KR102036282B1 - 신규한 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 DU.LAB.H01를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물 및 이의 제조방법 - Google Patents

신규한 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 DU.LAB.H01를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물 및 이의 제조방법 Download PDF

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Abstract

(1) 바다제비집 분말에 물을 가하여 분산 및 팽윤하고 열처리 및 냉각하여 바다제비집 분산액을 준비하고, 상기 준비한 바다제비집 분산액에 플라보르자임 500 MG(Flavourzyme 500 MG)를 사용하여 가수분해하는 단계;
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 바다제비집 효소 분해물에 홍삼액과 바나나 농축액을 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 바다제비집 효소 분해물-홍삼 복합액(이하 '복합액'으로 칭함)을 준비하는 단계; 및
(3) 상기 (2)단계의 준비한 복합액에 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 유리 시알산(sialic acid), 진세노사이드 Rg3 및 컴파운드 K(compound K) 함량이 증진된 바다제비집-홍삼 복합 발효물(이하 '복합 발효물' 로 칭함)의 제조방법 및 상기 방법으로 제조된 유리 시알산(sialic acid), 진세노사이드 Rg3 및 컴파운드 K(compound K) 함량이 증진된 바다제비집-홍삼 복합 발효물에 관한 것이다.

Description

신규한 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 DU.LAB.H01를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물 및 이의 제조방법{Complex Fermentation Composition of Sea Swallow Bird's Nest Enzyme Hydrolysates and Red Ginseng using Novel Lactobacillus plantarum strain DU.LAB.H01 and Manufacturing Method Thereof}
본 발명은 바다 제비집을 적절한 효소의 분해조건에 의하여 제비집 유효성분인 유리 시알산 함량이 증대된 효소분해물을 조제하여 이들을 홍삼액과 혼합하고 본 발명자들이 분리한 신규한 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum)을 이용하여 이들 복합액을 최적 발효조건으로 발효하여 제비집의 유리 시알산과 홍삼내 미량 존재하는 진세노사이드 Rg3과 컴파운드 K의 함량을 증대시키는 제조방법과 상기방법으로 제조된 발효물을 함유하는 면역활성 증강 복합 발효물에 관한 것이다.
금사연(Collocalia spp)은 동아시아, 히말라야 산맥 등에 분포하는 바다제비로써 해안절벽이나 동굴에 서식하는데 이 바다제비의 둥지는 흔히 식용 가능한 '제비집(bird's nest)'으로 알려져 있고, 주로 번식기에 수컷제비의 침으로 만들어진다고 알려져 있다.
옛 문헌인 본초강목에서는 '제비집이 허한 기를 보한다'고 하였고, 고관들의 명품요리를 집대성한 홍루몽에서도 '기침을 멈추고 기를 보하며 피부를 맑게 해주는 식품'이라고 묘사하고, 영양과 교질단백질이 풍부하고 강장효과가 크다고 하였다. 또한 본초강목습유에서는 '피부를 윤택하게 하며 혈액에 유익해서 생기를 나게 하고 가래를 없애고 천식을 조절하며, 기관지염이나 기침에 특히 효과적인 것'으로 기록되어 있다. 또한 싱가포르에서는 입원치료중인 과민성 어린이들에게 유도식품으로 사용된다고 보고되었다.
바다제비집은 대부분 7~20g이고 35일 정도를 거쳐 짓는데, 교질성(glutinous)의 물질로서 바다제비가 번식기에 타액을 실 모양으로 길게 뽑아 단단하게 만든 길이 약 6cm, 폭 약 4cm의 반원형의 새 둥우리로 식용이 가능하다. 바다제비집은 보통 물에 불려 사용하고 물에 불리면 약 20배로 불어나는데, 인공 사육한 것은 우뭇가사리나 한천 같은 것으로 되어있어 쉽게 구별되며, 오래 보존해도 벌레가 끼거나 곰팡이가 슬지 않고 형태는 수세미 같은 망상으로 되어있다.
바다제비집에는 다량의 단백질, 아미노산, 당, 미네랄 및 항산화물질이 함유되어 있는 것으로 알려져있다. 제비집의 성분은 해초와 생선뼈를 기반으로 해서 침으로 만들어지는 교질성 단백질이고 자연상태의 제비집은 물이나 온수에 잘 녹지 않으며, 20시간 침윤시킨 제비집 물 추출물 중의 단백질 함량은 0%이며 유리 시알산(sialic acid)이 약 0.2% 정도 함유되어 있는 것으로 알려져 있다.
제비집 고형분 중 약 10%를 차지하는 시알산은 뉴라믹산(neuraminic acid)의 N-아실 및 O-아실유도체의 총칭으로 인체에는 N-아세틸 뉴라믹산(N-acetyl neuraminic acid)이 가장 대표 물질로 존재하며 뮤코다당, 당단백질 및 당지질의 구성성분으로 세포표면의 신호전달수용체로 작용하기도 하며, 세포표면이나 당단백질의 당쇄는 말단의 시알산의 유무로 생리활성이 크게 변화할 수도 있고, 상악동 암이나 멜라노마에서 혈청 중 시알산의 농도의 현저한 증가를 보이며, 관절 류마티스와 폐결핵의 활동기에서도 증가하지만 간경변에서는 감소하는 특성이 있다고 한다.
제비집내 시알산은 세포내 영양과 보습 및 수분의 함수를 돕고 비타민 C 및 E 함량이 높으며 알부틴과 교질 단백질 등을 함유하기 때문에 음주로 인한 세포의 기능보호 및 손상된 간세포의 회복에 도움을 주는 물질로 알려져 있다.
또한 시알산은 인플루엔자 바이러스에 의한 혈구응집 작용을 저해한다고 알려져 있는데 특히 사람의 유아기나 신생아 때 섭취하는 시알산은 장내 병원균을 억제하고 인체의 면역작용을 한다고 보고되었다. 이 중 N-그라일코일뉴라믹산 (N-glycolylneuraminic acid)이 가장 중요한데, 모유수유 중에 신생아에게 N-그라일코일뉴라믹산의 섭취가 원활히 이루어지지 않으면 각종 질병에 노출된다고 보고되었다.
또한 제비집은 상피세포 성장인자(epidermal growth factor: EGF)와 유사 작용과 인플루엔자 바이러스의 감염억제 효능이 있다고 보고되어 있다. 또한 바다 제비집 추출물의 효능, 효과로는 항바이러스 작용, 미백효과 및 인플루엔자 바이러스에 대한 저해효과, 세포재생 촉진 및 면역력 증강 등이 보고되어 있다.
홍삼은 인삼의 재배 적지에서 생산된 좋은 품질의 6년근 수삼을 엄선하여 껍질을 벗기지 않은 상태로 장시간 증기로 쪄서 건조시킨 담황갈색 또는 담적갈색을 띄는 인삼가공품을 일컫는다.
즉, 밭에서 캔 수삼은 우선 크기와 모양 등을 따져 1~5등급으로 분류하고 수세 후, 찌기와 건조를 반복하기를 거쳐 홍삼으로 변화시킨다. 홍삼은 인삼과 더불어 우리나라를 비롯한 동양에서 보혈강장 및 불로장생의 영약으로 널리 이용되고 있다. 홍삼은 예부터 한방에서 널리 사용되어진 약용식물로서 사포닌, 관련 화합물과 기타 유용성분의 효능이 과학적으로 다수 입증된 원료이다. 홍삼의 주성분으로는 사포닌(saponin), 각종 정유성분, 폴리아세틸렌 (polyacetylene), 폴리페놀(polyphenol), 알칼로이드(alkaloid)등이 함유 되어 있는 것으로 알려져 있다. 인삼과 홍삼의 대표적인 유용성분인 사포닌의 구성성분인 진세노사이드(gensenoside)는 현재 약 38종이 알려져 있다. 그중 홍삼의 주요 진세노사이드인 Rb1, Rb2, Rc, Re, Rg1이 전체의 80%이상을 차지하고 주로 배당체가 생체에 비특이적으로 작용하고 단백질과 핵산의 합성을 촉진시키며 조혈작용, 간기능회복, 혈당강하, 간기능 항진, 운동수행능력 증대, 항피로작용, 면역력 증대, 항암, 항비만 및 항산화 효과가 뛰어난 기능이 있는 것으로 알려져 있다.
또한 최근에는 Rd, Rg3, Rh2 및 compound K등의 진세노사이드 등의 뛰어난 약리 효능도 각종 연구로 밝혀졌다. 그중 인삼 및 홍삼의 사포닌 성분이 심장과 혈관보강, 혈액기능 회복, 혈류개선 및 혈중콜레스테롤 함량저하와 배설촉진, 고콜레스테롤 혈중으로 야기되는 혈관병변을 예방하는 효과 등의 보고도 있다.
면역(immunity)이란 인간과 동물의 개체가 체내에 외인성 및 내인성 이물질을 생리적으로 인식하여 저항하거나 항상성을 유지할 수 있는 능력과 기작을 말한다. 면역에는 선천성 면역과 후천성 면역이 존재하는데 선천성 면역은 자연면역으로 비특이적 면역이라고도 하는데, 체내로 침입하는 병원체의 종류와 상관없이 즉각적으로 작용하는 방어 작용이다. 병원체가 체내에 들어오는 것을 막는다는 의미에서 '1차 방어'라고도 불리며 표면의 방어벽과 몸 내부의 화학 물질이 관여한다.
예를 들어 사람의 피부는 케라틴이라는 단백질을 포함하고 있어서 단단한 물리적 장벽 역할을 하므로 세균이나 바이러스는 피부에 상처가 나지 않는 한 피부를 뚫고 체내로 들어올 수 없다. 소화관이나 호흡 기관의 내벽은 점막이라는 세포층으로 되어 있는데 여기서 분비되는 라이소자임 효소나 위에서 분비되는 염산과 같은 강산성 물질은 세균을 효과적으로 억제하는 작용을 한다. 또한 여러 종류의 백혈구가 세균을 잡아먹는 '식균 작용'을 하여 병원체를 제거하기도 하며, 병원체에 의해 손상된 세포에서 분비되는 히스타민에 의해 유발되는 염증 반응에 의해 병원체를 제거하기도 한다. 후천성 면역은 '획득면역' '특이적 면역'이라고도 하는데, 침입한 병원체의 종류를 인식하고 이에 맞게 대응하는 방어 작용으로 림프구와 항체가 중요한 역할을 한다. 또한 한 번 침입한 병원체의 종류를 기억하는 기능이 있어서 동일한 병원체가 2차로 침입할 때에는 이에 효과적으로 대처할 수 있다. 후천성 면역은 병원체가 몸에 완전히 침입한 후 일어나는 작용으로 선천성 면역 작용 이후에 진행되므로 '2차 방어'라고도 한다. 후천성 면역에는 세포성 면역과 체액성 면역이 있다. 후천성 면역 즉, 특이적 면역은 체내를 순환하는 B 림프구와 T 림프구가 담당한다. 이들은 표면에 특정 항원을 인식하는 수용체를 갖고 있어 항원을 인식하면 각각 체액성 면역과 세포성 면역을 활성화시킨다. 이들 중 항원은 병원체나 이물질, 다른 종의 장기 조직 등 비자기(non-self)로 인식되어 후천적 면역 반응을 유발하는 원인이 되는 물질이고 항체는 침입한 특정 항원에 대항하기 위해 B 림프구가 만들어내는 물질로 특정 항원에 결합해 병원성을 소멸시킨다. 통상적으로 한 가지 항체는 한 가지 항원과만 특이적으로 결합을 하는데, 이를 항원－항체 반응의 특이성이라고 한다. 세포성 면역은 항원을 인식한 독성 T 림프구가 병원체에 감염된 세포나 암세포를 직접 공격하여 제거한다. 또한 체액성 면역은 항원을 인식한 보조 T 림프구가 B 림프구를 자극하여 항체를 분비하는 형질 세포와 항원을 기억하는 기억 세포로 분화·증식시킨다. 형질 세포가 혈액으로 항체를 분비하면 항체가 항원과 결합해 항원-항체 반응을 일으켜 항원을 제거한다.
면역력이 떨어진 상태는 외부 병원체에 대하여 감수성을 가지고 있지 않거나 또는 감수성이 현저히 약해진 상태를 이야기 한 상태를 이야기 한다. 전염병을 이겨내거나 약독병원체의 인공감염 또는 각종 병원체에서 만들어진 백신의 주사 등에 의하여 얻어지는데, 천연물로부터 유래한 면역 증강 물질은 면역반응을 강화시키거나 저하된 면역능을 원상회복시킴으로써 암, 면역결핍증, 그리고 만성감염 등의 치료를 위해 주로 사용된다. 면역 조절 작용은 생명유지에 있어 가장 근본이 되는 과정으로 암을 비롯한 각종 질병의 발생과 예방이 생체 면역능과 밀접한 관계가 있으며 최근 천연 식물자원을 대상으로 면역능을 강화하고 면역세포를 활성화시킬 수 있는 다양한 연구가 진행되고 있다.
제비집과 관련한 발명으로는 한국등록특허 제10-1469797호는 콜로이달 골드 제비집 추출물을 유효성분으로 함유하는 항노화 화장료 조성물로서 보습인자발현 증가 및 우수한 피부자극 완화 효과를 가지고 이를 유효성분으로 함유하는 피부개선 화장료에 관한 발명이다. 한국등록특허 제10-1268338호는 바다제비집 추출물을 유효성분으로 포함하는 구강위생 증진용 조성물로서 치주질환 예방, 치료 및 충치예방용 조성물에 관한 발명이다. 한편 홍삼과 관련한 발명으로는 한국등록특허 제10-1616104호는 생물전환기술을 이용한 진세노사이 Rg3 고함유 발효 홍삼의 제조방법에 관한 발명을 개시하였다. 한국등록특허 제10-1190915호는 락토바실러스 프란타룸과 비피도박테리움 인펀티스를 접종하여 발효시켜 조성된 홍삼발효액이 관하여 개시하였고 한국등록특허 제10-1762353호는 홍삼 추출물과 약초발효물을 함유하는 면역증가용 및 항산화용 건강식품 조성물로서 홍삼추출물과 대양한 약초의 유효성분을 천연미생물을 이용하여 발효시킨 약초발효물로서 면역증강과 항산화 효과가 우수한 건강식품 조성물에 관한 발명을 개시하였다. 한국등록특허 제10-1712699호는 홍삼 발효조성물의 제조방법 및 이에 의하여 제조된 홍삼 발효조성물로서 홍삼의 절편을 아스퍼질러스 오리제 곰팡이로 접종 발효하여 이루어진 홍삼 발효조성물의 제조방법을 개시하였다. 또한 한국공개특허 제10-2004-0034333호는 면역활성 조정 효과를 갖는 홍삼복합물 조성 및 이를 함유한 식품으로서 홍삼을 특수 처리하여 얻은 홍삼엑스와 아가리 쿠스 브라제이 등의 약재를 추출하여 얻은 엑스를 혼합한 복합물로서 면역활성 조절 효과를 갖는 식품에 관한 것을 개시하였다. 한국등록특허 제10-1339706호는 홍삼포접화합물, 면역농축물 및 유산균을 유효성분으로 함유하는 면역증강 복합조성물로서 홍삼을 포접하여 쓴맛을 감소하고 백작약 등의 약재 등을 혼합하여 농축한 면역 농축물과 유산균을 유효성분으로 한 조성물을 개시하였다. 또한 한국등록특허 제10-1024151호는 제비집과 홍삼엑기스를 함유하는 기능성 음료조성물로서 제비집과 홍삼추출물을 주성분으로 하여 피부윤택과 면역력증강, 항산화 등의 기능이 있는 기능성 음료 조성물에 대한 발명을 개시하였다. 한국공개특허 제10-2015-0070515호는 제비집 및 홍삼의 복합물을 유효성분으로 함유하는 질환의 예방 또는 치료용 조성물로서 제비집 추출물과 홍삼분말의 복합조성물을 유효성분으로 알러지 질환 예방과 치료용 식물조성물, 약제학적 조성물, 피부 외용제, 화장품 조성물에 관한 발명을 개시하였다.
그러나 이들 발명의 대부분이 바다제비집을 그대로 혹은 단순 추출물을 이용하여 조성물을 제조하거나 홍삼과 섞어서 기능과 용도에 관한 조성물을 제조하였으며, 홍삼과 관련한 발명도 홍삼과 액재를 혼합하여 이루어진 조성물과 일부 유산균으로 발효하여 이루어진 유효성분을 활용한 발명이 있으나 이들 발효물의 용도는 본 발명이 추구하는 방법과 이들에 의하여 유도되는 목적과 용도 등이 상이하여 본 발명을 개시하고자 한다.
즉 본 발명은 바다제비집을 단순히 추출하거나 자체를 용해하여 그대로 이용한 것이 아니라 바다제비집을 본 발명에서 제시하는 적절한 효소와 조건으로 처리하여 유효성분인 유리 시알산의 함량을 극대화하였고 이 효소분해물과 홍삼액을 혼합하고 목적하는 발효액을 얻고자 본 발명에 특화된 신규한 유산균을 분리하고 이를 접종 배양하여 제시하는 별도의 발효조건에서 발효하여 홍삼 전체 사포닌과 진세노사이드성분이 아니라, 유용한 목적성분이 고함유되어 제조되는 액상의 복합 발효조성물을 갖는 면역활성을 증강시키는 것을 목적으로 하는 발명으로서 이에 대한 기술은 고지된 바 없다.
한국등록특허 제10-1469797호 한국등록특허 제10-1268338호 한국등록특허 제10-1616104호 한국등록특허 제10-1190915호 한국등록특허 제10-1762353호 한국등록특허 제10-1712699호 한국공개특허 제10-2004-0034333호 한국등록특허 제10-1339706호 한국등록특허 제10-1024151호 한국공개특허 제10-2015-0070515호
본 발명은 상기와 같은 요구에 의해 안출된 것으로서, 본 발명의 목적은 바다제비집의 유리시알산의 함량을 높이기 위하여 최적의 효소의 종류와 효소처리조건을 한정하였으며, 최적조건에서 효소처리된 바다제비집 효소분해물과 홍삼을 혼합하여 복합액을 조성(이하 '복합액'으로 칭함)하여 이들 복합액을 신규 유산균으로 발효하여 유효성분으로 유리시알산, Rg3 및 컴파운드 K를 고함유 되도록, 발효조건의 최적화와 부원료 등을 포함하는 복합발효 조성물의 제조방법 이를 유효성분으로 하여 면역 활성능을 증강시키는 복합발효물을 제공하는데 있다.
(1) 바다제비집 분말에 물을 가하여 분산 및 팽윤하고 열처리 및 냉각하여 바다제비집 분산액을 준비하고, 상기 준비한 바다제비집 분산액에 플라보르자임 500 MG(Flavourzyme 500 MG)를 사용하여 가수분해하는 단계;(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 바다제비집 효소 분해물에 홍삼액과 바나나 농축액을 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 바다제비집 효소처리물-홍삼 복합액(이하 '복합액'으로 칭함)을 준비하는 단계; (3) 상기 (2)단계의 준비한 복합액에 신규한 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01균주를 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는 유리 시알산(sialic acid), 진세노사이드 Rg3 및 컴파운드 K(compound K) 함량이 증진된 바다제비집-홍삼 복합 발효물(이하 '복합발효물' 로 칭함)의 제조방법을 제공한다. 본 발명은 또한, 상기 방법으로 제조된 유리 시알산, 진세노사이드 Rg3 및 컴파운드 K(compound K) 함량이 증진된 바다제비집과 홍삼 복합 발효물을 제공한다.
본 발명은 바다제비집 효소처리액-홍삼 복합액(이하 '복합액'으로 칭함)을 신규한 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01으로 발효하여 제조된 제조방법과 복합발효물로서 이들을 바탕으로 한 면역활성 증강의 기능과 효과를 검증함으로써 이들의 유효성분을 고농도로 함유하는 액상의 제품을 제조할 수 있다.
본 발명에서 획득되는 고농도의 유효성분을 함유한 액상의 복합발효물 제품은 일반적으로 기능음료, 고형식품 및 약제 등의 다양한 일상용도와 산업용으로 활용할 수 있는 효과가 있다.
도 1은 본 발명의 바다제비집 효소분해물-홍삼 복합발효물의 제조공정을 도식화한 것이다.
도 2는 각종 발효식품으로부터 분리된 젖산균의 브로모크레졸퍼플(BCP) 함유 MRS 한천배지상의 분주, 도말 후 배양한 사진이다.
도 3은 분리한 유산균 16종의 에스큘린(esculin)고체배지 배양 사진이다.
도 4는 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주의 뉴클레오타이드 염기서열 결과이다.
도 5는 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주의 16S rRNA의 계통수 분석 결과이다.
도 6은 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주의 내담즙성(A)과 내산성(B) 시험한 결과 이다.
도 7은 효소 처리 농도, 반응온도 및 반응시간에 따른 바다제비집 효소 분해물의 유리 시알산 함량에 대한 4차원 반응표면분석 결과이다.
도 8은 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 균 성장도에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 9는 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의의 pH에 대한 등고도(위)와 반응표면분석(아래) 결과이다.
도 10은 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의의 산도에 대한 등고도(위)와 반응표면 분석(아래) 결과이다.
도 11는 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 Rg1 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면 분석(아래) 결과이다.
도 12는 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 Re 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면 분석(아래) 결과이다.
도 13은 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 Rb1함량에 대한 등고도(위)와 반응표면 분석(아래) 결과이다.
도 14는 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 Rd함량에 대한 등고도(위)와 반응표면 분석(아래) 결과이다.
도 15는 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 Rg3 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면 분석(아래) 결과이다.
도 16은 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 컴파운드 K 함량에 대한 등고도(위)와 반응표면 분석(아래) 결과이다.
도 17은 발효시간과 부원료 농도에 따른 복합 발효물의 발효 최적화를 위한 주요 반응변수 등고도의 수퍼임포징(superimposing) 결과이다.
도 18은 발효 전후 유효성분에 관한 HPLC 분석크로마토 그램이다. (A) 시알산 표준품, (B) 바다제비집 효소분해전 시료, (C) 바다제비집 효소 분해물, (D) 진세노사이드 표준품, (E) 발효전 복합액의 진세노사이드, (F) 발효후 복합 발효물의 진세노사이드
도 19는 MTT 정량을 통한 시료들의 세포 독성 검사 결과이다. (A)시료; 발효 홍삼액, (B)시료; 바다제비집 효소 분해물, (C)시료; 복합 발효물
도 20은 시료들의 T세포의 증가율에 관한 영향을 검토한 결과이다. (A)시료; 발효 홍삼액, (B)시료; 바다제비집 효소 분해물, (C)시료; 복합 발효물
도 21은 시료들의 NO 생성의 미치는 영향을 검토한 결과이다. (A)시료; 발효 홍삼액, (B)시료; 바다제비집 효소 분해물, (C)시료; 복합 발효물
도 22는 시료들의 염증 사이토카인 생성에 미치는 영향을 검토한 결과이다. (A)시료; 발효 홍삼액, (B)시료; 바다제비집 효소 분해물, (C)시료; 복합 발효물
도 23은 시료들의 IL-2 생성에 미치는 영향을 검토한 결과이다. (A)시료; 발효 홍삼액, (B)시료; 바다제비집 효소 분해물, (C)시료; 복합 발효물
도 24는 시료들의 IL-6 생성에 미치는 영향을 검토한 결과이다. (A)시료; 발효 홍삼액, (B)시료; 바다제비집 효소 분해물, (C)시료; 복합 발효물
도 25는 시료들의 IL-10 생성에 미치는 영향을 검토한 결과이다. (A)시료; 발효 홍삼액, (B)시료; 바다제비집 효소 분해물, (C)시료; 복합 발효물
본 발명의 구체적 특징 및 이점들은 이하에서 첨부도면을 참조하여 상세히 설명한다. 이에 앞서 본 발명에 관련된 기능 및 그 구성에 대한 구체적인 설명이 본 발명의 요지를 불필요하게 흐릴 수 있다고 판단되는 경우에는 구체적인 설명을 생략하기로 한다.
본 발명의 복합 발효물의 제조방법은 (1) 바다제비집 분말에 물을 가하여 분산 및 팽윤하고 열처리 및 냉각하여 바다제비집 분산액을 준비하고, 상기 준비한 바다제비집 분산액에 플라보르자임 500 MG(Flavourzyme 500 MG)를 사용하여 가수분해하는 단계와 (2) 상기 (1)단계의 가수분해한 바다제비집 효소 분해물에 홍삼액과 바나나 농축액을 첨가한 후 가열하여 효소를 불활성화시켜 바다제비집 효소 분해물-홍삼 복합액(이하 '복합액'으로 칭함)을 준비하는 단계 및 (3) 상기 (2)단계의 준비한 복합액에 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 접종한 후 발효하는 단계를 포함하여 제조된다.
이로써, 유리 시알산(sialic acid), 진세노사이드 Rg3 및 컴파운드 K(compound K) 함량이 증진된 바다제비집-홍삼 복합 발효물(이하 '복합 발효물' 로 칭함)이 제조된다.
본 발명의 바다제비집-홍삼 복합 발효물의 제조방법에서, 상기 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주는 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주로, 한국생명공학연구원에 2017년 12월 04일자로 기탁하였다(기탁번호: KCTC 13411BP). 상기 기탁된 특정 균주는 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 활성이 높고, 내산성 및 내담즙성을 지니는 균주이며, 상기 균주를 이용하여 복합 발효물을 제조할 경우, 특정 기능성 성분이 증진된 복합 발효물로 제조할 수 있었다.
상기 (1)단계의 플라보르자임 500 MG(Flavourzyme 500 MG)은 Novozyme사의 복합효소제로서 아스퍼질러스 오리제(Aspergillus oryzae) 유래의 효소로 내부 단백분해효소(endoprotease)와 펩티드말단가수분해효소(exopeptidase)를 함유하는 효소를 의미한다.
상기 (1)단계는 바다제비집에 물을 0.7~1.5:50~150(w(g):v(ml)) 비율로 가하여 분산 및 팽윤시킨 바다제비집 분산액을 준비하고, 상기 준비한 분산액에 400~500 LAPU/ml 농도의 플라보르자임 500 MG를 7~23%(v/v) 첨가한 후 40~60℃에서 90~180분 동안 가수분해할 수 있다.
더욱 바람직하게는 바다제비집 분말에 물을 1:99(w(g):v(ml)) 비율로 가하여 분산 및 팽윤한 바다제비집 분산액을 준비하고, 상기 준비한 분산액에 500 LAPU/ml 농도의 플라보르자임 500 MG를 15%(v/v) 첨가한 후 40℃에서 140분 동안 가수분해할 수 있다.
상기와 같은 조건으로 효소 처리할 경우 수용화 되지 않고 분산된 바다제비집을 완전히 가용화하고 바다제비집의 유효성분인 유리 시알산 함량을 더욱 증진시킬 수 있다.
상기 (2)단계는 바다제비집 효소 분해물에 40~60°Brix의 홍삼농축액을 1~10%(w(g)/v(ml))와 또한 55~70 °Brix의 바나나 농축액을 1.0~2.0%(v/v) 첨가한 후 70~95℃에서 10~30분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 복합액을 준비할 수 있다.
더욱 바람직하게는, 바다제비집 효소 분해물에 60°Brix의 홍삼농축액 5%(w(g)/v(ml))와 65°Brix의 바나나 농축액 1.5%(v/v)를 첨가한 후 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 복합액을 준비할 수 있다.
상기와 같은 조건으로 전처리하는 것이 효소를 불활성화시키고, 이후 공정인 발효에 적합하면서 품질이 우수한 발효물로 제조할 수 있는 복합액을 준비할 수 있었다.
또한, 상기 바나나 농축액은 바나나 과즙, 바나나 추출액, 바나나 건조물 및 바나나 분말로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상을 사용하여 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
또한, 상기 바나나 원료 외에 갈락토올리고당(galacto-oligosaccharide), 말토올리고당(malto-oligosaccharide), 프락토올리고당(fructo-oligosaccharide) 및 이소말토올리고당(isomalto-oligosaccharide)으로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 올리고당을 첨가하여 바나나 농축액을 제조할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (3)단계의 발효는 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주를 1~10%(v/v) 접종한 후 30~45℃에서 4~20일 동안 진행된다.
더욱 바람직하게는, 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주를 2%(v/v) 접종한 후 37℃에서 14일 동안 발효한다.
상기와 같은 조건으로 발효하는 것이 균 성장도가 높아 좋은 발효 특성을 지니면서 유리 시알산(sialic acid), 진세노사이드 Rg3 및 컴파운드 K(compound K) 함량을 더욱 증진시킬 수 있었다.
본 발명의 바다제비집-홍삼 복합 발효물의 제조방법은, 보다 구체적으로는 (1) 바다제비집에 물을 0.7~1.5:50~150(w(g):v(ml))의 비율로 가하여 분산 및 팽윤한 바다제비집 분산물을 준비하고, 상기 준비한 분산물에 400~500 LAPU/ml 농도의 플라보르자임 500 MG를 7~23%(v/v) 첨가한 후 40~60℃에서 90~180분 동안 가수분해 단계와 (2) 상기 (1)단계의 가수분해한 바다제비집 효소 분해물에 40~60 °Brix의 홍삼농축액을 1~10%(w(g)/v(ml))와 또한 55~70 °Brix의 바나나 농축액을 1.0~2.0%(v/v) 첨가한 후 70~95℃에서 10~30분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 복합액을 준비하는 단계 및 (3) 상기 (2)단계의 준비한 복합액에 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주를 30~45℃에서 4~20일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
더욱 구체적으로는, (1) 바다제비집에 물을 1:99(w(g):v(ml))의 비율로 가하여 분산 및 팽윤시킨 바다제비집 분산물을 준비하고, 상기 준비한 분산물에 500 LAPU/ml 농도의 플라보르자임 500 MG를 15%(v/v) 첨가한 후 40℃에서 140분 동안 가수분해하는 단계와 (2) 상기 (1)단계의 가수분해한 바다제비집 효소 분해물에 60 °Brix의 홍삼농축액 5%(w(g)/v(ml))와 65 °Brix의 바나나 농축액 1.5%(v/v)를 첨가한 후 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 복합액을 준비하는 단계 및 (3) 상기 (2)단계의 준비한 복합액에 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주를 2%(v/v) 접종한 후 37℃에서 14일 동안 발효하는 단계를 포함할 수 있다.
상기 방법으로 제조된 바다제비집-홍삼 복합 발효물은 유리 시알산(sialic acid), 진세노사이드 Rg3 및 컴파운드 K 함량이 증진된 효과가 있다.
본 발명의 상기 복합 발효물의 기호도를 더욱 향상시키기 위해, 사과, 감, 블루베리, 블랙베리, 블랙커런트, 아사이베리, 복분자, 석류, 포도, 배, 복숭아, 바나나, 딸기, 토마토, 당근, 자두, 매실, 앵두, 다래, 오디, 머루, 키위, 참외, 귤, 오렌지, 자몽, 귤, 멜론, 체리, 멜론, 블랙수퍼베리, 망고, 레몬 및 파인애플로부터 선택되는 하나 이상의 과일 성분을 첨가할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
이하, 본 발명을 제조예 및 실시예에 의해 상세히 설명한다. 단, 하기 제조예 및 실시예는 본 발명을 예시하는 것일 뿐, 본 발명의 내용이 하기 제조예 및 실시예에 한정되는 것은 아니다.
제조예 1. 바다제비집-홍삼 복합 발효물 제조
(1) 바다제비집 1 g에 증류수 99 mL를 가하여 분산 및 팽윤시킨 바다제비집 분산물을 준비하고, 500 LAPU/ml(leucine amino peptidase units per milliliter) 농도의 플라보르자임 500 MG를 15%(v/v) 첨가한 후, 40℃에서 140분 동안 가수분해하였다.
(2) 상기 (1)단계의 가수분해한 바다제비집 효소 분해물에 60 °Brix의 홍삼농축액 5%(w(g)/v(ml))와 65 °Brix의 바나나 농축액 1.5%(v/v)를 첨가한 후 85℃에서 15분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 복합액을 준비하였다.
(3) 상기 (2)단계의 준비한 복합액에 107 CFU/mL의 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주를 2%(v/v) 접종한 후 37℃에서 14일 동안 발효하여 바다제비집-홍삼 복합 발효물을 제조하였다(도 1).
실험예 1. 유산균 선정
(1) 유산균의 분리
유산균 분리에 사용한 발효식품 시료는 가정집 및 음식점에서 담근 김치 수십종, 젓갈 및 생선식해 등을 수집하여 유산균 분리 시료액으로 사용하였으며, 각 시료액을 멸균증류수로 10-1~10-5의 농도로 희석한 후 0.004% 브로모크레졸퍼플(BCP)이 첨가된 시판용 MRS 한천배지에 100 ㎕씩 분주한 후 도말하고, 37℃에서 24시간 배양 후 나타난 독립된 콜로니 중 유산균의 특징적인 콜로니를 순수 분리하였다. 순수 분리한 유산균은 MRS 한천 사면배지에 접종하여 37℃에서 24시간 배양한 후 4℃ 냉장보관하면서 사용하였다.
(2) 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성 균주 선발
베타-글루코시다아제 활성을 갖는 균주의 선발을 위해 에스쿨린 한천(esculin 0.1%, peptones 1.8%, ferric citrate 0.1%, agar 2%)법을 이용하여 에스쿨린(esculin)이 함유된 에스쿨린 한천배지에 균주를 접종하여 배지 내에서의 색깔 변화를 관찰하였다. 에스쿨린은 베타-글루코시다아제에 의하여 글루코스(glucose) 와 에스쿨린으로 분리되며 에스쿨린은 페릭 암모니움 시트레이트(ferric ammonium citrate)와 반응하여 콜로니 주위에 검은색 반점(black complex)을 형성하게 된다(화학식 1). 따라서 에스쿨린 한천배지에서 배양된 콜로니 주위에 검은색 반점을 형성하는 균주를 베타-글루코시다아제 활성을 가지는 균주로 판단하여 선별하였다.
Figure 112017131352917-pat00001
(3) 베타-글루코시다아제(β-Glucosidase) 활성능 측정
베타-글루코시다아제 활성 측정은 1% 카르복시메칠셀루로오스(carboxymethyl cellulose, CMC)가 첨가된 시판용 MRS 배지에 12시간 전배양한 균주를 접종하여 37℃에서 24시간 배양 후, 배양액을 4℃에서 6,000 rpm으로 15분간 원심분리하여 세포를 제거하고, 상층액 0.5 ml를 취하여 1 ml의 5 mM 파라-니트로페닐-베타-디-글루코피라노사이드(ρ-nitrophenyl-β-D-glucopynanoside, ρ-NPG) 용액과 혼합한 후 37℃에서 30분간 반응시켰다. 반응액은 1 ml의 1M 탄산나트륨(Na2CO3) 용액을 첨가하여 반응을 중지시키고, 생성된 파라-니트로페놀(ρ-nitrophenol, ρ-NP)를 405 nm에서 흡광도를 측정한 후 파라-니트로페놀의 검량곡선을 이용하여 농도를 환산하였다.
(4) 내담즙성 및 내산성 시험
내담즙성은 MRS 액체배지에 0.3% 담즙 추출물(Oxgall bile extract)을 첨가하고, 분리된 균주들을 2%씩 접종하여 37℃에서 24시간 배양하였으며, 배양종료 후 브로모크레졸퍼플(BCP) 한천배지에서 생균수를 측정하였다. 내산성 시험은 1N 염산(HCl)을 증류수에 희석하여 MRS 산성액체배지(pH 2.5)를 준비하고 MRS 액체배지에서 37℃ 및 24시간 배양된 균주를 107 CFU/mL 수준으로 접종하여 37℃에서 3시간 동안 배양하고, BCP 한천배지에서 생균수를 측정하였다.
(5) 최종선별균주의 염기서열분석과 계통분류
최종 선별된 균주의 16S rRNA 유전자는 시퀀싱(sequencing)을 통하여 분석하였으며, NCBI 데이터베이스(database)를 이용하여 분리된 균주와 데이터베이스상의 표준균주(type strain)와의 유사성(similarity, %)을 확인하였다.
실험예 2. 바다제비집의 효소 처리 조건 선정
1) 바다제비집의 효소 처리
(1) 바다제비집 원료
본 발명에서 사용된 바다제비집 원료는 2016년에 6월에 베트남에서 수입된 최상품의 설연제품을 구입하여 사용하였다.
(2) 가수분해 효소
본 발명 실험에 사용한 분해효소로는 식품 용도로 상업적으로 판매되어 사용되고 있는 Novo Nordisk사(Denmark)의 알카라제(Alcalase) 2.4L, 프라보르자임(Flavourzyme) 500MG, 뉴트라제(Neutrase) 0.8L, 프로타멕스(Protamex)를 사용하였다. 실험에 사용한 가수분해 효소의 최적온도와 pH는 알카라제(Alcalase) 2.4L(60℃, pH 7.0), 프라보르자임(Flavourzyme) 500MG(50℃, pH 7.0), 뉴투라제(Neutrase) 0.8L(50℃, pH 6.5), 프로타멕스(Protamex)(50℃, pH 6.0)으로 설정하여 사용하였다.
(3) 바다제비집 최적 효소 선정
바다제비집 분해에 적합한 효소 선정을 위한 처리는 바다제비집 분말 시료 1 g에 99 mL의 증류수를 가하여 충분히 혼합하여 분산시킨 후 90℃에서 30분간 열처리 후 냉각하여 실험에 사용하였다. 효소처리를 위한 효소의 양은 제비집 기질 대비 20%(v/v)로 하였으며, 가수분해는 시판 효소의 최적온도와 pH에서 90분 동안 처리하였다. 처리가 끝난 즉시 효소처리군은 85℃에서 15분간 열처리 하여 효소를 불활성화하고 원심분리를 이용하여 원심분리 한 후 상등액을 취하여 바다제비집 유효성분인 유리 시알산 함량 측정의 시료로 사용하였다.
(4) 유리 시알산 함량 분석
바다제비집 효소 분해물과 바다제비집-홍삼 복합발효물의 시알산 함량은 시료 용액을 DMB(8 mM 1,2-diamino-4,5-methylenedioxybenzene dihydrochloride, 1.5 M 초산, 14 mM sodium hydrosulfite, 0.8 M β-mercaptoethanol) 시액(reagent)과 혼합한 후 80℃의 히팅블럭에서 60분 반응 후 실온으로 냉각하여 0.45 ㎛ 막여과지(membrane filter)로 여과한 후, HPLC시스템(Alliance e2695, Waters Co., Milford, MA, USA)로 분석하였다. 분석조건은 표 1에 나타내었다. 표준품은 분석용 시알산(Sigma Chemical Co.)를 이용하여 표준 검량선을 작성한 후 각각의 함량을 계산하였다.
하기의 표 1은 바다제비집 시알산 함량의 HPLC 분석조건을 보여준다.
장치 조건
컬럼 Venusil XBP C18 (Agela Technology Co.)
(250 mm 길이 × 4.6 mm직경, 입자 크기 5 ㎛)
이동상 물 : 메탄올 : 아세토나이트릴 = 85 : 7 : 8 (v/v/v)
흐름 속도 0.9 mL/min
주입량 10 ㎕
컬럼 오븐온도 33℃
검출기 형광검출기(λexc = 373 nm, λem = 448 nm, gain 1, attenuation 64, response 5s)
2) 효소분해 조건 최적화를 위한 실험계획
바다제비집의 효소처리조건을 최적화하기 위하여 반응표면분석법(repose surface methodology, RSM)을 이용하였다. 효소처리조건은 중심합성계획법(Central Composite Design, CCD)을 이용하여 바다제비집 기질대비 효소농도(효소/기질 농도) (7∼23%), 반응온도(40∼60℃) 및 반응시간(90∼210 min)의 범위를 설정하였다. 독립변수로서 효소/기질 농도(X1, %), 반응온도(X2, ℃) 및 반응 시간(X3, min)을 설정하고 종속변수는 효소분해 후 생성된 시알산(YSA, mg/100 g)으로 지정하여 실험을 설계하였으며 표 2와 3에 나타냈다. 또한 효소분해 조건이 바다제비집 효소분해물의 시알산 함량에 미치는 영향을 예측된 모델식을 바탕으로 매스매티카 프로그램(Mathematica program)을 이용하여 4차원 반응표면분석으로 해석하였다.
하기의 표 2는 바다제비집의 효소 분해를 위한 실험디자인을 보여준다.
매개변수 -2 -1 0 1 2
X1 효소농도(E/S, %) 7 11 15 19 23
X2 반응온도(℃) 40 45 50 55 60
X3 반응시간(분) 90 120 150 180 210
하기의 표 3은 바다제비집의 효소 분해 최적화를 위한 중심합성계획을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00002
실험예 3. 복합액의 유산발효조건 최적화
1) 유산발효조건
최적 효소처리조건에서 처리되어 유리 시알산 고함유 바다제비집 효소분해물에 홍삼을 혼합하여 제조된 복합액을 본 발명에 적합하게 분리된 신규한 유산균주로 발효하여 유산발효조건을 최적화하기 위하여 중심합성계획법(central composite design)에 따라 표 4와 같은 발효시간(X1)과 부원료 첨가 농도(X2)를 독립변수로 설정하고, 반응표면분석(response surface methodology, RSM)에 의하여 설정한 13가지 발효조건으로 복합액를 발효하였다(표 5). 각 종속변수에 대한 회귀 방정식을 얻어 발효조건에서 독립변수의 상호영향 및 최적 발효조건을 구하였다. 발효조건의 회귀식에 의한 예측은 SAS(Statistical Analysis System) 프로그램을 사용하였다. 중심합성계획에서 독립변수(Xn)은 발효시간(4∼20일, X1) 및 바나나 농축액 첨가 농도(0∼2%, X2)이며 실험계획은 -2, -1, 0, 1, 2 다섯 단계로 부호화하여 실험값을 나타내었다. 최적 발효조건과 관련된 종속변수(Yn)으로는 생육도, pH, 산도 및 진세노사이드 함량으로 각각 나타내었다.
하기의 표 4는 복합액의 발효조건 최적화 실험디자인을 보여준다.
매개변수 -2 -1 0 1 2
X1 발효시간(day) 4 8 12 16 20
X2 부원료 농도(%) 0.0 0.5 1.0 1.5 2.0
하기의 표 5는 복합액의 유산균 발효 최적화 중심합성계획을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00003
(1) 발효
바다제비집 효소 가수분해물에 홍삼농축액(60 °Brix) 5%(v/v)를 첨가한 것을 기본 배지로 하여 실험계획에 따라 부원료인 바나나 농축액(65 °Brix)의 첨가량을 달리하여, MRS 액체배지에서 12시간 전배양된 신규한 유산균인 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주를 종균으로 하여 이를 2%(v/v)로 접종 후 발효시간을 달리하여 발효하였다.
(2) 복합발효물의 생육도, pH 및 산도 측정
발효가 끝난 복합발효물의 유산균 생육도는 분광광도계(Optizen 2120UV, Mecasys Co., Ltd., Korea)로 660 nm에서 흡광도를 측정하였다. pH는 pH 미터(Metter Toledo Group, Switzerland)를 사용하여, 적정 산도는 0.1N NaOH 용액으로 pH 8.3으로 중화 적정하여 소비된 0.1N NaOH 용액을 젖산 함량(%)으로 환산하였다.
(3) 복합발효물의 진세노사이드 함량 측정
복합발효물의 진세노사이드 함량은 시료 용액을 0.45 ㎛ 막여과지로 여과한 후, HPLC시스템(Alliance e2695, Waters Co., Milford, MA, USA)로 분석하였다. 분석조건은 표 6에 나타내었다. 표준품은 진세노사이드 Rg1, Re, Rb1, Rd, Rg3 및 컴파운드 K(ChromaDex Co. USA)를 이용하여 표준 검량선을 작성한 후 각각의 함량을 계산하였다.
하기의 표 6은 복합발효물의 진세노사이드 함량 분석을 위한 HPLC 분석조건을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00004
실험예 4. 복합발효물의 면역활성능 측정
(1) 세포 배양
복합발효물의 면역활성능 측정을 위하여 사용된 대식세포주인 RAW 264.7(KTCC No. 40071)세포와 T세포주인 Molt-4(KTCC No. 21582)세포는 한국 세포주 은행(KTCC, Seoul, Korea)에서 분양받아 사용하였다. RAW 264.7 세포는 DMEM배지에 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 첨가해 만든 배지를 사용하여 37℃, 5% CO2 조건에서 CO2배양기(MCO-15AC, Sanyo, Japan)에서 배양하였다. 또한 Molt-4세포는 10% FBS와 1% 페니실린/스트렙토마이신을 함유한 RPMI 1640 배지를 이용하여 37℃, 5% CO2로 조절된 배양기에서 배양하였다.
(2) 세포독성
복합발효물이 RAW 264.7 세포에 나타내는 세포독성 유발 효과를 알아보기 위하여 각 시료의 세포독성은 MTT 분석을 통해 측정하였다. RAW 264.7 세포(1 × 104 cells/well)를 96-웰 프레이트(96-well plate)에 100 ㎕씩 분주하고 24시간 동안 안정화 시킨 뒤 복합발효액 등을 농도별(25, 50, 100 μg/ml)로 처리하여 37℃, 5% CO2 배양기에서 24시간 배양하였다. 배양 후 5 mg/ml 농도의 MTT 시약을 20 ㎕씩 첨가하여 2시간 추가배양하고 MTT 시약을 제거하였다. 그 후 각 웰에 디메칠 설포사이드(dimethyl sulfoxide, DMSO)를 첨가하여 생성된 포르마존(formazan)을 녹여 이를 마이크로 플레이트 리더(Microplate reader, BioTek Etx 800-PC, Winooski, VT, USA)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 생존율은 대조군에 대한 처리군의 흡광도 비를 백분율로 표시하여 계산하였다.
(3) T세포 증식
복합발효물의 T세포에 대한 증식능을 확인하기 위하여 Molt-4 세포를 96-웰 프레이트에 1 × 104 cells/well 농도로 분주 후 양성대조군으로 콘커나발린 A(concanavalin A, Con A) 5 ㎍/ml와 복합발효물 등의 시료를 25, 50, 100 ㎍/ml로 각각 처리한 후 96시간 배양하여 MTT 분석을 실시하였다. 배양 후 5 mg/ml 농도의 MTT를 넣고, 빛을 차단한 상태에서 4시간 동안 37℃ 배양기에서 반응시킨 후 DMSO로 형성된 포르마존을 용해하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 증식능은 시료 대신 동량의 배지를 넣은 대조군의 흡광도 대비 상대적인 값으로 나타내었다.
(4) 산화질소(nitric oxide, NO) 생성량 측정
그리에쓰(Griess) 반응을 이용하여 배양액 내에 존재하는 아질산염(nitrite) 농도를 측정하였다. RAW 264.7 세포를 DMEM 배지를 이용하여 2.5 × 105 cells/ml의 농도로 96-웰 프레이트에 접종하고, 5% CO2 배양기에서 20시간 전 배양하였다. 세포에 1 μg/ml의 LPS와 복합발효뮬 등의 시료를 각 농도별로 처리하여 24시간 배양하였다. 배양액의 상층액을 얻은 후, 상층액과 그리에쓰(griess) 시약(1% sulfanilamide : 0.1% naphthylendiamine dihydrochloride, 1:1)을 실온에서 10분간 반응시키고, 마이크로플레이트 리더(microplate reader, Model 550)를 이용하여 540 nm에서 흡광도를 측정하였다. 세포 배양액 내 일산화질소(NO)의 농도는 아질산나트륨(sodium nitrite, NaNO2)의 농도별 표준곡선과 비교하여 산출하였다.
(5) 사이토카인(cytokine)생성량
사이토카인(cytokine)인 TNF-α, IL-2, IL-6, IL-10의 생성량 측정은 RAW 264.7 세포를 96-웰 프레이트에 2.5 × 105 cells/ml의 농도로 분주 24시간 후 각 시료를 농도별로 처리하고 24시간 배양 후 세포의 배양액을 이용하여 일라이저 킷(ELISA kit, Komabiotech Inc., seoul, Korea)를 이용하여 측정하였다. 측정방법은 단일클론항체가 코팅된 마이크로 플레이트(micro plate)를 세척한 후, 시료를 넣은 다음 실온에서 반응시킨 후 제공된 세척액(washing solution)으로 세척하였다. 이어 다중클론성 항체를 넣어 각각의 사이토카인을 플레이트에 부착시킨 후 실온에서 반응시키고 세척 후 측정하고자 하는 사이토카인의 공액(conjugate) 용액을 넣고 반응시켰다. 반응시킨 후 plate를 세척액(washing solution)으로 다시 세척하고 발색제(color development reagent)로 실온에서 발색시킨 다음 반응중지액(stop solution)을 넣어 발색반응을 정지시키고 450 nm에서 흡광도를 측정하였다.
실시예 1. 신규한 유산균의 분리 동정
1) 발효식품으로부터 유산균 분리
여러 발효 식품과 김치류 시료를 멸균증류수를 이용하여 10-1 ~ 10-5 으로 희석하여 MRS 고체배지에 도말하여 37℃에서 배양한 후, 균주의 크기, 색, 모양, 투명도 등을 관찰하여, 15종의 유산균을 분리하였다. 일부 발효식품에서는 숙성에 따라 유산균이 거의 검출되지 않는 시료도 있었으며, 발효식품의 종류와 숙성도에 따른 콜로니의 분포는 달랐으며 희석배수가10-3~10-5일때 균주의 분리가 가장 용이하였다. 발효식품으로부터 분리한 균주는 LAB DUIH 1 ~ LAB DUIH 16으로 명명하였으며 분리한 균주는 계대배양을 실시하여 단독 콜로니를 순수분리 하였다. 최종 분리된 유산균은 MRS 배지상 브로모크레졸 퍼플(BCP)를 환원하여 전형적인 노란색으로 변화시켰고 전형적인 유산균종의 형태를 보였다(도 2).
2) 베타-글루코시데이즈(β-glucosidase) 활성 균주 선발
베타-글루코시데이즈는 에스큘린(esculin)의 베타 글루코스(beta-glucose) 결합을 절단하고 이때 생성된 에스큐레틴(esculetin)이 배지 내에 있던 구연산철암모늄(ferric ammonium citrate)과 반응하여 배지 상의 균체 콜로니 주위에 검은 반점(black complex)을 형성하게 된다. 발효식품에서 분리한 유산 균주들을 에스큘린(esculin)고체배지를 이용하여 배양을 실시한 후 콜로니 주변에 검은 반점(black complex)을 형성한 균주를 베타-글루코시데이즈 활성 균주로 간주하였다. 분리한 균주 16주 중, 12주에서 콜로니 주변에 검은 반점 환을 형성하여 베타-글루코시데이즈 활성이 있는 것으로 나타났다(도 3).
3) 분리 균주의 베타-글루코시다아제(β-glucosidase) 활성능 측정
에스큘린 고체배지 등을 이용하여 분리균주의 콜로니(colony) 주변에 환 형성 여부에 따라 베타-글루코시다아제 활성을 확인한 균주의 효소 활성능을 측정하였다. 그 결과, H01>H16>H05>H13의 순으로 높은 활성을 보였으며, 그 중 LAB DU. LAB. H01이 가장 높은 활성을 나타냈다.
하기의 도 7은 분리된 젖산균의 베타-글루코시다아제 활성능을 보여준다.
분리 균주 활성능(U/mL)
H01 13.36±1.73
H02 0.61±0.05
H03 1.12±0.13
H04 5.99±1.46
H05 10.04±2.71
H06 9.82±1.89
H07 5.44±0.66
H08 3.82±0.51
H09 0.33±0.02
H10 6.70±0.67
H11 6.24±0.99
H12 6.11±1.40
H13 9.91±1.39
H14 4.36±0.96
H15 0.10±0.01
H16 11.56±1.19
4) 최종 선발균주(H01)의 동정
최종 분리된 균주 중 베타-글루코시데이즈 활성능이 가장 높은 균주인 H01을 16S rRNA 유전자의 염기서열을 분석하여 NCBI blast DB와 비교한 결과(표 8), 락토바실러스(Lactobacillus) 속에 속하는 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum)과 99% 이상의 상동성을 보였다. NCBI Blast 검색을 통해 락토바실러스(Lactobacillus)속 내에서 H01 균주와 유연관계가 가까운 종들을 찾고 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) H01의 뉴클레오타이드 염기서열(도 4) 검색을 통하여 동일 균주들의 염기서열을 조사하였다. Bioedit 프로그램과 Clustal X 프로그램을 이용하여 염기서열을 배열(alignment)한 후 근연관계를 조사해 본 결과는 도 5와 같으며, 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 JCM 1149와 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주 NBRC 15891 등과 근연관계를 이루는 것으로 나타났다. 따라서 H01 균주를 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01으로 명명하였으며 국제미생물 특허기탁기관인 한국생명공학연구원 생물자원센터(KCTC) 2017년 12월 04일자로 기탁하였으며 기탁번호 KCTC 13411BP를 부여받았다.
분리균주 H01 균주의 16s rDNA 시퀀싱(sequencing)의 결과 비교
표준균주 동일성(Identities) 상동성(Similarity)
Lactobacillus plantarum strain JCM 1149 0/1435 100%
Lactobacillus plantarum strain NBRC 15891 1/1435 99%
Lactobacillus plantarum strain CIP 103151 1/1435 99%
Lactobacillus plantarum strain JCM 1149 1/1435 99%
Lactobacillus pentosus strain 124-2 1/1435 99%
5) 분리균주의 내담즙성 및 내산성
최종 분리된 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주의 내담즙성 측정은 담즙산 추출물(bile extract) 0.3%와 담즙산 무첨가구(control)에서 성장상태를 비교하였고 내산성의 측정은 배양 배지를 pH 2.5의 조건으로 조절한 것과 pH 5.7(control)에서의 37℃에서 24시간 동안 성장 실험한 결과는 도 6과 같다. 담즙산 추출물 첨가구에서는 무첨가구와 비교할 때 생장율이 다소 억제되기는 하였으나, 내성이 강한 성장상태를 보였다. 또한, 위산과 유사한 pH에서 생존 여부를 관찰한 분리균의 내산성의 결과, pH 2.5에서도 90% 이상의 생존력을 보였다.
실시예 2. 바다제비집 분산물의 효소 분해 조건 설정
1) 효소 종류의 영향
바다제비집 분산물의 효소적 가수분해를 위한 효소의 선정을 위해 제비집 분산물에 대한 4종의 효소의 가수분해에 대한 영향으로 분해물의 유리 시알산 함량을 조사한 결과는 표 9와 같다. 효소를 처리하여 얻은 제비집 가수분해물의 유리 시알산 함량은 효소 종류에 따라 플라보르자임 500 MG> 프로타멕스 > 뉴트라제 0.8 L > 알카라제 2.4 L의 순으로 차이를 보였으며, 모든 실험구에서 비효소 처리군인 대조군 0.11 mg/ml보다 2~3배 이상의 높은 함량을 나타내었다. 이상의 결과로 효소제를 처리한 모든 구간에서 대조구보다 품질특성이 우수하였으며, 유리 시알산 함량을 고려하였을 때 플라보르자임 500 MG로 가수분해시킨 제비집 가수분해물이 우수한 것으로 판단되어 본 효소를 최적조건 효소제로 선별하여 다음 단계의 효소의 최적 반응조건을 검토하였다.
하기의 표 9는 바다 제비집 가수분해를 위한 효소 종류의 영향을 보여준다.
효소종류 유리 시알산 함량(mg/ml)
효소 무처리 0.11
알카라제 2.4 L 0.22
플라보르자임 500 MG 0.32
뉴트라제 0.8 L 0.23
프로타멕스 0.29
2) 반응표면분석법을 이용한 바다제비집의 효소분해의 최적화 조건 설정
바다제비집 분산물의 효소적 가수분해를 위하여 적절한 효소로 선정된 플라보르자임 500 MG를 사용하여 최적 효소처리 조건을 설정하기 위해 효소농도, 반응온도 및 반응시간을 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 20구의 효소처리조건에서 얻어진 유리 시알산의 함량은 표 10과 같다.
중심합성계획법에 따라 각 독립변수의 범위를 설정한 후, 디자인 설계에 따라 20가지의 효소처리 조건을 설정하고 바다제비집을 효소분해 하였다. 플라보르자임 500 MG 효소를 사용하여 조건별로 처리된 제비집 효소분해물의 유리 시알산 함량은 0.24∼0.46 mg/ml의 범위로 나타났으며(표 10), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 11과 같다.
유리 시알산 함량에 대한 R2값은 0.8472으로 높은 신뢰도를 보였으며, P값은 1% 이내 유의수준을 보였다. 효소분해 처리조건에 대한 영향은 표 12 에서와 같이 효소처리 조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 효소농도>반응시간>반응온도의 순으로 효소농도의 영향이 가장 크며, 반응온도의 영향이 가장 낮은 것으로 나타났다.
효소처리에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 유리 시알산 함량의 최대값은 0.45 mg/ml이고 이때의 효소분해조건은 효소농도 14.37%, 반응온도 40.10℃ 및 반응시간 140.33 min으로 나타났다(표 13). 실험조건에 따라 얻은 효소분해물의 유리시알산 함량에 대한 반응표면은 도 7에 나타내었으며, 효소농도 10∼20% 범위에서 반응온도가 낮을수록 반응시간이 길어질수록 함량이 증가하는 경향을 나타내었다.
하기의 표 10은 반응표면분석의 중심합성계획에 근거한 바다제비집의 효소적 가수분해조건을 달리하여 측정한 유리시알산 함량에 대한 실험값을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00005
하기의 표 11은 바다 제비집의 효소적 가수분해를 위한 RSM으로 계산된 다항식를 보여준다.
반응변수 2차다항식 R2 유의수준
유리 시알산 함량 Y = 2.213997 - 0.007956X1 - 0.056077X2 - 0.005418X3 -0.001178X1 2 + 0.000688 X1X2 + 0.000396X2 2 + 0.000093750X1X3 + 0.000025000X2X3 + 0.000011966X3 2 0.8472 0.0044
하기의 표 12는 바다제비집의 효소적 가수분해를 위한 회귀분석 다항식을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00006
하기의 표 13은 능선분석에 의해 예측된 유리시알산 함량에 대한 바다제비집의 최적 효소적 분해 조건을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00007
실시예 3. 신규한 락토바실러스 프란타럼 ( Lactobaciilus plantarum )에 의한 복합액의 유산균 발효 조건 설정
1) 반응표면분석법을 이용한 복합액 유산발효조건 최적화
(1) 균 생육도, pH 및 산도값
신규한 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobaciilus plantarum) DU.LAB.H01에 의한 바다제비집 가수분해물-홍삼 복합액의 최적 발효조건을 설정하기 위해 발효시간과 부원료인 바나나 농축액 첨가 농도를 독립변수로 하여 중심합성계획에 의해 설계된 13구의 발효조건에서 얻어진 발효적 특성 값 즉, 균 생육도, pH 및 산도값은 표 14와 같다.
하기의 표 14는 반응표면분석의 중심합성계획에 근거한 복합액의 발효조건을 달리한 발효물의 생육도, pH 및 산도값에 대한 실험값을 보여준다.
실험번호1) 생육도(O.D. 600 nm) pH 산도(%)
1 1.658 3.92 1.16
2 1.546 3.90 1.10
3 1.457 3.93 1.10
4 1.418 3.91 1.05
5 1.618 3.90 1.12
6 1.647 3.90 1.14
7 1.632 3.89 1.18
8 1.624 3.90 1.16
9 1.635 3.90 1.14
10 1.611 3.88 1.14
11 1.204 3.91 1.06
12 1.546 3.93 1.12
13 1.314 3.97 0.91
1)중심합성계획에 의한 실험조건 번호
중심합성계획법에 따라 각 독립변수의 범위를 설정한 후, 13가지의 발효조건을 설정하고 복합액을 유산발효 하였다. 발효조건에 따른 복합 발효물의 균 생육도의 흡광값은 1.204∼1.658의 범위로 나타났으며(표 14), 이를 바탕으로 한 생육도의 회귀식은 표 15와 같고 R2 값은 0.9891로 1% 이내의 수준에서 유의성이 확인되었다. 아노바(ANOVA) 분석을 통한 모형에 대한 적합성을 검증하기 위해서는 적합결여도의 P값은 0.0592로 나타나 모형의 적합성이 인정되었다(표 15). 발효조건에 대한 영향은 표 16에서와 같이 발효시간과 부원료 농도 모두에 큰 영향을 받는 것으로 나타났다. 발효조건에 따라 반응표면모델(도 8)로 예측된 회귀분석결과 임계점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 최댓값은 1.693이며, 이때의 발효 조건은 발효시간 15.91일 및 부원료 농도 1.34%로 나타났다(표 17).
하기의 표 15는 바다제비집 효소분해물-홍삼 복합액의 발효조건을 달리한 발효물의 생육도, pH 및 산도값에 대한 예측된 이차다항식의 회귀계수와 t값를 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00008
하기의 표 16은 바다제비집 효소분해물과 홍삼 복합액의 발효조건에 대한 회귀분석 결과를 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00009
하기의 표 17은 능선분석에 의해 예측된 복합액의 최적발효조건을 위한 예측된 값을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00010
발효조건별로 처리된 복합 발효물의 pH는 3.88∼3.97의 범위로 나타났으며(표 14) 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 15와 같다. pH에 대한 R2값은 0.8502로 높은 신뢰도를 보였으며, P값은 5% 이내 유의수준을 보였다. 발효조건에 대한 영향에서 pH의 경우 부원료 농도에 영향을 받는 것으로 나타났으나, 설정된 범위 내에서 발효시간에 대한 영향은 거의 나타나지 않았다(표 16). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 안장점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 pH의 최대값은 3.96이고 이때의 발효조건은 발효시간 11.08일 및 부원료 농도 0.01%로 나타났다(표 17). 실험조건에 따라 얻은 홍삼농축액 발효물의 pH에 대한 반응표면은 도 9에 나타내었으며, 발효시간이 길수록 pH가 감소하는 것으로 나타났다.
발효조건에 따른 복합 발효물의 산도 변화는 0.91∼1.18%의 범위로 나타났으며(표 14), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 15와 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2값은 0.9338로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 아노바(ANOVA) 분석 결과는 표 15와 같다. 산도를 위한 발효조건 모델에 대한 적합결여도의 P값은 0.4268로 나타나 모델이 적합한 것으로 나타났다. 산도는 발효온도와 부원료 농도의 발효조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며(표 16), 부원료 농도가 높고 발효시간이 길수록 산도가 증가하는 것으로 나타났다(도 10). 표 17과 같이 산도의 예측된 정상점은 최대점으로 최대값이 1.17%이었고, 이때 발효시간 15.91일 및 부원료 농도 1.34%이었다.
(2) 복합 발효물의 유효성분 진세노사이드 함량
발효조건에 따른 홍삼농축액 발효물의 진세노사이드 Rg1 함량을 측정한 결과는 표 18과 같으며, 15.61∼50.42 ㎍/ml의 범위로 측정되었다. 조건에 따른 값을 이용한 진세노사이드 Rg1 함량의 회귀식은 표 19와 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.9685으로 회귀방정식에 대한 적합도가 높았으며, P값은 1% 이내 유의 수준을 보였다. 아노바(ANOVA) 분석을 통한 적합결여도의 P값은 0.0976로 분석되어 반응표면 모형에 대한 적합성이 인정되었다(표 19). 발효시간의 영향이 가장 크며, 다음으로 부원료 농도의 영향을 받는 것으로 나타났다(표 20). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 정상점은 최저점으로 구하였고, 진세노사이드 Rg1의 최저 함량은 15.73 ㎍/ml이었고, 이때의 발효조건은 발효시간 19.99일, 부원료 농도 0.97%로 나타났다(표 21). 반응표면을 통한 홍삼농축액 발효물의 진세노사이드 Rg1 함량 반응표면 변화는 도 11과 같다.
하기의 표 18은 반응표면분석의 중심합성계획에 근거한 복합액의 발효조건을 달리한 발효물의 진세노사이드 함량에 대한 실험값을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00011
하기의 표 19는 복합액의 발효조건을 달리한 발효물의 진세노사이드 함량값에 대한 예측된 이차다항식의 회귀계수와 t값 를 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00012
하기의 표 20은 복합액의 발효조건에 대한 회귀분석 결과를 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00013
하기의 표 21은 능선분석에 의해 예측된 복합액의 최적발효조건을 위한 예측된 값을 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00014
복합액의 발효조건별 진세노사이드 Re 함량은 표 18에 나타내었고, 이를 회귀분석하여 본 결과 회귀식의 R2는 0.9823으로 1% 이내의 수준에서 유의성이 인정되었고, 회귀식은 표 19과 같다. 아노바(ANOVA)분석을 통한 적합결여도의 P값은 0.0591이므로 모형에 대한 적합성이 인정되었다(표 19). 발효조건의 영향은 표 20에서와 같이 발효시간의 큰 영향을 받고 있는 것으로 나타났으나, 부원료의 농도에는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다. 또한 발효시간과 부원료 농도의 발효조건에 따른 진세노사이드 Re 함량의 반응표면분석에서 예측된 정상점이 최저점으로 진세노사이드 Re의 최저값은 19.12 ㎍/ml이었고, 이때의 발효조건은 발효시간 18.52일, 부원료 농도 0.42%이었다(표 21). 진세노사이드 Re의 발효조건에 따른 반응표면에서 볼 때 발효시간이 길수록 함량이 감소하는 것으로 나타났다(도 12).
발효조건에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 Rb1 함량을 측정한 결과는 196.30 ∼251.82 ㎍/ml의 범위로 나타났으며(표 18), 이를 이용한 회귀식은 표 19에 나타내었다. 반응표면 모델의 회귀식의 R2 값은 0.8527로 확인되었으며, 아노바(ANOVA) 분석을 통한 적합결여도의 P값은 0.0725이므로 반응표면 모형에 대한 적합성이 인정되었다(표 19). 발효시간에 큰 영향을 받고 있었으며, 다음으로 부원료 농도의 영향을 받는 것으로 나타났다(표 20). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 정상점은 최저점으로 구하였고, 진세노사이드 Rb1의 최저값은 190.87 ㎍/ml였으며, 이때의 발효조건은 발효시간 19.14일, 부원료 농도 0.55%로 나타났다(표 21) 반응표면을 통한 발효조건에 따른 홍삼농축액 발효물의 진세노사이드 Rb1 함량 변화는 도 13과 같다.
발효조건에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 Rd의 함량은 49.50∼57.03 ㎍/ml의 범위로 나타났으며(표 18), 이를 바탕으로 한 진세노사이드 Rd 함량의 회귀식은 표 19와 같고 R2 값은 0.8527으로 1% 이내의 수준에서 유의성이 확인되었다. 아노바(ANOVA) 분석을 통한 모형에 대한 적합성을 검증하기 위해서는 적합결여도의 P값은 0.0459로 나타나 모형의 적합성이 인정되지 않았다(표 19). 발효조건에 대한 영향은 표 20에서와 같이 발효시간에서 영향을 크게 받고 있는 것으로 나타났으며, 부원료 농도의 영향은 낮은 것으로 나타났다. 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석결과 임계점이 최대점이 아닌 안장점으로 나타났으며, 능선분석을 하여 최적점을 산출한 결과 최댓값은 56.95 ㎍/ml이며, 이때의 발효조건은 발효시간 12.66일, 부원료 농도 1.99%으로 나타났다(표 21). 반응표면을 통한 발효조건에 따른 홍삼농축액 발효물의 진세노사이드 Rd 함량의 변화는 도 14와 같이 발효시간이 길어질수록 함량이 증가하는 경향을 나타내었다.
발효조건별로 처리된 복합 발효물의 진세노사이드 Rg3 함량은 124.11∼169.42 ㎍/ml의 범위로 나타났으며(표 18), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 19와 같다. 진세노사이드 Rg3 함량에 대한 R2값은 0.9453으로 높은 신뢰도를 보였으며, P값은 1% 이내 유의수준을 보였다. 진세노사이드 Rg3 함량 값의 모형에 대한 적합결여도의 P값은 0.1295로 나타나 모형이 적합한 것으로 나타났다(표 19). 발효조건에 대한 영향에서 진세노사이드 Rg3 함량의 경우 발효시간>부원료 농도 순으로 두 조건 모두에서 영향을 받고 있는 것으로 나타났다(표 20). 발효조건에 따라 반응표면모델로 예측된 회귀분석 결과 정상점이 최대점으로 나타났으며, 최적점을 산출한 결과 진세노사이드 Rg3 함량의 최대값은 168.24 ㎍/ml이고 이때의 발효조건은 발효시간 12.38일, 부원료 농도 1.29%로 나타났다(표 21). 실험조건에 따라 얻은 홍삼농축액 발효물의 진세노사이드 Rg3 함량에 대한 반응표면은 도 15에 나타내었다.
발효조건에 따른 복합 발효물의 진세노사이드 컴파운드 K 함량은 54.70∼106.93 ㎍/ml의 범위로 나타났으며(표 18), 이를 바탕으로 한 회귀식은 표 19와 같으며, 이 모델에 대한 회귀식의 R2 값은 0.9802로 1% 이내의 유의성이 인정되었다. 나노바(ANOVA)분석 결과는 표 19와 같다. 진세노사이드 컴파운드 K 함량을 위한 발효조건의 모형에 대한 적합경여도의 P값은 0.2391로 나타나 모형이 적합한 것으로 나타났다(표 19). 진세노사이드 컴파운드 K 함량은 발효시간에서 아주 큰 영향을 받고 있는 것으로 나타났으며, 설정된 범위내에서 부원료의 농도는 영향을 받지 않는 것으로 나타났다(표 20). 표 21과 같이 진세노사이드 컴파운드 K 함량의 예측된 정상점은 안장점으로 능선분석을 한 결과 최대값이 108.30 ㎍/㎖이었고, 이때 발효시간 19.71일, 부원료 농도 1.26%이었다. 홍삼농축액 발효물의 진세노사이드 컴파운드 K함량의 발효조건에 따른 반응표면에서 볼 때 발효시간이 길어질수록 함량이 증가하는 것으로 나타났다(도 16).
(3) 최적 발효조건의 예측
복합액의 발효를 통하여 발효물의 유효성분중 유리시알산과 진세노사이드 전환을 위한 복합액의 최적 발효조건을 설정하기 위하여 발효적 특성, 진세노사이드 함량 등을 모두 만족시켜주는 최적 발효조건을 얻고자 각 반응표면을 수퍼임포징(superimposing)하여 도 17의 겹쳐진 부분으로 나타났다. 이들 겹쳐진 부분을 산정하여 표 22에 최적 발효조건을 나타내었다. 홍삼농축액의 최적 발효조건 범위는 발효시간 12∼16일 및 부원료 농도 1.0∼1.8%로 나타났다. 따라서 이와 같은 예측 결과에 대한 모델식의 신뢰성을 확인하기 위하여 예측된 최적 조건 범위 내에서 임의의 조건 즉, 발효시간 14일 및 부원료 농도 1.5%을 대입하여 실제 복합액의 유산발효를 실시하고, 복합 발효물의 발효적 특성, 진세노사이드 함량 및 유리 시알산 함량을 측정한 결과 예측된 값들과 유사한 수준으로 비교되었다(표 23).
하기의 표 22는 수퍼임포징(superimposing) 반응표면에 의한 복합액의 최적 발효를 위한 발효조건 범위 예측을 보여준다.
발효조건 예측된 조건 범위
발효시간(day) 12~16
발효 부원료 농도(%) 1.0~1.8
하기의 표 23은 복합액의 최적발효조건의 예측된 조건 값과 실측된 조건 값에서의 비교를 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00015
실시예 4. 유산균 발효 전후 복합액의 유효성분 함량 비교
본 발명이 추구한 바다제비집의 효소적 분해에 의한 효소분해물과 홍삼을 혼합하여 조성한 복합액에 신규한 유산균 락토바실러스 프란타럼(Lactobaciilus plantarum) DU.LAB.H01에 의하여 최적발효 조건으로 발효되었을 때 발효 전후의 복합액내 유효성분 변화를 조사한 결과는 표 24와 같다. 또한, 이들을 HPLC로 분석한 크로마토그램은 도 18과 같다. 유효성분 중 바다 제비집 원료내 유리 시알산의 함량은 0.09 mg/ml 이었으나 이를 최적 조건에서 효소처리후 0.43 mg/ml으로 증가하여 약 4.8배 이상 증가하는 것으로 나타났고 홍삼과 함께 복합액을 조성한 후 유산균으로 발효 하였을 때 0.52 mg/ml으로 나타나, 효소처리액의 함량대비 약 1.2배 정도로 미미한 증가를 보였으나, 원료내 함량 대비 5.7배 함량 증가가 나타나 발효에 의한 유리 시알산 함량 증가도 수반되었다. 또한 홍삼을 함유한 복합액의 진세노사이드중 Rg1, Re, Rb1 등은 원료 복합액내 함량보다 발효후 급격한 함량의 감소를 보였다. 이는 홍삼내 주요 진세노사이드의 생물전환에 의하여 분해하여 다른 진세노사이드로 전환된 것으로 생각된다. 반면 Rg3와 컴파운드 K의 함량은 복합액내 함량에 비하여 발효 후 함량이 각각 약 2.99배와 2.90배 증가하여 위의 주요 진세노사이드가 미량의 특정 진세노사이드로 전환된 것으로 추정된다. 따라서 본 발명에서 사용한 효소처리와 신규한 유산균을 사용하여 최적 조건에서 발효 하였을시 이들 특정성분의 함량 증가를 기대 할 수 있다.
하기의 표 24는 바다 제비집 효소 전후 유리 시알산 함량과 복합액의 유산균 발효전후의 유효성분 변화를 보여준다.
Figure 112017131352917-pat00016
실시예 5. 복합 발효물의 면역 활성능
(1) 세포 독성
발효홍삼액, 바다제비집 가수분해물, 복합 발효물 등이 대식세포의 증식능에 미치는 영향을 측정하기 위해 RAW 264.7 세포에 이들 각각을 농도별로 처리하여 세포 독성을 MTT 검사를 이용하여 측정하였다. 그 결과 세포의 생존율은 도 19에서 보는 바와 같이 대조군과 비교시 모든 농도에서 차이가 나타나지 않음을 알 수 있었으며, 통상적으로 세포 MTT 반응에서 80% 이상의 생존율을 보이는 경우 세포 독성이 없는 것으로 판단되는데, 발효홍삼액, 제비집 가수분해물 및 복합 발효물은 25, 50, 100 μg/ml 농도에서 모두 90% 이상의 세포 생존율을 나타내어 세포독성에 큰 영향을 미치지 않아 독성이 없는 안전한 것으로 확인되었다.
(2) T세포 증식능
비장은 혈액으로부터 항원을 수집하며, 항원에 의해 자극을 받은 후에 림프구의 분화가 이루어지는 주요 림프기관으로 비장 내 림프구의 증식을 면역 시스템에서 매우 중요한 의미를 갖는다. 우리 몸의 전체 림프구 중 비장에 분포되어 있는 림프구는 T세포가 60%, B세포가 30% 정도로 T세포의 비율이 높다. T세포는 외부 이물질이 체내로 유입되면 항원에 특이적 반응성을 보여 직접 면역반응에 관여하는 세포성 면역반응을 일으킨다. 본 발명에서는 T세포주인 Molt-4 세포에 발효 홍삼액, 바다제비 효소 분해물, 복합 발효물 시료를 25, 50, 100 μg/ml의 농도로 처리하여 증식능을 측정한 결과를 도 19에 나타내었다. 그 결과 발효 홍삼액의 경우 모든 농도에서 대조군에 비해 생존율이 증가하였고, 50 μg/ml 농도에서 생존율이 가장 높게 증가하였다. 제비집 가수분해물의 경우 또한 모든 농도에서 대조군보다 높은 생존율을 보였으며, 100>50>25 μg/ml 순으로 농도 의존적으로 T세포 증식능이 증가하는 것으로 나타났다. 또한 복합 발효물을 처리한 경우는 발효홍삼액과 제비집 가수분해물을 각각 단독처리 한 것보다 생존율이 높은 것으로 나타났으며, 50 μg/ml의 농도는 대조군에 비해 15% 증가하였으며, 양성 대조군인 Con A를 처리한 것과 유사한 증식을 보였다.
(3) NO(Nitric oxide) 생성량
대표적인 활성 산소 중 하나인 Nitric oxide(NO)의 생성은 면역반응에 있어 중요한 역할을 하며, 과잉 생산 시 산화적 스트레스 상태를 유발하여 세포 손상의 원인으로 작용한다. 발효홍삼액과 제비집 가수분해물 및 이들 혼합물이 RAW 264.7 세포에 LPS로 유도한 NO의 생성에 미치는 영향을 조사하였다. 각각의 시료를 다양한 농도로 전 처리하고 LPS로 자극하였다. 24시간 후에 세포 상층액에서 NO의 생성을 측정한 결과 LPS로 자극한 대조군에 비해 모든 시험군에서 농도 의존적으로 NO 생성이 감소하고 있음을 알 수 있었다(도 20) 또한 발효홍삼액과 제비집 가수분해물 단독처리군에 비해 복합 발효물을 처리한 군에서 NO의 생성을 더욱 효과적으로 저해하였다. 홍삼과 발효홍삼의 경우 NO의 생성을 억제하는 것으로 보고되어 있다.
(4) TFN-α 생성 억제
LPS에 의해 유도되는 염증사이토카인인 TFN-α의 생성을 억제 시키는지를 조사하기 위하여 시료와 LPS를 RAW 264.7 세포에 각각 처리한 다음 24시간 후 LPS에 의해 활성화된 세포로부터 분비되는 cytokine의 양을 측정하였다. 그 결과 도 21과 같이 LPS 단독처리군에서의 TFN-α는 96.71 pg/ml로 증가치가 보였으며, 100 ㎍/l 농도의 발효홍삼액에서는 75.9 pg/mL, 제비집 가수분해물에서는 76.41 pg/mL, 복합 발효물에서는 73.78 pg/mL의 생성량을 보여 시료 처리군에서 LPS 단독처리군보다 TFN-α의 생성을 억제하는 것으로 나타났다.
(5) IL-2 생성 억제
IL-2는 주로 T 세포 확산 인자로서 활성화된 T 림프구에 의해 분비되거나 활성화된 T cell의 증식에 필수적인 cytokine로 알려져 있다. 자극제 LPS의 유도에 의해 면역반응의 과정 중 IL-2의 생성은 도 22에 나타내었으며, 복합발효물>발효홍삼액>바다제비집 가수분해물의 처리군 순으로 LPS 단독처리군보다 낮은 분비량을 나타내어 IL-2의 생성이 억제됨을 확인하였다.
(6) IL-6 생성 억제
IL-6은 B-cell이 플라즈마 세포로의 분화 촉진, Ig의 생성유도 및 T-cell의 분화 증식, 항체의 분비자극 등에 관여하며 염증 부위에서 수치가 급격히 증가되는 특징을 보인다. 발효홍삼액과 제비집 가수분해물 및 이들 혼합물의 IL-6 생성량을 측정한 결과는 도 23과 같이 LPS 단독처리군이 73.20 pg/ml의 생성량을 보였으며, 발효 홍삼액 시료군은 56.37 pg/ml, 바다제비 효소 분해물군은 59.76 pg/ml, 복합 발효물군은 53.38 pg/ml의 생성량을 보여 LPS 단독처리군보다 낮은 함량을 나타내었다. 따라서 모든 시료 처리군에서 IL-6의 생성량이 감소되었으며, 특히 발효홍삼액과 복합발효물 처리군이 IL-6 생성량 감소에 미치는 영향이 큰 것으로 나타났다.
(7) L-10의 생성 억제
IL-10은 IL-1β나 IL-6 및 TNF-α의 분비를 조절하여 면역 조절작용에 관여하는 것으로 알려져 있다. 또한 전 염증성 cytokine들이 과량 분비되어 IL-10과 균형을 이루지 못할 경우, 숙주의 생존력에 영향을 줄 수 있으므로 염증반응에서 IL-10의 분비는 매우 중요하다. LPS(2 ㎍/ml)와 함께 100 ㎍/ml 농도의 발효 홍삼액과 제비집 가수분해물 및 복합발효물 각각이 포함된 배지에 RAW 267.4 cell을 24시간 동안 배양한 결과 LPS로 인한 IL-10 생성증가를 각각의 시료 처리군이 복합발효물 > 발효 홍삼액 > 제비집 효소분해물 순으로 감소시켰다(도 24).
한국생명공학연구원 KCTC13411BP 20171204

Claims (5)

  1. (1) 바다제비집에 물을 0.7~1.5:50~150(w(g):v(ml)) 비율로 가하여 분산 및 팽윤시킨 바다제비집 분산액을 준비하고, 상기 준비한 분산액에 400~500 LAPU/ml 농도의 플라보르자임 500 MG를 7~23%(v/v) 첨가한 후 40~60℃에서 90~180분 동안 가수분해하는 단계;
    (2) 상기 (1)단계의 가수분해한 바다제비집 효소 분해물에 40~60 °Brix의 홍삼농축액을 1~10%(w(g)/v(ml))와 55~70 °Brix의 바나나 농축액을 1.0~1.8%(v/v) 첨가한 후 70~95℃에서 10~30분 동안 가열하여 효소를 불활성화시켜 복합액을 준비하는 단계; 및
    (3) 상기 (2)단계의 준비한 복합액에 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) DU.LAB.H01 균주(기탁번호: KCTC 13411BP)를 30~45℃에서 12~16일 동안 발효하는 단계; 를 포함하여 제조하는 것을 특징으로 하는
    락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물의 제조방법.
  2. 삭제
  3. 삭제
  4. 삭제
  5. 제1항의 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물의 제조방법으로 제조된 락토바실러스 프란타럼(Lactobacillus plantarum) 균주를 이용한 바다제비집-홍삼 복합 발효물.
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