CN110468176A - 一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法包括以下步骤：步骤S1.燕窝的溶胀：将燕窝粉末用去离子水浸泡，然后通过超声、破壁得燕窝混合液；步骤S2.调pH值：调节燕窝混合液的pH值为5～8；步骤S3.酶解：加入菠萝蛋白酶及L‑半胱氨酸，在恒温加热及间歇式搅拌的条件下酶解一段时间；步骤S4.灭活：酶解结束后在沸水浴中灭活6～8min；步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过分离设备进行分离，得清液；步骤S6.浓缩干燥：将清液浓缩、干燥，得燕窝小分子肽。本发明公开的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，具有较高的肽得率，能够提高对燕窝营养成分的利用。
Description
技术领域
本发明涉及小分子肽的制备的技术领域，特别涉及一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法。
背景技术
燕窝，又称为燕菜、燕蔬菜，盛产于我国福建等沿海地区和印度尼西亚、泰国、马来西亚、越南等东南亚地区，是由雨燕科金丝雀属的鸟类在繁殖的季节于悬崖上、洞穴内壁以及屋檐底下用它们的羽毛和它们的分泌物--唾液和稻草混合而筑成的巢穴。
燕窝具有极高的营养价值和药用价值，富含各种蛋白质、糖类及各种微量元素，其中，燕窝富含的蛋白质主要以糖蛋白为主要的存在形式，而且，燕窝的糖蛋白主要以黏蛋白为主。因此，燕窝中的糖蛋白物质具有抗氧化性、预防肿瘤疾病、降低高血压高血脂、提高人体免疫力以及保护关节、治疗风湿性关节炎等有显著作用。明朝著名的医药学家李时珍在他的著作《本草纲目》中就有写到：“燕窝入肺主气，入肾滋水，入胃补脾，补而不燥”。自唐以来，燕窝就因它丰富的营养价值倍受追捧，而现代人更是把燕窝当做一种养生极品。但是，有研究表明，随着人年纪的增长，人体内分泌蛋白酶的能力逐渐下降，其消化吸收能力也下降，因此按照传统方法食用燕窝，其营养物质并不能得到充分利用。
小分子肽是由两个及以上的氨基酸以肽键相连的一种蛋白质片段，具有易吸收的特点，小分子肽早已成为保健品和药物开发的热点。现有技术中，早有人利用生物酶将燕窝酶解成小分子肽来提高燕窝所含营养物质的利用率，如：通过木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、胃蛋白酶酶解燕窝的方法制备小分子肽，而燕窝经过蛋白酶酶解成小分子肽后，不但有利于各种营养物质的吸收，而且其酶解出来的小分子能表现出多种有利于人体健康的生物活性。但是，现有的酶解方法提取率不高，从而使得对燕窝营养物质的利用率不足。
可见，现有技术还有待改进和提高。
发明内容
鉴于上述现有技术的不足之处，本发明的目的在于提供一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，旨在解决现有技术中燕窝酶解制备小分子肽的肽得率不高的问题。
为了达到上述目的，本发明采取了以下技术方案：
一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其中，所述方法包括以下步骤：
步骤S1.燕窝的溶胀：按配比取一定重量份数的燕窝粉末及去离子水，先用一部分去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后倒入破壁机进行破壁，将破壁后的燕窝混合液转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：测燕窝混合液的pH值，并调节燕窝混合液的pH值为5～8；
步骤S3.酶解：加入一定重量份数的菠萝蛋白酶及L-半胱氨酸，在恒温加热及间歇式搅拌的条件下酶解一段时间；
步骤S4.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活6～8min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液浓缩、干燥，得燕窝小分子肽。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S1前还包括步骤S0.燕窝粉末的制备，将干燥的燕窝通过粉碎机粉碎，然后过100目筛，得燕窝粉末。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S1中，燕窝粉末与蒸馏水的质量比为1∶20～40。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S2中，调节燕窝混合液的pH值为6.5～7.5。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S3中，所述菠萝蛋白酶的酶活性大于600000u/g，且添加量为燕窝重量的0.1％～8％。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S3中，酶解的时间为2～4h，恒温加热的温度为50～60℃。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S3中，所述L-半光氨酸的添加量为菠萝蛋白酶重量的1％～10％。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S5中，所述分离设备包括无机陶瓷超滤膜或离心分离机中的一种。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S6中，所述清液采用真空干燥设备进行浓缩、干燥制得燕窝小分子肽。
所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法中，所述步骤S6中，所述清液采用喷雾干燥的方式得到燕窝小分子肽。
有益效果：
本发明提供了一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法通过菠萝蛋白酶酶解燕窝，得到分子量小的小分子肽，更利于消化吸收，提高了对燕窝营养物质的利用率。所述方法中，在酶解体系中添加L-半胱氨酸，能够激活和保护菠萝蛋白酶中的巯基不被氧化，从而提高了酶的活性，提高了酶解燕窝的肽得率；另外，燕窝浸泡溶胀的过程中，采用破壁机对燕窝进行破壁，使得燕窝比表面积更大，更为分散，能与菠萝蛋白酶更好的接触，提高酶解的速度和效率，也提高酶解的肽得率。
具体实施方式
本发明提供一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，为使本发明的目的、技术方案及效果更加清楚、明确，以下举实施例对本发明进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
本发明提供一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S0.燕窝粉末的制备：精细挑选干燥的燕窝，要求燕窝的含水量小于8％，通过粉碎机将燕窝粉碎成粉末，过100目筛，得粒径≦150μm的燕窝粉末。将燕窝制成粉末，更利于燕窝的浸泡和分散。
步骤S1.燕窝的溶胀：按燕窝粉末与去离子水的质量比为1∶20～40配比称取燕窝粉末和去离子水，将燕窝粉末和部分去离子水加入反应器中，浸泡，进行超声振荡，直至燕窝完全溶胀，然后倒入破壁机中进行破壁，得破壁后的透明燕窝液，将破壁后的燕窝液转移至反应器中，并用剩余的去离子水将破壁机中的燕窝液转移至反应器中，防止燕窝损失。将燕窝在水中浸泡溶胀后进行破壁，能提高对燕窝的破壁效率，使后续酶解更充分。同时，燕窝与去离子水的比例也会影响酶解的速度，料液比过高或过低都会影响燕窝与菠萝蛋白酶的接触，从而降低酶解的速度，当燕窝∶去离子水的料液比为1∶20～40时，具有较佳的酶解速度。
步骤S2.调pH值：由于不同产地的燕窝浸泡溶胀后得到的燕窝液的pH值不同，先通过pH计测量燕窝液的pH值，然后根据测得的pH值，通过滴加0.1mol/L盐酸或氢氧化钠溶液调节体系的pH值在5～8之间。调整体系的pH值，主要是因为菠萝蛋白酶的酶解条件需控制pH值在5～8的范围内，体系的pH值太高或太低，都会使菠萝蛋白酶失活。通过大量实验发现，当pH值为5.5～7.5，菠萝蛋白酶对燕窝具有较佳酶解效率和肽得率。进一步地，为了提高菠萝蛋白酶的活性，同时添加L-半胱氨酸，所述L-半胱氨酸为盐酸盐，实验发现，当燕窝液的pH值为6.5～7.5，同时添加菠萝蛋白酶和L-半胱氨酸具有较优酶解效率和肽得率，最优为pH值为7时。
步骤S3.酶解：在搅拌的情况下加入菠萝蛋白酶和L-半胱氨酸，搅拌均匀后恒温加热，进行酶解，加热温度控制在50～60℃，酶解时间为2～4h，酶解过程采用间歇式搅拌，每隔10min搅拌一次，搅拌速度控制为100r/min。由于菠萝蛋白酶在高温下容易失活，而太低温度时酶的活性也会受到抑制，酶解温度控制为50～60℃时，菠萝蛋白酶具有较佳的活性。酶解开始时速度非常快，2h后趋于平缓，4h后基本酶解完成，控制酶解时间在2～4h，具有较高的肽得率。
上述步骤S3中，菠萝蛋白酶的添加量关系到燕窝酶解的速率及肽得率，添加太少，则酶解不彻底，肽得率下降，随着菠萝蛋白酶添加量的增大，酶解速率和肽得率均提高，但是提高到一定程度后，或酶解一段时间后，肽得率维持平衡。当菠萝蛋白酶的活性大于600000u/g时，菠萝蛋白酶的添加量为燕窝重量的0.1％～8％，具有较佳的酶解速率和肽得率。
上述步骤S3中，L-半胱氨酸的添加主要影响菠萝蛋白酶的活性，由于菠萝蛋白酶属于巯基蛋白酶，在保存的过程中容易失活，其分子中的巯基为活性基团，但是巯基易氧化成二硫键使活性被抑制，而添加的半胱氨酸含有巯基，能保护并还原酶的巯基，从而提高菠萝蛋白酶的活性。当L-半胱氨酸的添加量为菠萝蛋白酶的重量的1％～10％时，具有较佳激活和保护酶活性的作用。
上述步骤S3中，菠萝蛋白酶和L-半胱氨酸可以溶解后分别添加，也可以将两者混合溶解后同时添加，混合再添加的效果会更好些，酶解速率和肽得率都会提高。
步骤S4.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活6～8min。灭活主要是通过加热的方式使菠萝蛋白酶失效。
步骤S5.分离：灭活结束后停止加热，冷却至室温，然后将酶解液通过分离设备进行分离，得清液。分离设备可以是无机陶瓷膜分离设备或离心分离设备，但不限于上述两种，只要能实现将小分子肽与杂质及大分子量的物质进行分离提纯的方法即可。所述无机陶瓷膜分离备和离心分离设备均设有多层滤膜，其中包括超滤膜，通过超滤膜后的酶解液能得到分子量小于10000Da的小分子肽。当采用无机陶瓷膜进行分离时，分离效率高，且操作简单，具有较佳的分离效果。
步骤S6.浓缩干燥：将分离后得到的清液进行浓缩、干燥，得燕窝小分子肽。所述清液可采用真空干燥设备进行浓缩干燥，真空条件为：真空度-0.06MPa、温度60～80℃，得到块状小分子肽，碾细可得粉末。也可将清液采用喷雾干燥的方式得到燕窝小分子肽粉末，喷雾干燥条件为：进风温度为180℃，出口温度为100℃，进风量为5m3/min，得到的小分子肽具有较细较均匀的粒径，易于溶解和吸收，但是干燥过程中会损失部分小分子肽。
需要注意的是，整个方法中所用反应容器及搅拌设备均要求非金属材质，由于金属中不可避免会溶出金属或重金属离子，尤其是重金属离子容易造成菠萝蛋白酶失活，需尽量避免重金属离子的影响。
上述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，具有酶解速率快、肽得率高的优点，酶解后的产物经液质联用仪检测，发现为一系列含8～16氨基酸的小分子肽，具有易消化吸收的特点。制备过程中，燕窝溶胀后破壁，能提高燕窝的破壁率，加速后续酶解的速率；添加的L-半胱氨酸，能激活和保护菠萝蛋白酶的活性，使菠萝蛋白酶的添加量少、活性高，从而提高酶解速率及肽得率。本发明中，所述酶解率在酶解2h后，燕窝的酶解程度均能达到60％～70％；酶解结束后经检测分析，所述方法的肽得率达到73％-85％。
需要说明的是，所述酶解速率为在单位时间内燕窝被酶解的量，所述肽得率为：(酶解后清液的总氮量-清液中氨态氮含量)÷燕窝总氮量×100％。
实施例1
一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S0.燕窝粉末的制备：精心挑选干燥的燕窝，燕窝的含水量为小于6％，通过粉碎机将燕窝粉碎成粉末状，过100目筛，得粒径≦150μm的燕窝粉末；
步骤S1.燕窝的溶胀：取100份的燕窝粉末及2000份的去离子水，先用1000份去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后倒入破壁机进行破壁，将破壁后的燕窝混合液转移至反应器中，然后用1000份的去离子水清洗破壁机壁并转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：通过pH计测燕窝混合液的pH值，并用0.1mol/L的盐酸调节燕窝混合液的pH值为5；
步骤S3.酶解：加入0.1份活性为650000u/g的菠萝蛋白酶及0.001份的L-半胱氨酸，在50℃恒温条件下酶解2h，并每隔10min搅拌10s，搅拌速度控制在100r/min；
步骤S4.灭活：酶解结束后在沸水浴中灭活6min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过无机陶瓷膜分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥，设置条件为真空度-0.06MPa、温度60℃，得块状燕窝小分子肽。通过检测发现，肽得率为73％。
实施例2
一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1.燕窝的溶胀：取粒径≦150μm的燕窝粉末100份及4000份的去离子水，先用2000份去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后倒入破壁机进行破壁，将破壁后的燕窝混合液转移至反应器中，然后用2000份的去离子水清洗破壁机壁并转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：测燕窝混合液的pH值，并用0.1mol/L的氢氧化钠调节燕窝混合液的pH值为8；
步骤S3.酶解：加入8份活性为600000u/g的菠萝蛋白酶及0.8份的L-半胱氨酸，在60℃恒温条件下酶解4h，并每隔10min间歇式搅拌10s，搅拌速度控制在100r/min；
步骤S4.灭活：酶解结束后在沸水浴中灭活8min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过离心分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥，条件设置为真空度-0.06MPa、温度80℃，得块状燕窝小分子肽。通过检测发现，肽得率为81％。
实施例3
一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1.燕窝的溶胀：取粒径≦150μm的燕窝粉末100份及2500份的去离子水，先用1000份去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后倒入破壁机进行破壁，将破壁后的燕窝混合液转移至反应器中，然后用1500份的去离子水清洗破壁机壁并转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：测燕窝混合液的pH值，并用0.1mol/L的盐酸调节燕窝混合液的pH值为6.5；
步骤S3.酶解：加入4份酶活性为620000u/g的菠萝蛋白酶及0.1份的L-半胱氨酸，在55℃恒温条件下酶解2.5h，并每隔10min间歇式搅拌10s，搅拌速度控制在100r/min；
步骤S4.灭活：酶解结束后在沸水浴中灭活7min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过无机陶瓷膜分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液通过喷雾干燥的方式进行干燥，设置进风温度为180℃，出口温度为100℃，进风量为5m3/min，得粉末状的燕窝小分子肽。通过检测发现，肽得率为80％，小分子肽的粒径小，大小均匀。
实施例4
一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1.燕窝的溶胀：取粒径≦150μm的燕窝粉末100份及3500份的去离子水，先用2000份去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后倒入破壁机进行破壁，将破壁后的燕窝混合液转移至反应器中，然后用1500份的去离子水清洗破壁机壁并转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：测燕窝混合液的pH值，并用0.1mol/L的氢氧化钠调节燕窝混合液的pH值为7.5；
步骤S3.酶解：加入1份酶活性为630000u/g的菠萝蛋白酶及0.1份的L-半胱氨酸，在58℃恒温条件下酶解3h，并每隔10min间歇式搅拌10s，搅拌速度控制在100r/min；
步骤S4.灭活：酶解结束后在沸水浴中灭活8min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过离心分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液通过喷雾干燥的方式，设置进风温度为180℃，出口温度为100℃，进风量为5m3/min，得燕窝小分子肽。通过检测发现，肽得率为77％，小分子肽的粒径小，大小均匀。
实施例5
一种优选的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1.燕窝的溶胀：取粒径≦150μm的燕窝粉末100份及3000份的去离子水，先用1500份去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后倒入破壁机进行破壁，将破壁后的燕窝混合液转移至反应器中，然后用1500份的去离子水清洗破壁机壁并转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：测燕窝混合液的pH值，并用0.1mol/L的盐酸调节燕窝混合液的pH值为7.1；
步骤S3.酶解：加入6份酶活性620000u/g的菠萝蛋白酶及0.3份的L-半胱氨酸，在53℃恒温条件下酶解3h，并每隔10min间歇式搅拌10s，搅拌速度控制在100r/min；
步骤S4.灭活：酶解结束后在沸水浴中灭活7min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过无机陶瓷膜分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥，条件为真空度-0.06MPa、温度60℃，干燥后得块状燕窝小分子肽。通过检测发现，肽得率为85％。
实施例6
一种实施例5所述菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法的对照方法，所述方法包括以下步骤：
步骤S1.燕窝的溶胀：取粒径≦150μm的燕窝粉末100份及3000份的去离子水，用3000份去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：测燕窝混合液的pH值，并用0.1mol/L的盐酸调节燕窝混合液的pH值为7.1；
步骤S3.酶解：加入6份酶活性620000u/g的菠萝蛋白酶，在53℃恒温条件下酶解3h，并每隔10min间歇式搅拌10s，搅拌速度控制在100r/min；
步骤S4.灭活：酶解结束后在沸水浴中灭活7min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过无机陶瓷膜分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液通过真空干燥设备进行浓缩、干燥，条件为真空度-0.06MPa、温度60℃，得燕窝小分子肽。通过检测发现，肽得率为57％。
通过比对实施例5和实施例6，二者的区别在于步骤1和步骤3，实施例5有对浸泡溶胀后的燕窝进行破壁处理，并且酶解过程中有添加了L-半胱氨酸，其肽得率较实施例6提高了19个百分点，可见破壁处理及添加L-半胱氨酸，能大大的提高肽得率，从而提高对燕窝营养物质的利用率。
可以理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据本发明的技术方案及其发明构思加以等同替换或改变，而所有这些改变或替换都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。
Claims (10)
1.一种菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
步骤S1.燕窝的溶胀：按配比取一定重量份数的燕窝粉末及去离子水，先用一部分去离子水浸泡燕窝，并超声振荡至完全溶胀，然后倒入破壁机进行破壁，将破壁后的燕窝混合液转移至反应器中；
步骤S2.调pH值：测燕窝混合液的pH值，并调节燕窝混合液的pH值为5～8；
步骤S3.酶解：加入一定重量份数的菠萝蛋白酶及L-半胱氨酸，在恒温加热及间歇式搅拌的条件下酶解一段时间；
步骤S4.灭活：酶解结束后将反应器置于沸水浴中灭活6～8min；
步骤S5.分离：灭活后的酶解液通过分离设备进行分离，得清液；
步骤S6.浓缩干燥：将清液浓缩、干燥，得燕窝小分子肽。
2.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S1前还包括步骤S0.燕窝粉末的制备，将干燥的燕窝通过粉碎机粉碎，然后过100目筛，得燕窝粉末。
3.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S1中，燕窝粉末与蒸馏水的质量比为1∶20～40。
4.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S2中，调节燕窝混合液的pH值为6.5～7.5。
5.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述菠萝蛋白酶的酶活性大于600000u/g，且添加量为燕窝重量的0.1％～8％。
6.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S3中，酶解的时间为2～4h，恒温加热的温度为50～60℃。
7.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S3中，所述L-半光氨酸的添加量为菠萝蛋白酶重量的1％～10％。
8.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S5中，所述分离设备包括无机陶瓷超滤膜或离心分离机中的一种。
9.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S6中，所述清液采用真空干燥设备进行浓缩、干燥制得燕窝小分子肽。
10.根据权利要求1所述的菠萝蛋白酶酶解燕窝制备小分子肽的方法，其特征在于，所述步骤S6中，所述清液采用喷雾干燥的方式得到燕窝小分子肽。
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