-デオキシ-2-スルファミド-α-D-グルコピラノシル
GlcNS(6S)=2-デオキシ-2-スルファミド-α-D-グルコピラノシル-6-O-スルフェート
(a)EBNの汚れを落とし、混入物を除去する。
(b)汚れを落としたEBNをすりつぶし、メッシュに通してふるいにかけた。
(c)EBN粉末を水に溶解し、少なくとも1つの抗体を含む溶液で処理した。
(d)抗体および結合分子を分離してもよい。
(e)結合分子を、酸溶液を用いて部分的に加水分解し、高分子量のペプチドを添加することによって結合分子を放出した。
(f)放出された小分子を透析によって単離した。
(g)単離した分画を酵素溶液で処理し、化合物をさらに破壊した。
(h)酵素を変性させ、除去した後に、単離した分画を乾燥し、固体製品を得た。
1.抗N-グリカン
2.抗O-グリカン
3.抗ヘパラン硫酸
4.抗コンドロイチン硫酸
5.抗ケラタン硫酸
6.抗デルマタン硫酸
7.抗ロイシンジッパー
8.抗ヘリックスターンヘリックス
9.抗ジンクフィンガー
10.ヒアルロン酸抗体
1.50%の抗N-グリカンおよび50%の抗O-グリカン
2.25%の抗ヘパラン硫酸、25%の抗コンドロイチン、25%の抗ケラタン、および25%の抗デルマタン
3.37%の抗ロイシンジッパー、33%の抗ターンヘリックスターン、および30%の抗ジンクフィンガー。
1.70%のEBN抽出物製品および30%マルトデキストリン
2.60%のEBN抽出物製品および40%マルトデキストリン
3.50%のEBN抽出物製品および50%マルトデキストリン
4.25%のEBN抽出物製品および75%マルトデキストリン
In vitro細胞アッセイ実験を行い、EBNから単離された製品の潜在的な治療効果を研究し、結果を本明細書でさらに検討した。
材料および方法
1.抽出方法
図1を参照して、重量10~50gのEBN片を酵素溶液で5分間洗浄し、ダニを除去し、溶液を除去した。燕の巣を、亜硝酸還元酵素を含む水性溶液で洗浄し、溶液を除去した。汚れを落としたEBNを70℃で12時間乾燥した。乾燥しかつ汚れを落としたEBNをすりつぶし、メッシュに通してふるいにかけ(600μm孔径)、羽および異物を除去した。すりつぶしたEBNを蒸留水(25g/水1000ml)中に5℃で5時間維持し、次いで、121℃で10分間加熱滅菌した。
マスター細胞バンクから得た129代継代ベロ細胞(ATC CCCL-81)を解凍し、4mM L-グルタミン(Life Technologies、カタログ番号25030149)が補充された無血清培地、OptiPro無血清培地(Life Technologies、カタログ番号12309-019)で増殖させ、作業用細胞バンクを1バイアルあたり2×106個細胞のバイアル20個で得た。ベロ細胞をStemProAccutase(Life Technologies、カタログ番号A11105-01)を使用して4日おきに継代して、細胞分離し、得られた単一の細胞を1.5×104個細胞/cm2の細胞密度で接種した。
SF-EBNの、細胞成長に対する効果を試験するために、ベロ細胞を、3×104個細胞/ウェルで、24ウェル組織培養プレートのOptiPro無血清培地に播種した。播種してから1日後、SF-EBN(33.3g/l)を個別のウェルへ添加し、最終濃度を3.3g/l(10%v/v)、1.65g/l(5%v/v)、0.83g/l(2.5%v/v)、および0.33g/l(1%v/v)とした。細胞成長を4日にわたって毎日モニターした。細胞計数を、Nucleocounter NC-3000(Chemometec、Inc.)を使用し、推奨される手順に従って行った。
2.5×104個細胞/cm2で播種し、培養の2日後にサブコンフルエンスを得たベロ細胞に、インフルエンザA H1N1ウィルス(IVR-116、NIBSCコード06/108)およびH3N2ウィルス(A/Wisconsin/67/2005HGR、NIBSCコード06/112))を0.001~0.01のMOI(感染多重度)で感染させた。インフルエンザウィルスの活性化に使用するためのブタトリプシン(Sigma-Aldrich、カタログ番号T5266、1500BAEE単位/mg)を、脱イオン水および滅菌フィルターを用いて調製し、原液濃度を5mg/mlとした。ウィルス増幅中、トリプシンを、ウィルスを接種してから30分後に添加し、最終濃度を5μg/mlとした。ウィルスを含む培養上澄みを、2~3日後に採取し(80%細胞変性効果(CPE)が観察されたときに)、遠心分離し、細胞残屑を除去した。ウィルス原液(H1N1およびH3N2)を、-80℃で保管した。そのウィルス力価を、以下で述べるような血球凝集および組織培養感染用量(TCID50)アッセイを使用して定量化した。
ウィルス力価を、Chenら(BMC Biotechnol.、2011、11-81)に記載のような血球凝集アッセイおよび組織培養感染用量(TCID50)アッセイを使用して定量化した。血球凝集アッセイに関しては、4%ヒト赤血球(Siemens Healthcare Diagnostics)をダルベッコリン酸緩衝溶液(DPBS、Life Technologies、カタログ番号14190-250)で希釈し、0.75%細胞懸濁液を得た。次いで、希釈した赤血球懸濁液を、2倍連続希釈のウィルスおよび対照試料に添加した。赤血球の完全な血球凝集をもたらすウィルスの最大希釈を、HA滴定終点とみなす。HA力価(HAU/50μl)は完全な血球凝集を含む最後のウェルのウィルス希釈の逆数である(例えば、27の希釈は血球凝集単位(HAU/50μl)128となる)。
血球凝集阻害(HAI)アッセイを、既に記載されているように(Guo et al., 2006, Antiviral Res., 70, 140-146)96ウェルマイクロタイタープレートを使用して行った。Mg2+およびCa2+を含むDPBSを希釈緩衝液として使用した。ヒト赤血球を指標細胞として使用した。ウィルス懸濁液(それぞれDPBS0.05ml中、8HAU/50μlおよびDPBS0.05ml中、16HAU/50μl)を、希釈緩衝液で2倍連続希釈したEBN溶液を含む各ウェルへ添加した。DPBS中の0.75%(v/v)ヒトO型赤血球0.05mlを、プレートへ添加し、4℃で1時間インキュベートした。完全な血球凝集阻害を示す試料の最大希釈をEBN溶液のHAI力価として定義した。
ベロ細胞を、T25フラスコのOptiPro無血清培地で、3×104個細胞/cm2の密度で播種して培養した。細胞培養物が90%培養密度に達したときに、培養物を、インフルエンザウィルスに0.001のMOIで感染させた。次いで、SF-EBNを添加し、最終濃度を2g/l(6.25%v/v)、0.26g/l(0.78%v/v)および0.03g/l(0.10%v/v)とした。2時間後、SF-EBN含有培養培地を除去した。細胞をOptiPro無血清培地で3回洗浄した。ブタトリプシンを添加し、最終濃度を5μg/mlとした。24時間後、培養物上澄みを収集した。SF-EBN抗インフルエンザ効果を、血球凝集およびTCID50アッセイによって検証した。
hMSC(8~9代継代)を、2400~2800個細胞/cm2の密度で、T175cm2細胞培養フラスコまたはNunc(商標)EasyFill(商標)Cell Factory(商標)Systemのいずれかの、最小必須培地α、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(すべてGibco製)からなるMSC成長培地に蒔いた。培地を2~3日おきに交換した。0.25%トリプシン-EDTA(Gibco)を37℃で5分間使用して採取した場合、hMSCは約70%の培養密度で継代された。自動NucleoCounter(登録商標)NC-3000(Chemometec)を用いて生存率および細胞計数アッセイを行った。すべての培養物を、5%CO2加湿インキュベーター(Thermo Scientific)中、37℃で維持した。
hMSCを、1000個細胞/cm2の密度で、Nunclon(商標)Delta Surface24ウェルプレートに蒔いた。hMSCを0日目に播種し、4日間培養した。hMSCは、いずれの成長因子も含まないBTI専売無血清MSC成長培地のみで成長させ、GeneOasis Pte Ltd EBN抽出物を陰性対照として使用し、それは「成長因子不含」として既知であった。10ng/ml PDGF(Peprotech)、5ng/ml TGFβ-1(Peprotech)、および10ng/ml FGFβ(Gibco)が補充されたBTI専売無血清MSC成長培地で成長したhMSCをまた、陰性対照として使用し、また「3成長因子」と称した。10ng/ml PDGF(Peprotech)、5ng/ml TGFβ-1(Peprotech)、1ng/ml EGF(Peprotech)および10ng/ml FGFβ(Gibco)が補充されたBTI専売無血清MSC成長培地で成長したhMSCを、陽性対照として使用し、また「4成長因子」と称した。3成長因子(EGFを除く)が補充され、10%EBN(vol/vol)を含む無血清MSC成長培地で成長した、hMSCを試験し、それを「3成長因子+10%EBN」と称した。10%EBN(vol/vol)を1日目に添加した。細胞計数アッセイを、各条件に関して、自動NucleoCounter(登録商標)NC-3000(Chemometec)を用いて毎日3回行った。すべての培養物を5%CO2加湿インキュベーター(Thermo Scientific)中、37℃で維持した。
hMSCを、透明丸底超低接着96ウェルプレート(Corning)で、軟骨形成性分化用にマイクロマスペレットとして成長させた。ペレットを、1000rpmの遠心分離によって、室温(rt)で5分間、1ウェルあたり1ペレットあたり2×105hMSCを使用して形成した。これらを、DMEM-高グルコース(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、100nΜデキサメタゾン(Sigma)、0.1mM L-アスコルビン酸-2-ホスフェート(Sigma)、1%ITS+1(Sigma)、L-プロリン(Sigma)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を含む軟骨形成性分化培地で培養した。EBN抽出物を含まない軟骨形成性分化培地のみで成長したペレットを陰性対照として使用した。異なる濃度(1.25%、2.5%、5%および10%vol/vol)のEBNを含む軟骨形成性分化培地で成長したペレットの試験を行った。100ng/ml BMP2が補充された軟骨形成性分化培地で成長したペレットを陽性対照として使用した。補充されたまたは補充されていない軟骨形成性培地を2~3日おきに交換した。
ペレット(1時点あたり1条件あたり少なくとも3個)を、リン酸緩衝食塩水(PBS)で1回すすいでから、すぐに-80℃で保管した。解凍後、ペレットを、DNAおよびGAG定量化の場合は0.125mg/mlパパインを用いて65℃で一晩消化するか、コラーゲンII評価の場合は、0.1mg/mlペプシンを用いて4℃で2晩消化し、続いて0.1mg/mlエラスターゼによって4℃で一晩消化するかのいずれかを行った。DNA定量化を、Quant-iT Picogreen dsDNA Assayを使用して行い、GAG測定を、Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay(Biocolor)を使用して行い、かつコラーゲンII定量化をELISAによってII型コラーゲン(Chondrex)に対して行い、すべて製造業者の取扱説明書に従った。すべての蛍光および可視光の読み取りはTecan Infinite M200を用いて行った。
データを、統計ソフトウェアPrism6(GraphPad)を用いて分析した。異なる条件間での多重比較を、通常の一元配置分散分析(ANOVA)を使用し、テューキーの多重比較検定を用いて統計的に比較した。すべての統計的検定に関して、0.05未満のp値を有意とみなした。
hMSCを、第9項で詳述されたような同様の方法で成長させた。hMSCを0日目に播種し、5日間培養した。2つのタイプのEBN抽出物の比較をコンペティターA EBNまたはコンペティターB EBNのいずれかに対して行った。片方のタイプの比較は、10%のコンペティターEBNをGeneOasis EBNに対して、タンパク質含量に関して正規化または対照化することによって比較することであった(すなわち、GeneOasis EBN対照は、各コンペティターのものと同じタンパク質量を有することになる)。測定されたように、10%のコンペティターA EBNは、4.39%のGeneOasis EBNと同等であった。したがって、3成長因子(EGFを除く)が補充され、4.39%GeneOasis EBN(vol/vol)を含むMSC成長培地を試験し、それを「GOA」と称した。3成長因子(EGFを除く)が補充され、10%コンペティターA EBN(vol/vol)を含むMSC成長培地を試験し、それを「3成長因子+10%コンペティターA」と称した。コンペティターBに関しても同様に、10%のコンペティターB EBNは、3.35%のGeneOasis EBNと同等であった。したがって、3成長因子(EGFを除く)が補充され、3.35%GeneOasis EBN(vol/vol)を含むMSC成長培地を試験し、それを「GOB」と称した。3成長因子(EGFを除く)が補充され、10%コンペティターB EBN(vol/vol)を含むMSC成長培地を試験し、それを「3成長因子+10%コンペティターB」と称した。もう片方のタイプの比較は、10%のコンペティターEBNをGeneOasis EBNと、体積に関して正規化または対照化することによって比較することであった(すなわち、10%GeneOasis EBNを、10%のコンペティターEBNと体積で比較することになる)。関連実験を実施し、かつデータ分析する間は、研究者にはコンペティターAおよびBの識別について知らせなかった。
SF-EBNの、細胞およびインフルエンザウィルス複製に対する効果を試験する前に、以下の表1で示すように、標準としてウシ血清を用いた可溶性タンパク質アッセイを行った。これにより、さまざまな原料とEBN抽出方法との間のその後の比較に関する基準点が与えられることになる。
4つのSF-EBN濃度(3.3g/l(10%v/v)、1.65g/l(5%v/v)、0.83g/l(2.5%v/v)、および0.33g/l(1%v/v))の、組織培養プレートのベロ細胞成長に対するそれらの効果に関して試験を行った。図2で示すように、SF-EBNは、SF-EBNを含まない対照と比較したときにベロ細胞成長を濃度依存的様式で促進した。3.3g/l SF-EBNの存在下で、ベロ細胞は、3日目にコンフルエントな細胞密度(約5×l05個細胞/cm2)に達し、対照よりも早かった(4日目)。EGFが、ベロ細胞が成長に必要とする既知の必須成長因子である場合、成長促進は、EBN抽出物に認められるEGF様分子の存在と関連し得る。
SF-EBNの、インフルエンザウィルスの表面に位置し、赤血球と相互作用する血球凝集素分子の能力に対する阻害効果を判定するために、インフルエンザウィルスの濃度を定量化するために通常使用されるアッセイである、血球凝集阻害(HAI)アッセイを行った。16および8HAU/50μlの2つのウィルス濃度を調製した(8HAU/50μlは、WHO検査手順(WHO laboratory procedure)に記載されているインフルエンザウィルスの血清学的検出のための推奨濃度である)。図3で示すように、2倍連続希釈のSF-EBN(縦列2~12)をヒト赤血球と混合してから、インフルエンザウィルスを、16および8ΗΑU/50μl(上述の)の2つの濃度で96ウェルプレートに添加した。インフルエンザウィルスと結合しない赤血球はウェルの底部に沈み、赤色ボタン様物質が形成されることになる。ウィルスが赤血球へ結合する場合、格子が形成された。血球凝集は、試験された2つのインフルエンザウィルス濃度に関しては27倍希釈まで観察されなかった。その希釈に対応するSF-EBN濃度は0.5g/lである。これは、この濃度0.5g/l(低くはないが)で、EBNが血球凝集を阻止することを示す。実験は、図4で示すように、インフルエンザH3N2を使用して繰り返した。高SF-EBN濃度の2.1g/Lおよび1.0g/Lがそれぞれ、濃度16および8HAU/50μlのH3N2ウィルスの存在下で、血球凝集を阻止するのに必要であった。これらの結果は、EBN抽出物はウィルス性血球凝集素分子と競合し(ヒト赤血球の血球凝集によって測定される)、インフルエンザウィルス感染力を低下させることができる(特異的抗血清の活性と同様である)ことを実証する。
2つの市販されているEBN溶液(コンペティターAおよびB)を抗ウィルス活性判定用に選択した。以下の表3で示すように、これらの市販のEBN溶液は、SF-EBNよりも低い可溶性タンパク質濃度およびオスモル濃度を示した。
1.材料および方法
1.1ヒト神経前駆物質の誘導および維持
ヒト神経前駆物質(hNPC)を、微小担体懸濁培養物を使用することによって、ヒト胚幹細胞株(hESC)HES-3から得た。その後、次いでhNPCをgeltrex被覆プレートで成長させ、EGF(20ng/ml、Peprotech)およびFGF(20ng/ml、Peprotech)が補充されたNPC培地(Neurobasal培地、1×NEAA、1×ペニシリン-ストレプトマイシン、2mM L-グルタミン、1×N2、ビタミンA不含1×B27、すべてLife Technologies製)を加えた。
hNPCを、2000個細胞/ウェルの密度で、geltrex被覆48ウェルプレートに蒔き、1週間成長させた。hNPCに、成長因子(EGF、FGF)およびGeneOasis Pte Ltd EBN抽出物の異なる組合せが補充されたNPC培地を加えた。次いで、細胞を溶解して、すべてのかつ生存可能な細胞を、DAPIを用いた核計数方法で、NucleoCounter NC3000(Chemometec)によって、製造業者の取扱説明書に従って計数した。
hNPCを、150,000個細胞/ウェルの密度で、geltrex被覆6ウェルプレートに蒔き、1週間および3週間成長させた。hNPCに、成長因子(EGF、FGF)およびGeneOasis Pte Ltd EBN抽出物の異なる組合せが補充されたNPC培地を加えた。培養期間中、細胞が80%の培養密度に達したときに、hNPCを継代した。タイムポイント(1週目および3週目)で、Tryple(Life Technologies)を用いて、hNPCを単一細胞に解離した。その後、細胞を固定し、透過性にし、細胞増殖用の一次抗体、Anti-Ki-67(1:200、BD Bioscience)および神経分化評価用の抗チューブリンβ3(1:1000、Covance)とインキュベートした。Alexa Fluor488(登録商標)ヤギ抗マウス(Life Technologies)を二次抗体として使用した。すべてのインキュベートを4℃で20分間行った。蛍光測定を、フローサイトメーター(GUAVA、Millipore)を使用して行った。FlowJoソフトウェアを使用して、フローサイトメトリーデータを分析した。
本研究において、EBN抽出物が、ヒト胚幹細胞(hESC)由来のhNPCの増殖を維持できるかどうかを調べた。図10で示すように、FGF-2およびEGFの存在下で培養されたhNPCは、7日後に最も高い細胞収率を示した。成長因子FGF-2と組み合わせたEBN抽出物は、FGF-2+EGFおよびFGF-2単独の条件でのものに匹敵する細胞成長プロファイルに達した。FGF-2を含まないEBNを添加すると、より低い細胞成長となっている。結果より、EBN抽出物は、hNPC増殖に関して最も重要な成長因子であるFGF2の代わりにはなれないことが示唆された。一方、EBNは、EBN抽出物の無血清培地におけるヒト間葉幹細胞の増殖に対する効果を記載した報告で示されているEGF様活性を含んでいたが、FGF-2の存在下、hNPCの短期間の増殖においてEBN抽出物の有益な効果は観察されなかった。
1.2.1.hMSC細胞培養
hMSC(8~9代継代)を、2400~2800個細胞/cm2の密度で、T175cm2細胞培養フラスコまたはNunc(商標)EasyFill(商標)Cell Factory(商標)Systemのいずれかの、最小必須培地α、10%ウシ胎仔血清(FBS)および1%ペニシリン-ストレプトマイシン(すべてGibco製)からなるMSC成長培地に蒔いた。培地を2~3日おきに交換した。0.25%トリプシン-EDTA(Gibco)を37℃で5分間使用して採取した場合、hMSCは約70%培養密度で継代された。自動NucleoCounter(登録商標)NC-3000(Chemometec)を用いて生存率および細胞計数アッセイを行った。すべての培養物を5%CO2加湿インキュベーター(Thermo Scientific)中、37℃で維持した。ウェルプレート設計を示す以下の表を参照されたい。
hMSCを、1000個細胞/cm2の密度で、Nunclon(商標)Delta Surface24ウェルプレートに蒔いた。hMSCを0日目に播種し、4日間培養した。hMSCは、いずれの成長因子も含まないBTI専売無血清MSC成長培地のみで成長させ、GeneOasis Pte Ltd EBN抽出物を陰性対照として使用し、それは「成長因子不含」として既知であった。10ng/ml PDGF(Peprotech)、5ng/ml TGFβ-1(Peprotech)、および10ng/ml FGFβ(Gibco)が補充されたBTI専売無血清MSC成長培地で成長したhMSCをまた、陰性対照として使用し、また「3成長因子」と称した。10ng/ml PDGF(Peprotech)、5ng/ml TGFβ-1(Peprotech)、1ng/ml EGF(Peprotech)および10ng/ml FGFβ(Gibco)が補充されたBTI専売無血清MSC成長培地で成長したhMSCを、陽性対照として使用し、また「4成長因子」と称した。3成長因子(EGFを除く)が補充され、10%EBN(vol/vol)を含む無血清MSC成長培地で成長したhMSCを試験し、それを「3成長因子+10%EBN」と称した。10%EBN(vol/vol)を1日目に添加した。細胞計数アッセイを、各条件に関して、自動NucleoCounter(登録商標)NC-3000(Chemometec)を用いて毎日3回行った。すべての培養物を5%CO2加湿インキュベーター(Thermo Scientific)中、37℃で維持した。
hMSCを、透明丸底超低接着96ウェルプレート(Corning)で、軟骨形成性分化用にマイクロマスペレットとして成長させた。ペレットを、1000rpmの遠心分離によって、室温(rtm)で5分間、1ウェルあたり1ペレットあたり2×105hMSCを使用して形成した。これらを、DMEM-高グルコース(Gibco)、1mMピルビン酸ナトリウム(Gibco)、100nΜデキサメタゾン(Sigma)、0.1mM L-アスコルビン酸-2-ホスフェート(Sigma)、1%ITS+1(Sigma)、L-プロリン(Sigma)および1%ペニシリン/ストレプトマイシン(Gibco)を含む軟骨形成性分化培地で培養した。本発明の抽出物を含まない軟骨形成性分化培地のみで成長したペレットを陰性対照として使用した。異なる濃度(1.25%、2.5%、5%および10%vol/vol)のEBNを含む軟骨形成性分化培地で成長したペレットの試験を行った。100ng/ml BMP2が補充された軟骨形成性分化培地で成長したペレットを陽性対照として使用した。補充されたまたは補充されていない軟骨形成性培地を2~3日おきに交換した。
ペレット(1時点あたり1条件あたり少なくとも3個)を、リン酸緩衝食塩水(PBS)で1回すすいでから、すぐに-80℃で保管した。解凍後、ペレットを、DNAおよびGAG定量化の場合は0.125mg/mlパパインを用いて65℃で一晩消化するか、コラーゲンII評価の場合は、0.1mg/mlペプシンを用いて4℃で2晩消化し、続いて0.1mg/mlエラスターゼによって4℃で一晩消化するかのいずれかを行った。DNA定量化を、Quant-iT Picogreen dsDNA Assayを使用して行い、GAG測定を、Blyscan Sulfated Glycosaminoglycan Assay(Biocolor)を使用して行い、かつコラーゲンII定量化をELISAによってII型コラーゲン(Chondrex)に対して行い、すべて製造業者の取扱説明書に従った。すべての蛍光および可視光の読み取りはTecan Infinite M200を用いて行った。
1.2.5.統計的分析
hMSCを、1.2.2.で詳述されたような同様の方法で成長させた。hMSCを0日目に播種し、5日間培養した。2つのタイプの本EBN抽出物の比較をコンペティターA EBNまたはコンペティターB EBNのいずれかに対して行った。片方のタイプの比較は、10%のコンペティターEBNを本EBN抽出物に対して、タンパク質含量に関して正規化または対照化することによって比較することであった(すなわち本EBN抽出物対照は、各コンペティターのものと同じタンパク質量を有することになる)。測定されたように、10%のコンペティターA EBNは、4.39%の本EBN抽出物と同等である。したがって、3成長因子(EGFを除く)が補充され、4.39%GeneOasis EBN(vol/vol)を含むMSC成長培地を試験し、それを「GOA」と称した。3成長因子(EGFを除く)が補充され、10%コンペティターA EBN(vol/vol)を含むMSC成長培地を試験し、それを「3成長因子+10%コンペティターA」と称した。
本EBN抽出物は、図13~24で示すように、in vitroで細胞増殖中のヒト幹細胞増殖における増加を誘発することができる。
Claims (20)
- 燕の巣抽出物を調製する方法であって、前記抽出物が、食用燕の巣(EBN)から得られた少なくとも1つの分子を含み、前記方法が、
(a)未加工のEBNを洗浄するステップと;
(b)洗浄したEBNをろ過するステップと;
(c)前記EBNから前記分子を抽出するステップと
(d)前記分子を単離するステップと
を含み、
前記分子を抽出するステップが、前記ろ過したEBNを、
(i)抗Nグリカン抗体および抗Oグリカン抗体を含む溶液;
(ii)抗ヘパラン硫酸抗体、抗コンドロイチン抗体、抗ケラタン抗体、および抗デルマタン抗体を含む溶液;ならびに
(iii)抗ロイシンジッパー抗体、抗ヘリックスターンヘリックス抗体、および抗ジンクフィンガー抗体を含む溶液
からなる群から選択される抽出溶液のいずれか1つに曝露することによって行われ、
前記分子を単離するステップが、第2の酵素溶液存在下で行われる、方法。 - 洗浄するステップが、前記EBNを第1の酵素溶液に、室内温度で5分間曝露し、前記EBNおよび酵素溶液を水にさらに5分間浸漬することを含む、請求項1に記載の方法。
- 前記第1の酵素溶液が亜硝酸還元酵素を含む、請求項2に記載の方法。
- 前記抽出ステップの前に、前記洗浄したEBNを121℃で10分間滅菌することをさらに含む、請求項1から3のいずれか一項に記載の方法。
- 各溶液中に存在する量が、
(a)50%抗Nグリカン抗体および50%抗Oグリカン抗体;
(b)25%抗ヘパラン硫酸抗体、25%抗コンドロイチン抗体、25%抗ケラタン抗体、および25%抗デルマタン抗体;ならびに
(c)37%抗ロイシンジッパー抗体、33%抗ヘリックスターンヘリックス抗体、および30%抗ジンクフィンガー抗体
である、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。 - 前記抽出ステップが酸存在下で行われる、請求項1から4のいずれか一項に記載の方法。
- 抽出が、25℃から37℃の間で20~120分間行われる、請求項1から6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の酵素溶液が、野菜または果物プロテアーゼを含む、請求項1から7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記第2の酵素溶液の濃度が10μg/mlから100ng/mlの間である、請求項1から8のいずれか一項に記載の方法。
- 前記分子を単離する前記ステップが、pH6.5~9.0、45℃で60分間行われる、請求項1から9のいずれか一項に記載の方法。
- 混合物を70℃で5分間加熱して、前記第2の酵素溶液中の酵素を不活性化することをさらに含む、請求項1から10のいずれか一項に記載の方法。
- ステップ(c)で抽出した生成物を脱水するステップをさらに含む、請求項1から11のいずれか一項に記載の方法。
- 前記脱水ステップがフリーズドライである、請求項12に記載の方法。
- 請求項1から13のいずれか一項に記載の方法から得られた燕の巣抽出物。
- 請求項14に記載の抽出物を含む組成物。
- マルトデキストリンをさらに含む、請求項15に記載の組成物。
- 前記組成物中に存在するマルトデキストリンの量が、30wt%から75wt%の間である、請求項16に記載の組成物。
- 医薬品の製造における、請求項14に記載の抽出物の使用。
- 状態および/または疾患を治療および/または予防するための医薬の製造における、請求項14に記載の抽出物の使用。
- 請求項14に記載の抽出物および薬学的に許容される担体、賦形剤または希釈剤を含む医薬組成物。
Applications Claiming Priority (3)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
SG10201601905R | 2016-03-11 | ||
SG10201601905RA SG10201601905RA (en) | 2016-03-11 | 2016-03-11 | Extract And Method of Extraction |
PCT/SG2017/050117 WO2017155471A1 (en) | 2016-03-11 | 2017-03-10 | Edible bird's nest extract and method of extraction |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2019511571A JP2019511571A (ja) | 2019-04-25 |
JP7104635B2 true JP7104635B2 (ja) | 2022-07-21 |
Family
ID=59789764
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2018567559A Active JP7104635B2 (ja) | 2016-03-11 | 2017-03-10 | 食用燕の巣抽出物および抽出方法 |
Country Status (11)
Country | Link |
---|---|
US (2) | US10918674B2 (ja) |
JP (1) | JP7104635B2 (ja) |
KR (1) | KR102456015B1 (ja) |
CN (1) | CN109069546B (ja) |
AU (1) | AU2017230150B2 (ja) |
CA (1) | CA3017336A1 (ja) |
MY (1) | MY189662A (ja) |
NZ (1) | NZ747051A (ja) |
SG (2) | SG10201601905RA (ja) |
TW (1) | TWI713708B (ja) |
WO (1) | WO2017155471A1 (ja) |
Families Citing this family (7)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
SG10201601905RA (en) * | 2016-03-11 | 2017-10-30 | Kah Meng Lim | Extract And Method of Extraction |
CN109557228A (zh) * | 2017-12-19 | 2019-04-02 | 中国检验检疫科学研究院 | 一种利用特征标记肽段鉴别燕窝及其掺假物的方法 |
KR102036282B1 (ko) * | 2017-12-29 | 2019-11-29 | (주)프레쉬벨 | 신규한 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 DU.LAB.H01를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물 및 이의 제조방법 |
SG10201802979VA (en) * | 2018-04-10 | 2019-11-28 | Kah Meng Lim | Immunological extract and method of production |
CN109596753B (zh) * | 2019-02-15 | 2021-06-29 | 厦门市仙岳医院 | 一种基于透析袋净化技术检测燕窝中亚硝酸盐的方法 |
CN110468176A (zh) * | 2019-09-02 | 2019-11-19 | 佛山科学技术学院 | 一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法 |
TWI794923B (zh) * | 2021-08-09 | 2023-03-01 | 鐘介宏 | 燕窩酸快速檢測方法 |
Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102362637A (zh) | 2011-09-30 | 2012-02-29 | 邓毛程 | 利用微生物活菌悬液和/或粗酶液去除燕窝中亚硝酸盐的方法与应用 |
CN102621329A (zh) | 2012-03-16 | 2012-08-01 | 深圳市计量质量检测研究院 | 燕窝酶联免疫试剂盒及其检测方法 |
CN104498572A (zh) | 2014-12-05 | 2015-04-08 | 燕之初颜如燕(厦门)生物科技有限公司 | 燕窝复合酶解加工工艺 |
Family Cites Families (16)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US4071408A (en) * | 1976-11-01 | 1978-01-31 | Research Corporation | Neuraminidase |
JPH09301819A (ja) * | 1996-05-09 | 1997-11-25 | Nippon High Potsukusu:Kk | 燕窩抽出物を含む化粧料 |
GB0307989D0 (en) * | 2003-04-07 | 2003-05-14 | Mcewen Lab Ltd | Therapeutic composition |
CN101284017B (zh) * | 2008-05-27 | 2010-08-18 | 浙江大学 | 利用酶解与膜滤耦合技术连续制备窄分子量分布燕窝提取物的方法 |
CN101597598A (zh) | 2009-07-21 | 2009-12-09 | 上海应用技术学院 | 亚硝酸盐还原酶的制备方法及其酶制品 |
KR101257381B1 (ko) * | 2010-04-20 | 2013-04-23 | 스킨큐어(주) | 제비집추출물을 유효성분으로 포함하는 피부 상태개선용 조성물 |
EP2907395B1 (en) * | 2012-10-12 | 2018-12-12 | University of The Ryukyus | Methods for manufacturing substance containing nobiletin and tangeretin derived from citrus fruits |
CN103815210B (zh) * | 2012-11-16 | 2016-12-21 | 香港科技大学 | 抑制燕窝中亚硝酸根或亚硝酸盐产生的方法 |
CN103479670B (zh) * | 2013-08-30 | 2015-10-14 | 香港科技大学 | 燕窝提取液及其制备方法和应用 |
TWI516212B (zh) * | 2014-01-17 | 2016-01-11 | 金利食安科技股份有限公司 | 結合壓力與酵素萃取燕窩之方法 |
CN104072544B (zh) * | 2014-06-30 | 2016-08-24 | 江苏布诺堂健康生物科技有限公司 | 一种结晶方式从燕窝中提取唾液酸的方法 |
CN106235303A (zh) * | 2015-06-03 | 2016-12-21 | 莫智文 | 用于生产可食用的燕窝提取物的酸基酶促方法 |
CN104906555A (zh) * | 2015-07-09 | 2015-09-16 | 广州赛莱拉干细胞科技股份有限公司 | 一种燕窝提取物的制备方法、制得的燕窝提取物及其应用 |
CN105166911B (zh) * | 2015-10-16 | 2017-09-22 | 厦门燕安居食品有限公司 | 一种燕窝的高效纯净方法 |
SG10201601905RA (en) * | 2016-03-11 | 2017-10-30 | Kah Meng Lim | Extract And Method of Extraction |
SG10201802979VA (en) * | 2018-04-10 | 2019-11-28 | Kah Meng Lim | Immunological extract and method of production |
-
2016
- 2016-03-11 SG SG10201601905RA patent/SG10201601905RA/en unknown
-
2017
- 2017-03-10 JP JP2018567559A patent/JP7104635B2/ja active Active
- 2017-03-10 CN CN201780024860.0A patent/CN109069546B/zh active Active
- 2017-03-10 AU AU2017230150A patent/AU2017230150B2/en active Active
- 2017-03-10 SG SG11201807669VA patent/SG11201807669VA/en unknown
- 2017-03-10 US US16/084,076 patent/US10918674B2/en active Active
- 2017-03-10 CA CA3017336A patent/CA3017336A1/en active Pending
- 2017-03-10 NZ NZ747051A patent/NZ747051A/en unknown
- 2017-03-10 WO PCT/SG2017/050117 patent/WO2017155471A1/en active Application Filing
- 2017-03-10 TW TW106108069A patent/TWI713708B/zh active
- 2017-03-10 MY MYPI2018703206A patent/MY189662A/en unknown
- 2017-03-10 KR KR1020187029402A patent/KR102456015B1/ko active IP Right Grant
-
2021
- 2021-01-08 US US17/145,046 patent/US11672833B2/en active Active
Patent Citations (3)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
CN102362637A (zh) | 2011-09-30 | 2012-02-29 | 邓毛程 | 利用微生物活菌悬液和/或粗酶液去除燕窝中亚硝酸盐的方法与应用 |
CN102621329A (zh) | 2012-03-16 | 2012-08-01 | 深圳市计量质量检测研究院 | 燕窝酶联免疫试剂盒及其检测方法 |
CN104498572A (zh) | 2014-12-05 | 2015-04-08 | 燕之初颜如燕(厦门)生物科技有限公司 | 燕窝复合酶解加工工艺 |
Non-Patent Citations (2)
Title |
---|
Evidence-Based Complementary and Alternative Medicine,2012年,Vol. 2012, Article ID 797520,p. 1-11 |
Preliminary study on the enzyme digestion method for edible bird nest for invitro bioassay,Universiti Putra Malaysia,2016年03月03日,p.1-3,http://www.dvs.gov.my/dvs/resources/user_1/DVS%20pdf/Aneka%20Haiwan/poster%20papers/28_Careena_UPM.pdf |
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
WO2017155471A1 (en) | 2017-09-14 |
US11672833B2 (en) | 2023-06-13 |
SG11201807669VA (en) | 2018-10-30 |
CA3017336A1 (en) | 2017-09-14 |
AU2017230150B2 (en) | 2022-07-14 |
KR102456015B1 (ko) | 2022-10-18 |
NZ747051A (en) | 2022-08-26 |
TW201800018A (zh) | 2018-01-01 |
SG10201601905RA (en) | 2017-10-30 |
CN109069546B (zh) | 2022-05-06 |
US20210137996A1 (en) | 2021-05-13 |
AU2017230150A1 (en) | 2018-10-25 |
US20200113947A1 (en) | 2020-04-16 |
MY189662A (en) | 2022-02-23 |
KR20180128005A (ko) | 2018-11-30 |
JP2019511571A (ja) | 2019-04-25 |
US10918674B2 (en) | 2021-02-16 |
TWI713708B (zh) | 2020-12-21 |
CN109069546A (zh) | 2018-12-21 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
JP7104635B2 (ja) | 食用燕の巣抽出物および抽出方法 | |
de Jesus Raposo et al. | Bioactivity and applications of polysaccharides from marine microalgae | |
Yang et al. | A specific peptide with immunomodulatory activity from Pseudostellaria heterophylla and the action mechanism | |
Yuan et al. | Evaluation of antioxidant and immune activity of Phellinus ribis glucan in mice | |
KR100962334B1 (ko) | 울금으로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제 | |
JP5154964B2 (ja) | ローヤルゼリー分解酵素含有物 | |
CN104250285A (zh) | 一种大黄鱼鱼肉抗氧化肽及其制备方法和用途 | |
Abula et al. | Screening on the immune-enhancing active site of Siberian solomonseal rhizome polysaccharide | |
Guo et al. | Immunoregulatory effects of Taishan Pinus massoniana pollen polysaccharide on chicks co-infected with avian leukosis virus and Bordetella avium early in ovo | |
MX2010007043A (es) | Medios para cultivo de celulas de mamiferos que comprenden sobrenadante de etapas del fraccionamiento de cohn y uso de los mismos. | |
CN102438632A (zh) | 新颖的毛头鬼伞和黄金银耳蘑菇菌株及其产物和提取物以及包含它们的组合物 | |
JP6360357B2 (ja) | 脂肪細胞形成抑制方法 | |
JP2023026528A (ja) | シアノバクテリア抽出物、その調製方法と利用方法 | |
Kazemi et al. | Evaluation the effect of royal jelly on the growth of two members of gut microbiota; Bacteroides fragillis and Bacteroides thetaiotaomicron. | |
JP2021521276A (ja) | 免疫学的抽出物及び製造方法 | |
Victor et al. | Comparative study of peritoneal macrophage functions in mice receiving lethal and non-lethal doses of LPS | |
JP2014105202A (ja) | 免疫賦活剤 | |
Li et al. | Eggstraordinary health: exploring avian egg proteins and peptides in boosting immunity and health maintenance | |
KR100974080B1 (ko) | 열처리를 이용한 태반 추출물의 제조 방법 | |
JP6434525B2 (ja) | 綱赤血球増殖因子並びにその調製方法及び使用 | |
JP6075063B2 (ja) | 線維芽細胞増殖促進剤 | |
JP6546316B1 (ja) | まつ毛増殖作用及び育毛作用を呈するポリフェノール誘導体 | |
KR20230146695A (ko) | 인플루엔자 바이러스 억제용 조성물 | |
CN116687959A (zh) | 一种硫酸软骨素生物多胺复合物、其制备方法及用途 | |
US20170266252A1 (en) | Glycine max constructs, soy protein sequences, and methods of treating health conditions using the same |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20200115 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210105 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20210330 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20210603 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20210824 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20211122 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20220118 |
|
A521 | Request for written amendment filed |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20220127 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20220510 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20220608 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20220708 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Ref document number: 7104635 Country of ref document: JP Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |