KR100587653B1 - 상황버섯 자실체 추출물 및 이를 포함하는 항암면역증강활성용 기능성 된장 - Google Patents
상황버섯 자실체 추출물 및 이를 포함하는 항암면역증강활성용 기능성 된장 Download PDFInfo
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Abstract
본 발명은 상황버섯(Phellinus linteus) 자실체 추출물 및 이를 포함하는 항암면역 증강활성용 기능성 된장에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수율을 향상시킨 상황버섯 자실체 추출물과 이를 일정 농도로 농축한 다음 된장 제조과정 중에 첨가하여 숙성시킴으로서 된장 자체가 갖고 있는 항암면역활성을 강화시킨 항암면역 증강용 기능성 된장에 관한 것이다.
본 발명의 상황버섯 자실체 추출물은 상황버섯(Phllinus linteus) 자실체에 알칼리성 첨가제를 더 포함시키고 이를 열수추출하여 제조되며, 본 발명의 실시예에서는 알칼리성 첨가제로 소뼈회분을 채택하고 있다. 또한, 본 발명의 항암면역 증강활성용 기능성 된장은 상황버섯 자실체 추출물, 쌀코지, 콩코지 및 소금을 포함하여 제조된다.
본 발명에 따르면 열수추출과정에 알카리성 첨가제로 소뼈회분을 이용함으로써 상황버섯 자실체 추출물로부터의 수율을 향상시킬 수 있게 되며. 이렇게 수율이 향상된 상황버섯 자실체 추출물을 포함하도록 제조된 된장은 항암면역활성이 증가된 것을 확인할 수 있다.
상황버섯, 소뼈회분, 된장, 항암면역
Description
본 발명은 상황버섯(Phellinus linteus) 자실체 추출물 및 이를 포함하는 항암면역 증강활성용 기능성 된장에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 수율을 향상시킨 상황버섯 자실체 추출물과 이를 일정 농도로 농축한 다음 된장 제조과정 중에 첨가하여 숙성시킴으로서 된장 자체가 갖고 있는 항암면역활성을 강화시킨 항암면역 증강용 기능성 된장에 관한 것이다.
된장은 곡류를 주식으로 하는 한국인에 있어 곡류에 부족한 제한 아미노산이 콩에 골고루 함유되어 있어 곡류와 된장을 동시에 섭취하면 단백질의 보충효과에 의한 최고의 단백질 급원이 되는 전통식품이다. 된장은 콩에 함유된 물질과 발효과정 중에 생성되는 isoflavone과 phytic acid 등 다양한 물질들에 의한 항암효과, 혈중 지질 및 콜레스테롤 대사 개선, 그리고 항산화 활성 등 우수한 생리활성을 발휘하는 건강식품임이 규명되고 있다. 그러나 된장 제조공정 중의 하나인 메주 발 효시에 공기 중에 부유 중인 Aspergillus flavus와 Aspergillus parasiticus 곰팡이 오염을 통해 강력한 간암 유발물질인 alfatoxin 침착이 유발될 수 있어 위생적 측면에서 매우 중요한 요소로 인식되고 있다. Aflatoxin이 메주 발효 중에 일단 생성되면 콩 내부로 침투하여 300℃ 내외에서 분해되는 열 저항성을 갖고 있어 일반적인 식품조리 및 가공으로는 분해 및 파괴가 불가능하기 때문에 Aflatoxin 생성을 줄이는 가장 좋은 방법은 생성곰팡이의 오염을 원천적으로 억제하는 기술개발이 요구된다.
현대인의 식생활습관과 환경오염으로 발병율이 증가하고 있는 난치병의 치료에 소요되는 의료비의 과다지출과 한계성 때문에 21세기는 성인병을 기능성 식품의 개발로 치료보다는 예방차원에서 관리하는 것이 최선의 방법으로 인식되고 있다.
상황버섯은 분류학적으로 소나무비늘버섯과(Hymenochaetaceae), 진흙버섯속(Phellinus)에 속하는 백색부후균으로서, 진흙버섯(Phellinus)에 속하는 버섯으로서는 목질진흙버섯(Phellinus linteus), 말똥진흙버섯(P. igniarius), 마른진흙버섯(P. gilvus), 낙엽진흙버섯(P. pini), 참진흙버섯(P. contiguus), 녹슨진흙버섯(P. ferruginosus)을 비롯하여 P. baumi, P. hartigii, P. punctatus, P. ribis, P. rimosus 등의 다수가 존재하고 있으나, 이 중에서 목질진흙버섯이 항암활성이 가장 높은 것으로 보고된 이후 많은 관심의 대상이 되고 있다.
일반적으로 상황버섯 열수추출물은 40% 내외의 당과 10~20%의 단백질로 구성되어 있고, 당 중에서 다당류는 80~90%의 당과 5~20%의 단백질로 이루어져 있으며, 구성 단당류는 glucose가 주이고, 구성아미노산은 aspartic acid, glycine, glutamic acid의 함량이 높은데, 이러한 구성물질의 특징은 다른 약용 버섯류의 열수추출물과 비슷한 양상을 보이고 있는 것으로 보아 상황버섯의 약리활성은 단백다당체의 분자량의 차이에서 나타나는 구조적 중합도와 직쇄구조에 연결된 측쇄구조의 결합양식에 따라 상이하게 나타나는 것으로 추정되고 있다.
지금까지 연구된 상황버섯의 약리작용으로는 소화기계통의 암인 위암, 식도암, 십이지장암, 직장암, 결장암을 비롯한 간암 등의 수술 후 화학요법을 병행할 때 면역기능을 항진시키며, 자궁출혈 및 대하, 월경불순, 장출혈, 오장기능을 활성화시키고 해독작용을 하고, 또한 지질과산화 억제능과 간보호활성 그리고 항돌연변이 효과 등이 보고된 바 있다.
1968년 일본의 국립 암연구소에 Ikegawa 등은 버섯자실체 열수추출물을 sarcoma180 암세포에 대한 항종양 활성을 조사한 결과, 목질진흙버섯(P. linteus)은 96.7%, 송이버섯(T. matsukake)은 91.8%, 구름버섯(C. versicolor)은 77.5%, 표고버섯(L. edodes)은 80.7%라고 보고하여 상황버섯이 일반적으로 많이 이용되고 있는 식용버섯 및 약용버섯 27종 중 가장 우수한 항암활성이 있는 것으로 발표하여 가장 주목 받는 약용버섯이 된 바 있다.
국내의 경우 Chung 등은 Phellinus linteus의 균사배양물로부터 분리한 단백다당체를 100㎎/㎏ 농도로 투여한 후 sarcoma180을 이용하여 측정하였을 때, 복수암에 대한 생존율 증가는 51.5%이고 고형암에 대한 증식저지율은 71.5%라고 보고한 바 있고, 또한 목질진흙버섯 균사체의 열수추출물은 NK 세포기능에 작용하여 숙주의 비특이적 면역능을 증강시킴으로써 항암활성을 나타내며, 또한 마우스에 투여한 결과 LD50은 1,500㎎/㎏ 이상으로 안전성이 있다고 보고하였다. 경구투여에 의한 아급성(30일) 독성시험에서는 mouse나 rat 동물군 모두에서 투여 최대농도에서도 개체간의 체중, 식용 및 탈모 등을 관찰하였을 때 안전한 것으로 조사되었다.
상황버섯의 면역능과 관련하여 Song 등의 보고에 의하면 목질진흙버섯의 항보체 활성에 있어서 자연산 자실체와 인공재배 자실체는 각각 65.77%와 63.94%로 큰 차이가 없었으며, 인공자실체, 배양 균사체와 배양여액은 각각 63.94%, 41.95% 및 21.87%로서 자실체 추출액이 가장 높고, 균사체와 배양여액 순이었다. Lee 등은 목질진흙버섯 자실체의 열수추출 총 분획과 열수추출 에탄올처리 다당류 분획은 각각 30.7%와 85.9%, 배양 균사체의 경우는 UF처리 다당류와 열수추출 에탄올처리 다당류 분획은 각각 85.0%와 80.4%의 항암활성을 나타내었다고 보고하였다. 즉, 저분자인 분획보다 비교적 고분자 분획에서 높은 암세포 증식 억제율을 보임으로서 담자균류의 항종양 효과는 주로 고분자 다당류에 의해 일어나고 있음이 확인되었다.
면역기능 저하로 발병되는 각종 암을 비롯한 성인병은 발병되면 완치가 어렵고, 의료비가 과다 소요되는 문제점이 발생되어 치료보다는 예방차원에서 관리하는 것이 가장 효과적인 방안인 것으로 판명되어, 식용가능한 각종 기능성 소재를 활용한 기능성(영양의약)식품의 개발이 세계적인 연구 추세에 있으며, 이러한 연구의 일환으로 상황버섯의 주요 약리물질인 다당체를 기능성 식품에 활용하려는 활용하려는 시도가 활발히 진행 중에 있다.
이에, 본 발명자는 상황버섯의 주요 약리물질인 다당체를 기능성 식품에 활용하기에 앞서, 고가인 상황버섯으로부터 상황버섯 자실체 추출물의 수율을 향상시 킬 수 있는 방법을 개발하게 되었으며, 기능성 식품으로 면역효과를 인정받은 된장에 수율을 향상시킨 상황버섯 자실체 추출물을 포함시킴으로써 항암면역활성이 강화된 상황버섯 된장을 개발하기에 이르렀다.
본 발명은 소뼈회분을 이용하여 상황버섯 자실체 추출물의 수율을 향상시킨 상황버섯 자실체 추출물을 제공하데 그 목적이 있다.
본 발명의 목적은 상황버섯 자실체를 포함하여 항암면역활성을 향상시키되, 된장의 주 발효 미생물인 Asperfillus oryzae와 Bacillus natto를 starter로 적용하여 속성발효를 가능케하고 곰팡이 독소의 오염을 방지할 수 있도록 한 항암면역 증강활성용 기능성 된장을 제공하는 것이다.
본 발명의 상황버섯 자실체 추출물은 상황버섯(Phllinus linteus) 자실체에 알칼리성 첨가제를 더 포함시키고 이를 열수추출하여 제조되며, 이때 알칼리성 첨가제로는 소뼈회분이 가장 바람직하다. 알칼리성 첨가제로 해조류, 난각, 굴피 등의 분발을 고려해 볼 수 있으나 본 발명에서는 값싸고 시중에서 쉽게 구입할 수 있는 소뼈회분을 선택하고 있다. 상기 소뼈회분은 상황버섯 자실체 수용액에 대하여 2∼3 중량% 함유되도록 한다. 소뼈회분의 첨가로 상황버섯 자실체의 추출물의 수율향상을 기대할 수 있게 된다.
본 발명의 항암면역 증강활성용 기능성 된장은 상황버섯 자실체 추출물, 쌀코지, 콩코지 및 소금을 포함하여 제조된다. 이때, 상황버섯 자실체 추출물 20~26 중량%, 쌀코지 43~49 중량%, 콩코지 20~26 중량%, 소금 5~11 중량%로 하여 혼합·제조하는 것이 된장의 품질면에서 가장 바람직하다. 특히, 된장발효에 유익한 균으로 알려진 Aspergillus oryzae와 Bacillus natto균을 쌀코지, 콩코지 제조시 starter로 활용하여 Aflatoxin 생성균의 오염을 줄이면서 속성발효를 꾀할 수 있게 하였다.
이하 실시예 및 실험예로서 본 발명을 상세히 설명한다.
[실시예 1] 상황버섯 자실체 추출물 제조
1. 상황버섯(Phllinus linteus) 자실체 1kg을 분쇄기를 이용하여 분쇄한다.
2. 분쇄된 상황버섯 1kg에 물 10L와 소뼈회분 200∼300g을 첨가하여 교반 후 95℃에서 10시간 가열하면서 추출한다.
3. 상기 열수추출물을 실온에서 냉각시킨다.
4. 냉각된 액을 여과지로 여과한 후 농축하여 최종 농도가 10。Brix 되게 조절한다.
상기 실시예 1의 제조방법으로 제조된 상황버섯 자실체 추출물의 수율을 확 인한 결과 표 1과 같았다. 즉, 소뼈회분을 2% 첨가하는 경우 열수추출시에 첨가하지 않는 경우보다 수율이 1.5배 증가됨을 파악 할 수 있다. 표 1에서와 같이 상황버섯 자실체의 열수추출시에 소뼈회분의 첨가량을 수용액에 대해 2∼3 중량%인 것이 바람직하며, 이는 소뼈회분 함량이 2 중량% 미만인 경우 약알칼리용액이 되어 추출수율이 그대지 증가되지 않는 것으로 판단되고 3 중량%를 초과하는 경우 pH10 이상의 강알칼리이면서 무기질의 용해도가 포화상태에 도달되어 추출수율을 증가시키지 못하는 것으로 판단된다.
[표 1] 소뼈회분첨가량에 따른 상황버섯 자실체 열수추출물의 수율
| 회분첨가량(%) | 수율(고형분 Brix) |
| 0 | 12.3 |
| 1 | 14.1 |
| 2 | 18.7 |
| 3 | 18.9 |
| 4 | 18.8 |
| 5 | 18.9 |
[실시예 2] Aspergillus oryzae 및 Bacillus natto를 이용한 쌀코지 및 콩코지 제조
1. 쌀코지의 제조
(1) Aspergillus oryzae 균을 PDA 배지에 접종하여 30℃에서 7일간 배양한 다음 0.5% NaCl과 0.5% tween 80 이 함유된 멸균수로 포자를 수획한 후 잘 교반하여 포자수가 5×106 spore/㎖ 되게 멸균수로 조절한다.
(2) 먼저 쌀을 2회 수세한 후 깨끗한 물에 6시간 수침하고 자연 탈수시킨 다 음 100℃에서 30∼40분 동안 증숙하고 자연냉각한 증숙쌀에 상기의 방법으로 제조된 Aspergillus oryzae 포자를 증숙쌀 대비 0.1 중량%를 골고루 접종한 다음 30℃ 발효실에서 3일간 배양한다.
2. 콩코지의 제조
(1) Bacillus natto균은 NB배지에 접종하여 42℃에서 24시간 진탕배양한 후 최종 균수가 6×108 CFU/㎖ 되게 멸균수로 조절한다.
(2) 먼저 대두를 2회 수세한 후 깨끗한 물에 8시간 수침하고, 자연 탈수시킨 다음 100℃에서 30∼40분간 증숙하고 분쇄한 냉각 증숙 대두에 상기의 방법으로 제조된 Bacillus natto 균을 대두 대비 2 중량% 접종한 다음 42℃에서 24시간 배양한다.
위 실시예 2에서는 Aflatoxin 생성균의 오염을 억제시키면서 속성발효를 위해 Aspergillus oryzae 및 Bacillus natto를 사용하고 있다. 오염억제여부는 후술하는 실험예 3의 세포독성실험결과로부터 확인할 수 있다.
[실시예 3] 상황버섯 된장 제조
1. 상기 실시예 1, 2에서 제조된 상황버섯 자실체의 열수추출물 23%, 콩코지 46%, 쌀코지 23%, 소금 8%를 골고루 혼합한다.
2. 잘 혼합된 된장을 20∼25℃로 유지되는 발효기에서 40일 이상 숙성한다.
본 발명에서는 항암면역 증강활성용 기능성 된장의 항암면역활성 및 그 증강효과 등의 확인을 위해 하기와 같은 실험을 하였다.
상황버섯 된장의 항암면역활성을 실험하기 위한 실험방법
(1) 실험재료
상기 실시예 3에서 제조된 상황버섯 된장을 열수추출한 후 감압 농축시켜 동결건조하여 사용하였다.
(2) 실험동물
한국화학연구소로부터 구입한 20±2g의 3주령인 수컷 ICR 생쥐를 1주일간 안정화시킨 후 생존율, 종양억제율 및 면역세포 증식능을 위한 실험에 사용하였다. 시료 투여후 암세포를 이식한 전투여 실험에서 10마리 또는 그 이상을 실험군으로 하였다. 실험기간 중 사료(생쥐용)와 물은 자유롭게 먹게 하였고 실온은 24±2℃를 유지하였다.
(3) 종양세포의 배양
복수형 sarcoma-180 종양세포를 무균적으로 채취하여 4℃ Hank's balanced salt solution(HBSS)으로 세척한 후 1×106cell/㎖의 농도로 ICR 생쥐 복강에 계대 배양하여 사용하였다. 계대 배양된 sarcoma-180을 pasteur pipets으로 복강내에서 채취하여 50㎖ conical tube에 넣은 후 1200rpm에서 10분간 원심분리하고 HBSS 완충용액으로 3회 세척한 다음 복수암 및 고형암의 발생에 사용하였다.
상황버섯 된장의 항암면역활성을 실험한 구체적인 실험예
[실험예 1] 복수암에 대한 항암실험
(1) 실험방법
평균무게 25.1±0.2g의 3~4주령된 ICR 생쥐 10마리를 24±2℃의 배양실에서 1주일간 안정화시키며 상황버섯된장 시료를 생리식염수에 녹여 1일 200㎎/㎏은 경구로 1주일간 전투여 한 뒤 3×105cell/㎖의 sarcoma-180을 복강내에 이식하였다. 이식후에는 1일 150~200㎎/㎏의 시료를 같은 방법으로 투여하며 대조군과 비교하여 평균생존일수(MST)와 생존일수연장율(ILS)을 종양 이식 30일 후 판정하였다. 생존일수연장율(ILS %)은 [피검체투여군의 평균생존일수/비투여군의 평균생존일수 ×100]으로 계산하였다.
(2)복수암에 대한 항암효과
상황버섯된장의 열수추출물을 일주일간 전투여한 후 3×105cell/㎖의 sarcoma-180 종양세포를 ICR 생쥐에 이식하고 계속 시료를 투여한 복수암 실험결과는 표 2에 나타낸 것과 같이 대조군의 평균생존일수(MST)가 19.5일이며 상황버섯된장 150mg/kg 및 250mg/kg 투여군은 각각 30.5일과 33.7일로, MST가 11일과 14.2일 정도 연장되어 생존일수연장율이 156%와 172%로 나타났다. 그리고 30일 까지 생존 한 생쥐도 상황버섯된장 처리구에서 5-6마리나 되었다. 이러한 결과는 상황버섯된장 추출물을 처리한 흰쥐에서 비교적 우수한 항암활성을 보여줌을 알 수 있었다.
[표 2] 상황버섯된장 열수추출물의 sarcoma-180 복수암에 대한 항암효과
| Treatment | Dose (㎎/㎏) | Route | MST(day) (평균생존일수) | ILS(%) (생존일수연장율) | 30 day survivors (30일간 생존수) |
| 대조군 | saline | p.o. | 19.5 | - | 0/10 |
| 상황버섯된장 | 150 | p.o. | 30.5 | 156↑ | 5/10 |
| 상황버섯된장 | 250 | p.o | 33.7 | 172↑ | 6/10 |
[실험예 2] 고형암에 대한 항암실험
(1)실험방법
평균무게 24.8±0.2g의 3~4주령된 수컷 ICR 생쥐 10마리를 복수암과 동일한 조건으로 전처리 한 후 고형암 유발을 위하여 2.5×106cell/㎖의 sarcoma-180을 ICR 생쥐의 오른쪽 서혜부에 피하 이식하였다. 이식 후 복수암과 동일하게 상황버섯된장 시료를 투여하고 30일 경과 후 발생된 고형암을 적출하여 중량을 측정하고 종양증식억제율을 구하여 이를 항암효과의 지표로 하였다. 종양증식억제율(IR %)는 [(1-피검체투여군의 평균종양중량/비투여군의 평균종양중량) ×100]으로 계산하였다.
(2) 고형암에 대한 항암효과
복수암과 동일한 조건하에서 2.5×106cells/㎖의 sarcoma-180 종양세포를 이식한 우 실시한 고형암 실험에서는 표 3에 나타낸 것과 같이 대조군의 평균종양의 무게가 1.70±0.25g이며 상황버섯된장 150mg/kg 및 250mg/kg 투여군은 각각 0.45±0.25g 과 0.37±0.21g으로서 종양저지율이 73.5% 와 78.2%로 매우 높았다.
[표 3] 상황버섯된장 열수추출물의 sarcoma-180 고형암에 대한 항암 활성
| Treatment | Dose (㎎/㎏) | Route | Tumor weight (종양무게, g) | Inhibition rate (저해율, %) |
| 대조군 | saline | p.o. | 1.70±0.25 | - |
| 상황버섯된장 | 150 | p.o. | 0.45±0.25 | 73.5 |
| 상황버섯된장 | 250 | p.o | 0.37±0.21 | 78.2 |
[실험예 3] 세포독성실험
(1)실험방법
상황버섯된장 시료를 사람의 다양한 암 세포주인 A549(사람폐암유래세포주), SKOV-3(사람난소암유래세포주), SKMEL-2(사람색소세포암유래세포주), HCT 15(사람결장암유래세포주), XF 498(사람중추신경계암유래세포주) 등에 대한 세포독성을 측정하였다. 이들 세포주들을 실험에 사용하기 위하여 trypsin-EDTA용액으로 부착면으로 부터 분리시키고, 96- well flat-bottom microplate(Falcon)에 well 당 세포수가 4~5×104cells/㎖가 되도록 분주하였다. 분주된 세포들을 CO2 배양기내에서 24시간 배양하여 바닥면에 부착시킨 후 aspirator로 배지(RPMI 배지)를 제거하고, 배지에 시료를 6가지 농도(6.25, 12.5, 25, 50, 100 및 200㎍/㎖)의 log-dose로 희석된 시료 용액들을 암세포가 들어 있는 well에 각각 100㎕씩 3배수로 넣어주고 46시간 동안 더 배양한 후 sulforhodamine-B(SRB) assy법에 따라 약물을 가할때의 세포수(Tz)와 약물이 들어 있지 않은 배지를 가하여 48시간을 배양했을 때의 세포수 (C) 및 각 농도의 약물과 함께 48시간 배양했을 때의 세포수(T) 등을 측정하였다. 세포증식율(%)은 [(T-Tz)/(C-Tz) ×100]으로 계산하였다.
(2) 세포독성 여부
상황버섯된장의 열수추출물에 대한 SRB assay에서 6.25㎍/㎖로부터 200㎍/㎖까지의 농도로 A549, SKOV-3, SKMEL-w, HCT 15, XF 498 등 5종에 대하여 실험한 결과 표 4에 나타낸 것과 같이 상황버섯된장의 열수추출물들은 모든 암세포에 대한 직접적인 세포독성을 나타내지 않음을 확인하였다. 이런 결과는 식품소재로서 장기간 섭취해도 부작용이 발생할 위험이 거의 없다는 것을 의미한다.
[표 4] 각종 암세포주에 대한 상황버섯된장 열수추출물의 세포독성
| 시료명 | 농도 (㎍/㎖) | 각종 암세포주의 증식율 | ||||
| A549 (폐암세포주) | SK-OV-3 (난소암세포주) | SK-MEL-2 (색소세포암) | XF498 (중추신경세포암) | HCT15 (결장세포) | ||
| 상황 버섯 된장 | 6.25 | 102.9 | 103.4 | 105.2 | 100.8 | 109.1 |
| 12.5 | 102.3 | 103.2 | 104.7 | 104.9 | 108.2 | |
| 25.0 | 101.4 | 102.5 | 102.8 | 100.4 | 105.5 | |
| 50.0 | 100.7 | 101.2 | 101.7 | 101.5 | 103.6 | |
| 100.0 | 99.8 | 99.2 | 100.2 | 100.9 | 101.2 | |
| 200.0 | 98.6 | 99.5 | 99.4 | 99.9 | 100.3 | |
[실험예 4] 대식세포의 spreading ability 측정
(1) 실험방법
복강 대식세포를 1×105cell/well로 조절하여 96-well plate에서 상황버섯 시료와 혼합하여 37℃에서 48시간 동안 배양한 후 대식세포의 위족형성을 관찰하였으며, 활성은 300마리의 대식세포를 기준으로 백분율로 표시하였다.
(2) 상황버섯된장 열수추출물의 대식세포 활성
상황버섯된장의 열수추출물을 50, 100, 200㎍/㎖ 농도로 조절하여 MTT법에 따라 대식세포의 활성을 조사한 결과는 표 5와 같다. 상황버섯된장 열수추출물 처리구는 농도의존적으로 대식세포의 proliferative activity와 spreading activity가 증가하였다.
[표 5] 상황버섯된장 열수추출물의 대식세포 활성영향
| Treatment(㎍/㎖)a | Proliferative activityb | Spreading abilityc | |
| 대조구 | 1.00±0.14d | 1.00±0.15d | |
| 표준품LPS(0.5) | 3.75±0.35* | 5.01±0.52* | |
| 상황버섯된장 | 50 | 2.52±0.18*e | 3.71±0.17* |
| 100 | 3.51±0.38* | 4.56±0.12* | |
| 200 | 3.81±0.24* | 5.14±0.54* | |
| aMacrophages were incubated with Samples for 48h, and their functionality was assayed. bProliferative activity is expressed as the ratio of the test absorbance to the control absorbance at 570nm. cSpreading ability was expressed as a percentage of spreading macrophages in a total of 300 macrophages. dResults are expressed as the mean ±SD of four independent experiments performed in triplicate. e*P＜0.01, significantly different from the control. | |||
[실험예 5] 대식세포의 식작용 활성 측정
(1) 실험방법
복강 대식세포(1×106cell/well)를 46-well culture plate에서 상황버섯된장 시료와 혼합하여 48시간 동안 배양한 후 FITC-latex microbead와 상황버섯된장 시료를 처리한 다음 37℃에서 90분간 배양하였다.
배양된 세포를 2% FBS가 함유된 phosphate-PBS용액으로 세척한 다음 식작용 활성을 flurorescence spectrophotometer(FL600, Bio-tek)를 사용하여 측정하였고, 양성대조군으로는 LPS를 이용하였다.
(2) 대식세포의 식작용
상황버섯된장 열수추출물이 대식세포의 식작용에 어떤 영향을 미치는가를 형광분광 광도계를 사용하여 FITC-altex microbead의 internalization으로 측정한 결과는 표 6과 같다.
상황버섯된장 열수추출물 투여군은 대식세포의 식작용이 농도의존적으로 유의성 있는 효과가 인정되었고, 200㎍/㎖ 처리시에는 표준품인 LPS 0.5㎍/㎖ 처리구보다 우수한 식작용이 확인되었다. 본 실험에 사용된 상황버섯된장은 식작용 활성에 의한 면역증진효능이 확인되어 기능성식품소재로서 활용가치가 높을 것으로 판단된다.
[표 6] 상황버섯된장 열수추출물의 대식세포 식작용영향
| Treatment(㎍/㎖) | Macrophage phagocytosisa | |
| 대조구 | 252.2±18.4b | |
| 표준품LPS(0.5) | 638.4±62.5* | |
| 상황버섯된장 | 50 | 520.1±61.7*c |
| 100 | 598.2±55.3* | |
| 200 | 581.7±25.4* | |
| aMacrophages were incubated for 48h, and then cells were washed twice and further incubated with FITC-latex microbeads for 90 min. The phagocytic capability of macrophages was measured using a fluorescence spectrophotometer. Macrophage phagocytosis is expressed as fluorescence intensity. bResults are expressed as the mean ±SD of four independent experiments performed in triplicate. c*P＜0.01, significantly different from the control. | ||
[실험예 6] Nitrite 분석
(1) 실험방법
거식세포 또는 RAW 264.7 cells을 phenol red-free RPMI 1640 배지로 5×105/㎖의 농도로 희석하고 시료를 가하여 5% CO2 배양기에서 24시간 배양한 후 배양액내의 NO를 측정하기 위하여 배양상층액을 Griess시약과 혼합한 후 상온에서 10분 방치 후 550㎚에서 흡광도를 측정하며, NO2의 농도는 NaNO3를 이용하여 표준곡선을 만들고, 이와 비교하여 NO의 생성량을 정한하였다.
(2) Nitric oxide 생성능
대식세포는 외부 항원물질에 대한 1차 방어를 담당하는 면역세포로서 반응 중간대사물질, cytokine 및 식작용을 통해 숙주내 항원물질을 제거할 수 있다.
NO가 암세포와 미생물에 세포독성능력을 가지는 생화학적 기작은 미토콘드리 아의 호흡계에 중심적인 역할을 하는 효소와 DNA합성에 관여하는 주요 효소들에 존재하는 Fe를 포함하는 잔기들과 NO가 결합하여 효소적 반응을 저해시키는 것으로 보고되어 있다.
표 7은 상황버섯된장 열수추출물을 50, 100, 200㎍/㎖ 처리시에 NO 생성능을 조사한 결과이다. 시료 투여군에서는 비투여군에 비하여 농도의존적으로 NO 생성이 증가하였고, 100㎍/㎖과 200㎍/㎖를 처리시에는 비처리군에 비하여 각각 약 3배, 5배정도 NO 생성량이 증가하는 것으로 나타났다.
[표 7] 상황버섯된장 열수추출물의 NO 생성능 영향
| Treatment(㎍/㎖) | Nitritea | |
| 대조구 | 4.23±0.21b | |
| 표준품LPS(0.5) | 62.25±4.15* | |
| 상황버섯된장 | 50 | 9.81±0.87*c |
| 100 | 12.97±0.42* | |
| 200 | 21.48±3.52* | |
| aMacrophages were incubated for 24h, and NO production was determined by measuring nitrite accumulation in the incubation medium. bResults are expressed as the mean ±SD of four independent experiments performed in triplicate. c*P＜0.01, significantly different from the control. | ||
[실험예 7] Cytokine 생성량 측정
(1) 실험방법
Cytokine 생성량은 면역학적 방법으로 측정하였다. 복강대식세포(2×106cell/㎖)를 24-well plate에서 6시간 동안 배양한 다음 상등액을 시간별로 수획 하여 sandwich immunoassay(R&D Systems)법으로 IL-1β, IL-6, INF-α의 생성량을 측정하였다.
(2) Cytokine 생성능
상황버섯된장 열수추출물에 의한 대식세포의 cytokine 생성능, 즉 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비에 대한 영향을 조사하기 위하여 복강 대식세포에 각 추출물을 농도별로 처리한 다음 배양 상등액에 분비되는 각종 cytokine 양을 ELISA로 분석하였다(표 8).
시료처리시에 농도의존적으로 배양 상등액에서 TNF-α, IL-1β 및 IL-6의 분비량이 증가되었는데, 특히 200㎍/㎖ 처리시에는 대조군에 비하여 15배 정도 증가하는 특징이 나타났다. 이런 결과는 NO생산량이 증가한 것과 유사한 결과를 보였다. 이러한 cytokine의 분비량 증가는 T 세포가 활성화 되었음을 간접적으로 보여주고 있다.
[표 8] 상황버섯된장 열수추출물의 사이토카인 생성능
| Treatment(㎍/㎖)a | TNF-α(ng/㎖) | IL-1β(ng/㎖) | IL-6(ng/㎖) | |
| 대조구 | 0.71±0.05b | 0.39±0.04 | 0.26±0.01 | |
| 표준품LPS(0.5) | 7.85±0.73* | 3.69±0.21* | 3.85±0.37* | |
| 상황버섯된장 | 50 | 4.69±0.18*c | 2.65±0.27* | 2.02±0.35* |
| 100 | 7.25±0.17* | 3.78±0.38* | 2.734±0.44* | |
| 200 | 10.75±0.24* | 6.25±0.72* | 3.87±0.23* | |
| aMacrophages were cultured for 6h(TNF-α and IL-6) or 12h(IL-1β) in the presence of media alone with composites of LPS. The amount of TNF-α, IL-1β, and IL-6 released to culture medium was measured by immunoassay. bResults are expressed as the mean ±SD of four independent experiments performed in triplicate. c*P＜0.01, significantly different from the control. | ||||
본 발명에 따르면 열수추출과정에서 알카리성 첨가제로 소뼈회분을 이용함으로써 상황버섯 자실체 추출물로부터의 수율을 향상시킬 수 있게 되며. 이렇게 수율이 향상된 상황버섯 자실체 추출물을 포함하도록 제조된 된장은 항암면역활성이 증가된 것을 확인할 수 있다. 또한, 된장의 제조시 된장의 주 발효 미생물인 Asperfillus oryzae와 Bacillus sp.를 starter로 적용함으로써 속성발효와 곰팡이 독소의 오염방지를 기대할 수 있게 된다. 이로써, 본 발명에 의한 기능성 된장은 계속 섭취하는 경우에 암의 예방 및 개선에 유용하게 사용될 수 있다.
Claims (7)
- 상황버섯(Phllinus linteus) 자실체에 소뼈회분을 더 포함시킨 후 열수추출하여 제조되는 것을 특징으로 하는 상황버섯 자실체 추출물.
- 제1항에서,상기 소뼈회분은 상황버섯 자실체 수용액에 대하여 2∼3 중량%인 것을 특징으로 하는 상황버섯 자실체 추출물.
- 제1항 또는 제2항의 상황버섯 자실체 추출물;쌀코지;콩코지; 및,소금;을 포함하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항암면역 증강활성용 기능성 된장.
- 제3항에서,상기 쌀코지는 쌀을 Aspergillus oryzae 균으로 발효시킨 것을 특징으로 하는 항암면역 증강활성용 기능성 된장.
- 제3항에서,상기 콩코지는 대두를 Bacillus natto균으로 발효시킨 것을 특징으로 하는 항암면역 증강활성용 기능성 된장.
- 제3항에서,상기 기능성 된장은 상황버섯 자실체 추출물 20~26 중량%, 쌀코지 43~49 중량%, 콩코지 20~26 중량%, 소금 5~11 중량%로 혼합하여 제조되는 것을 특징으로 하는 항암면역 증강활성용 기능성 된장.
- 삭제
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| KR20150061537A (ko) * | 2013-11-27 | 2015-06-04 | 주식회사 에이치씨바이오텍 | 상황버섯을 이용한 저염된장 및 그 제조방법 |
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