KR100962334B1

KR100962334B1 - 울금으로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제

Info

Publication number: KR100962334B1
Application number: KR1020090099238A
Authority: KR
Inventors: 김은희; 유성식; 원호근; 오원근; 박준수; 강후원; 누엔티녹안
Original assignee: 주식회사 중앙백신연구소; 조선대학교산학협력단
Priority date: 2009-10-19
Filing date: 2009-10-19
Publication date: 2010-06-10
Also published as: WO2011049348A3; WO2011049348A2

Abstract

본 발명은 뉴라미니데이즈 효소(neuraminidase)를 저해하는 울금(Curcuma longa) 유래의 디아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 계열의 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

울금, 뉴라미니데이즈, 디아릴헵타노이드, 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자, 신종플루, 항바이러스

Description

울금으로부터 얻은 조류, 돼지 인플루엔자 및 신종플루에 대한 항바이러스제{Antiviral agents with inhibitory activities on Avian and Swine influenza virus or Novel influenza virus by compounds isolated from Curcurma longa}

본 발명은 뉴라미니데이즈(neuraminidase) 효소를 저해하는 울금(Curcuma longa) 유래의 화합물 및 이를 유효성분으로 함유하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루의 예방과 치료용 조성물에 관한 것이다.

더욱 상세하게는 울금을 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매 또는 이들 추출용매의 수용액으로 추출한 후 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리 정제하여 얻은 다아릴헵타노이드(diarylheptanoid) 계열의 화합물(curcumin, bisdemethoxycurcumin, demethoxycurcumin) 중 어느 하나를 포함하는 뉴라미니데이즈 저해 화합물과 이를 유효성분으로 함유하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루의 예방 및 치료용 조성물에 관한 것이다.

인플루엔자 바이러스는 '오르소믹소'과에 속하는 RNA 바이러스(Orthomyxovirus)로서 A, B, C형으로 분류된다. A형은 사람에게 주로 감염이 확 인되며 B, C형에 비하여 돼지, 기타 포유류 및 다양한 야생조류에서 감염이 확인되고 있는 바이러스이다. 최근, 전 세계적으로 문제가 되고 있는 조류 인플루엔자(Avian influenza), 돼지 인플루엔자(Swine influenza) 및 신종플루(Novel flu) 등은 모두 A형 바이러스에 속한다.

인플루엔자 바이러스의 표면에는 헤마글루티닌(hemagglutinin, HA)과 뉴라미니데이즈(neuraminidase, NA)라는 두 가지 단백질이 존재하는데, HA는 16종이 있고 NA는 9종이 있으므로 16×9=144 종류의 인플루엔자 바이러스가 발생할 수 있다. 조류에서의 인플루엔자 감염은 주로 H5형이나 H7형 및 H9형에 관련되며, 3종류의 헤마글루티닌(H1, H2, H3)과 2가지 형태의 뉴라미니데이즈(N1과 N2)만이 인간에서 인플루엔자 감염을 일으키므로 원칙적으로 인간은 조류인플루엔자에 감염되지 않았다. 그러나 최근에는 조류 인플루엔자의 바이러스가 유전자 재조합 과정을 거치지 않고 직접 사람에게 전파된 예도 발생하고 있다.

조류 인플루엔자는 닭과 오리, 칠면조 등 가금류를 접촉하는 것 이외에도 야생조류와 우리나라에 온 철새들을 통해서 빠르게 전파된다. 조류 인플루엔자 바이러스는 조류 인플루엔자가 발생한 동남아로부터 주기적으로 유입되어 전파되며 특히 봄철 황사를 통해 중국으로부터도 전염이 가능하다. 세계적으로 문제가 되고 있는 동물의 바이러스 질환인 조류 인플루엔자는 국내에서 1996년 이후 발생해 530만 마리의 닭, 오리가 도살되는 등 1,500억 원 이상의 직접 피해가 발생하였으며, 아시아에서도 조류 인플루엔자를 통해 2억 마리 이상의 축산물이 도살되어 양계산업의 경제적 손실이 막대하다.

돼지 인플루엔자 바이러스(Swine influenza virus)는 1918년에 처음으로 보고되었으며 보통 돼지는 사람이 가지고 있는 인플루엔자 수용체(N-acetylneuraminic acid α2,6 galactose)와 조류들이 갖고 있는 인플루엔자 수용체(N-acetylneuraminic acid α2,3 galactose)를 동시에 가지고 있어 조류 인플루엔자 바이러스가 돼지의 몸 안에서 재조합(reassortment) 또는 적응(adaptation)을 통하여 사람에게 감염될 수 있도록 바이러스 혼합용기(mixing vessels)의 역할을 한다고 알려지고 있다.

2009년 멕시코에서 처음 발병하여 전 세계로 퍼지고 있는 신종플루(Novel flu)는 돼지 인플루엔자 바이러스인 H1N1이 돼지에게 감염되어 인간에게 전염이 가능한 질환으로 변이된 것으로 추정된다. 신종플루는 기본적으로 감기처럼 고열, 기침 등의 증상이 나타나는데 현재 상태보다 인간에게 치명적인 바이러스로 변할 가능성이 존재한다. 세계보건기구(WHO)가 집계하는 신종플루의 감염자 수는 2009년 10월 초까지 그 수가 34만 3200명에 달하였고, 사망자는 4000명을 넘어섰으며, 현재 세계보건기구는 신종플루의 현황을 6단계인 대유행 상태로 격상하였다. 신종플루의 일반적인 증상은 일반 독감과 구별하기가 매우 어렵다. 신종플루는 일반 독감과 비슷하게 발열, 인후통, 기침, 콧물 또는 코막힘의 증상을 보이고 있으며, 최근의 신종플루 관련 보고에 의하면 일반독감보다 심한 치명적인 폐 손상을 유발하는 특징을 보이고 있으므로 신종플루의 예방 및 치료는 매우 중요한 문제이다. 따라서 신종플루를 예방하기 위하여 백신의 확보가 필수적이며 신종플루가 급격하게 확대되기전에 백신을 생산하여 국가적으로 접종할 필요가 있다. 그러나, 예방적 차원의 국가적 백신 대책으로 매번 항원변이가 일어나는 RNA 바이러스를 모두 예방하는 백신을 만드는 것은 불가능에 가깝다. 따라서 조류 및 돼지 인플루엔자, 신종플루 또는 최악의 발병 가능성인 조류 인플루엔자와 신종플루가 섞인 새로운 병원체의 발생에 대비하기 위하여 이를 예방하고 치료할 수 있는 치료제의 개발은 필수적이다.

현재 조류 및 돼지 인플루엔자, 신종플루의 유일한 치료제는 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 선택적인 저해물질로 개발된 경구용 치료제인 타미플루(oseltamivir phosphate)와 흡입형인 리렌자(zanamivir) 등이다. 경구용 치료제로서 많이 사용하고 있는 타미플루의 부작용으로는 오심, 구토, 신경계나 정신계의 이상이 보고되었으며, 일본의 경우 타미플루를 승인 후 확인된 소아환자의 사망예가 15건이 될 정도로 부작용을 갖고 있다. 또한, 경구용 치료제로 사용되고 있는 타미플루에 대한 내성 바이러스가 발병할 경우를 대비하여야 한다. 최근에 이미 신종플루의 확산에 치명적인 타미플루에 대한 내성 바이러스의 출현이 보고되고 있으며, 타미플루 내성 바이러스의 인간 대 인간 전염조차도 발견되고 있는 실정이다. 따라서 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루에 대한 바이러스 치료제의 개발은 인간의 보건안전에 필수적인 사항이며, 특히 대유행을 앞두고 있는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루와의 전쟁에 있어서 더욱 필요하다.

바이러스의 감염 및 증식과정을 살펴보면 바이러스는 세포에 감염 후 세포내에서 새로운 바이러스를 만들고 다른 세포로 전파되기 위하여 세포 외부에 존재하는 시알릭산(siliac acid)을 바이러스가 만든 뉴라미니데이즈를 이용하여 절단하는 것이 필요하다. 타미플루 내성 조류 인플루엔자 바이러스는 보통 타미플루가 결합 하는 타미플루의 수용체 단백질의 아미노산을 변화시키는 3개의 유전적 변이(Arg292Lys, Asn274Ser, His294Tyr)를 통해 발생하는 것으로 알려지고 있다. 3곳의 유전적 변이 중 타미플루 내성 조류 인플루엔자 바이러스의 변종으로 가장 많이 발현하는 294의 His가 Tyr으로 변화한 바이러스의 경우는 타미플루의 소수성 잔기(hydrophobic residue)가 타미플루 수용체에 결합하지 못하게 변이된 경우이다. 이는 미국과 유럽에서 2007~2008년 시즌에 10~25% 확률로 발견된 바이러스로서 향후의 신종플루에 대한 변이가능성에 대한 위험도를 증가시키고 있다. 따라서 이들 타미플루 내성 바이러스의 등장은 인간이 새로운 바이러스 치료제를 지속적으로 개발하여야 하는 당위성을 제공하고 있다.

본 발명에서는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루의 방어대책에 대한 시급성을 감안하여 효과가 확인되면 바로 적응이 가능한 식품 및 약용식물을 대상으로 하여 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루에 대한 뉴라미니데이즈 저해물질을 탐색하였다. 일반적으로 새로운 성분의 약제를 개발하기 위해 기존 약제를 실험적으로 변형시키는 것보다는 전통 의학에서 사용되고 있는 천연물 약제들로부터 새로운 활성 성분을 찾는 것이 여러가지 면에서 장점이 많다. 특히 이러한 활성 성분들은 오랫동안 사용되어 왔기 때문에 약물들에 의한 독성 염려가 적다. 이러한 사실은 신종플루 치료제로서 사용되는 타미플루도 출발물질은 중국의 토착식물인 '스타아니스' 열매를 주원료로 개발한 것에서 확인할 수 있다.

본 특허의 대상인 울금(Curcuma longa)은 인도원산으로 인도로부터 동남아시아를 중심으로 열대 및 아열대 지방에서 넓게 재배되고 있는 다년생 초본이다. 울 금은 강황이라고도 불리우며, 최근 우리나라의 남쪽 지역에서 재배되고 있는 식물로 카레 등의 원료로 사용되고 있다. 울금에는 방향성 정유가 1~5% 포함되어 있으며, 황색색소인 커큐민(curcumine) 등을 0.3% 정도 함유하고 있어 방향성 건위제로 간장염, 담도염, 담석증, 카타르성 황달 등에 사용되었다.

본 발명에서는 울금으로부터 다아릴헵타노이드 계열의 화합물을 분리하여 이들 화합물이 조류 및 돼지 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니데이즈와 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈 및 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈를 저해함을 확인하였다.

인플루엔자 바이러스에 관한 특허 및 문헌으로 선행 특허 내용 중 추출물 및 여러 추출물을 함유한 분획물을 이용한 특허로 "맨드라미 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 치료 및 예방용 조성물, 한국등록특허 제881035호", "상사화 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물, 한국등록특허 제740563호", "솔잎 추출물을 함유하는 바이러스로 인한 인간 질환의 치료 및 예방용 조성물, 한국등록특허 제743861호" 및 "오리나무 추출물을 함유하는 항바이러스 조성물, 한국등록특허 제721703호" 등이 있으나 이는 추출물을 사용한 것으로 화합물을 기반으로 하는 본 특허와의 관련성은 적다.

울금으로부터 분리된 화합물을 이용한 특허 및 논문으로는 "신규 항바이러스제, 한국공개특허 제2003-14556"에서 커큐마 잔소리자(Curcuma xanthorrhiza)로부터 잔소리졸(xanthorrhizol)을 분리하여 RNA형 바이러스에 대한 활성을 제시하였다. 그러나, 잔소리졸은 본 특허에서 주장하는 활성 화합물이 아니다. "질병 전염 률을 감소시키는 조성물 및 그 방법, 한국공개특허 제2007-102487호"에서는 생강으로부터 얻을 수 있는 제 1 성분; 녹차로부터 얻을 수 있는 제 2 성분; 강황으로부터 얻을 수 있는 임의의 제 3 성분들이 항바이러스 효과가 있다고 제시하였다. 해당 특허의 내용 중 본 특허의 내용의 성분들이 거명된 녹차, 울금, 생강의 추출물을 이용하여 코감기 바이러스 16, 헤르페스-1 바이러스(HSV-1), 인플루엔자 A/모스크바/10/99 및 조류 인플루엔자바이러스 A(H5N1)에 효과가 있다고 제시하였으나 각각의 화합물들에 대한 실험예는 없으며 단순히 문헌상에서 보고된 성분들을 특허상에 나열하여 기술하였을 뿐이며 예시 결과는 추출물을 이용하여 일부를 기술하였을 뿐이다.

본 발명의 목적은 조류 및 돼지 인플루엔자 바이러스, 신종플루 및 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈를 저해하여 조류 인플루엔자와 신종플루 관련 질환에 예방과 치료 효과를 나타내는 울금으로부터 순수하게 분리 정제하여 얻은 디아릴헵타노이드 계열의 화합물들을 각각 혹은 2개 이상 혼합하여 유효성분으로 함유하는 조성물을 제공함에 있다.

울금 추출물 및 화합물의 활성 측정은, 울금을 알코올(에탄올 또는 메탄올) 또는 알코올 수용액으로 추출한 후 에틸아세테이트로 분획하는 단계; 디아릴헵타노이드계 화합물을 크로마토그래피를 이용하여 순수 분리 정제하는 단계; 분리된 활성 화합물의 화학구조를 확인한 하기 화학식 1로 표시되는 커큐민(화합물 1), 데메톡시커큐민(화합물 2) 및 비스데메톡시커큐민(화합물 3)을 확인하는 단계; 상기 디아릴헵타노이드계 화합물의 조류 인플루엔자 바이러스(H9N2), 돼지 인플루엔자 바이러스(H1N1), 신종플루 바이러스(H1N1) 뉴라미니데이즈 및 타미플루 내성 신종플루 바이러스(H1N1)의 뉴라미니데이즈에 대한 저해 작용을 측정하는 단계; 및 최종적으로 조류 인플루엔자의 동물모델인 닭에 조류 인플루엔자 바이러스(H9N2)를 감염시킨 뒤 커큐민을 경구투여하여 상부기도에서의 바이러스 함량을 측정하는 방법으로 활성억제를 확인하는 단계;를 포함하는 것을 특징으로 한다.

본 발명은 상기한 화합물 중 적어도 하나의 화합물을 유효성분으로 포함하여 뉴라미니데이즈를 저해하여 조류 및 돼지 인플루엔자 및 신종플루 관련 질환을 예방 또는 치료하는 것을 특징으로 한다.

본 발명의 울금 추출물은 유기용매(알코올, 알코올 수용액, 에틸아세테이트, 아세톤, 클로로포름 등)에 의한 추출, 헥산과 물의 분배, 디아이온 HP-20 레진과 같은 흡착수지 사용방법, 칼럼크로마토그래피에 의한 방법 등 식물체 성분의 분리 추출에 이용되는 공지된 방법을 단독 또는 적합하게 조합하여 용이하게 얻을 수가 있다. 조추출물은 필요에 따라서 상법에 따라서 더욱 정제할 수 있다. 본 발명에서 사용하는 크로마토그래피에는 실리카겔 칼럼 크로마토그래피(silica gel column chromatography), 엘에이취-20 칼럼 크로마토그래피(LH-20 column chromatography), 박층 크로마토그래피(TLC; thin layer chromatography) 및 고성 능 액체 크로마토그래피(high performance liquid chromatography) 등이 이용될 수 있다.

본 발명에 따른 디아릴헵타노이드계 화합물은 울금으로부터 쉽게 분리할 수 있을 뿐만 아니라 안정도도 높으므로 식품, 의약품, 사료의 첨가제로 이용할 수 있다.

본 발명에 따른 울금 추출물 및 디아릴헵타노이드계 화합물을 포함하는 약학 조성물은, 각각 통상의 방법에 따라 산제, 과립제, 정제, 캡슐제, 현탁액, 에멀젼, 시럽, 에어로졸 등의 경구형 제형, 외용제, 좌제 및 멸균 주사용액의 형태로 제형화하여 사용될 수 있다. 추출물을 포함하는 조성물에 포함될 수 있는 담체, 부형제 및 희석제로는 락토즈, 덱스트로즈, 수크로스, 솔비톨, 만니톨, 자일리톨, 에리스리톨, 말티톨, 전분, 아카시아 고무, 알지네이트, 젤라틴, 칼슘 포스페이트, 칼슘 실리케이트, 셀룰로즈, 메틸 셀룰로즈, 미정질 셀룰로스, 폴리비닐 피롤리돈, 물, 메틸히드록시벤조에이트, 프로필히드록시벤조에이트, 탈크, 마그네슘 스테아레이트 및 광물유를 들 수 있다. 제제화 할 경우에는 보통 사용하는 충진제, 증량제, 결합제, 습윤제, 붕해제, 계면활성제 등의 희석제 또는 부형제를 사용하여 조제된다. 경구투여를 위한 고형제제에는 정제, 환제, 산제, 과립제, 캡슐제 등이 포함되며, 이러한 고형제제는 상기 추출물에 적어도 하나 이상의 부형제 예를 들면, 전분, 탄산칼슘, 수크로스 또는 락토오스, 젤라틴 등을 섞어 조제된다. 또한 단순한 부형제 이외에 마그네슘 스테아레이트, 탈크 같은 윤활제들도 사용된다. 경구를 위한 액상 제제로는 현탁제, 내용액제, 유제, 시럽제 등이 해당되는데 흔히 사용되는 단순 희 석제인 물, 리퀴드 파라핀 이외에 여러 가지 부형제, 예를 들면 습윤제, 감미제, 방향제, 보존제 등이 포함될 수 있다. 비경구 투여를 위한 제제에는 멸균된 수용액, 비수성용제, 현탁제, 유제, 동결건조 제제, 좌제가 포함된다. 비수성용제, 현탁제로는 프로필렌글리콜, 폴리에틸렌 글리콜, 올리브 오일과 같은 식물성 기름, 에틸올레이트와 같은 주사 가능한 에스테르 등이 사용될 수 있다. 좌제의 기제로는 위텝솔(witepsol), 마크로골, 트윈(tween) 61, 카카오지, 라우린지, 글리세로제라틴 등이 사용될 수 있다.

상기 활성성분의 투여량은 치료받을 대상의 연령, 성별, 체중과, 치료할 특정 질환 또는 병리 상태, 질환 또는 병리 상태의 심각도, 투여경로 및 처방자의 판단에 따라 달라질 것이다. 이러한 인자에 기초한 투여량 결정은 당업자의 수준 내에 있으며, 일반적으로 투여량은 0.01㎎/㎏/일 내지 대략 2000㎎/㎏/일의 범위이다. 더 바람직한 투여량은 0.1㎎/㎏/일 내지 500㎎/㎏/일이다. 투여는 하루에 한번 투여할 수도 있고, 수회 나누어 투여할 수도 있다. 상기 투여량은 어떠한 면으로든 본 발명의 범위를 한정하는 것은 아니다. 본 발명의 추출물은 쥐, 가축, 인간 등의 포유동물에 다양한 경로로 투여될 수 있다. 투여의 모든 방식은 예상될 수 있는데, 예를 들면, 경구, 직장 또는 정맥, 근육, 피하, 자궁내 경막 또는 뇌혈관내 주사에 의해 투여될 수 있다. 본 발명의 추출물은 독성 및 부작용은 거의 없으므로 예방 목적으로 장기간 복용시에도 안심하고 사용할 수 있는 약제이다.

또한, 본 발명은 상기 울금 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루 예방을 위한 건강 기능 식 품을 제공한다. 본 발명의 건강기능식품은 정제, 캡슐제, 환제 또는 액제 등의 형태를 포함하며, 본 발명의 화합물을 첨가할 수 있는 식품으로는, 예를 들어, 각종 식품류, 음료, 껌, 차, 비타민 복합제, 건강 기능성 식품류 등이 있다. 상세하게는, 본 발명은 울금 추출물을 유효성분으로 함유하는 추출물 및 식품학적으로 허용 가능한 식품보조 첨가제를 포함하는 신종플루 관련 질환의 예방과 치료용 건강 기능 식품을 제공한다.

본 특허는 상기 울금 추출물 및 디아릴 헵타노이드 화합물을 포함하는 동물 질병의 예방 및 치료할 목적으로 사료첨가제 및 치료물질로 사용 가능하다. 본 발명의 사료첨가제 및 치료물질은 동물과 인간에게서 공통적으로 발병하는 뉴라미니데이즈 관련 인수공통성 질환인 세균 감염에 의한 감염성 장염 등에도 사용가능하며, 특히 신종플루, 조류 및 돼지 인플루엔자와 관련한 질환의 예방과 치료용 동물사료 첨가제, 동물약품을 제공한다.

울금으로부터 분리된 추출물과 화합물은 조류 및 돼지 인플루엔자 또는 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈를 비선택적으로 저해하는 치료효과를 가지며 타미플루에 내성을 갖는 타미플루 내성 신종플루 바이러스에도 동일하게 뉴라미니데이즈를 저해할 수 있었다.

더욱이, 타미플루와 본 특허의 화합물을 조류 인플루엔자(H9N2), 돼지 인플루엔자(H1N1) 바이러스에 병용처리하였을 경우 타미플루의 사용량을 줄일 수 있었는데 이러한 상승효과는 신종플루 뉴라미니데이즈, 타미플루 내성 신종플루 뉴라미 니데이즈에서도 비슷하게 작동하고 있음을 확인하였다.

이로써 본 발명에 따른 울금 추출물과 이로부터 분리된 디아릴헵타노이드계 화합물은 조류 인플루엔자 바이러스와 돼지인플루엔자 바이러스, 신종플루 뉴라미니데이즈 및 타미플루 내성 신종플루의 뉴라미니데이즈를 저해하여 조류 인플루엔자와 신종플루 관련 질환의 예방과 치료의 효과를 기대할 수 있다.

또한 본 발명의 화합물은 카레, 한약재 및 차(tea) 등의 식품원료로 사용되어 왔던 울금으로부터 추출 분리 정제한 것이므로 세포 독성이 적어 의약품, 화장품, 건강식품, 동물사료, 동물약품 산업 등에 매우 유용하게 사용 및 응용될 수 있다.

이하 본 발명의 바람직한 실시예를 상세히 설명하기로 한다. 그러나, 본 발명은 여기서 설명되는 실시예에 한정되지 않고 다른 형태로 구체화될 수도 있다. 오히려, 여기서 소개되는 내용이 철저하고 완전해질 수 있도록 그리고 당업자에게 본 발명의 사상이 충분히 전달될 수 있도록 하기 위해 제공되는 것이다.

<실시예 1 : 울금으로부터 활성 화합물의 용매 추출조건의 검토>

울금으로부터 활성물질의 용매 추출정도를 비교하기 위하여, 증류수, 30 내지 100% 에탄올 수용액, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 등의 용매를 사용하여 활성성분의 추출정도를 비교하기 위하여 울금 100g을 해당용매 300㎖을 사용하여 4시간 동안 3회에 걸쳐 환류냉각기를 이용하여 가열 추출한 후 추출액을 감압 농축하였다. 추출된 추출물질의 양을 비교한 결과, 4.1g(100% EtOH)부터 7.3 g(30% EtOH)의 추출량을 보여 주었다. 이후 이들 추출물의 활성을 뉴라미니데이즈에 대한 활성정도를 비교하기 위하여 각각의 추출물을 최종농도 20μg/㎖의 농도로 하여 각각 추출물의 활성정도를 실시예 4-2의 바이러스 배양액과 실시예 6의 방법을 이용하여 측정하였다. 표 1에서 보여준 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 추출물은 50~100% 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트, 클로로포름 추출액에서 활성이 좋았으나, 인체에게 허용되는 추출용매 및 각 용매조건에서 추출된 양과 활성정도를 비교하여 에탄올 추출물을 최적 추출조건으로 설정하였다.

조건	추출량	돼지 인플루엔자 바이러스 기원 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성(20μg/㎖)
30% 에탄올	7.3g	18.1%
50% 에탄올	6.6g	39.1%
70% 에탄올	6.5g	40.1%
90% 에탄올	5.2g	32.0%
에탄올	4.1g	40.4%
메탄올	6.6g	38.2%
아세톤	5.0g	34.2%
에틸아세테이트	5.5g	30.3%
클로로포름	6.1g	27.5%
증류수	8.1g	9.72%

< 실시예 2 : 울금으로부터 용매 추출물과 디아릴헵타노이드계 화합물의 분리>

울금 1kg을 주정 3ℓ를 사용하여 4시간 동안 3회에 걸쳐 환류 냉각기를 이용하여 가열 추출하였다. 상기 에탄올 추출물(이하, 'A 분획'이라 칭함)을 감압 농축한 결과 61.2g의 추출물을 확인할 수 있었다. 농축한 추출물을 취하여 물(2ℓ)로 현탁한 후 n-헥산(2ℓ) 추출물(이하, 'B 분획'이라 칭함), 에틸 아세테이트(2ℓ) 추출물(이하, 'C 분획'이라 칭함), 부탄올(2ℓ) 추출물(이하, 'D 분획'이라 칭함)로 순차적으로 용매분획 한 다음 각각의 용매분획에 대하여 조류 인플루엔자 바이러스와 돼지 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니데이즈 활성을 측정한 결과, 에틸 아세테이트 분획(C 분획) 및 부탄올(2ℓ)분획에서 활성을 보여주었으며 그 중 에틸 아세테이트 분획(C 분획)이 보다 강한 활성을 나타내었다.

에탄올 추출물 농축액을 90% 메탄올에 녹인 뒤 n-헥산으로 분획하여 탈지한 후 이 농축액을 물에 포화시킨 뒤 에틸아세테이트를 용매로 분획하여 25.8g의 농축액을 얻었다. 에틸 아세테이트 분획(25.8g)을 헥산-에틸 아세테이트(8:1 → 0:1)의 용매구배 조건으로 실리카겔 컬럼크로마토그래피를 실시하여 12개의 분획을 얻었다(fr. 1~12). 이 분획을 실리카(silica)와 리버스 페이스-18(reverse phase-18, RP-18)를 이용한 TLC(thin layer chromatography)를 실시하여 7개의 분획을 나누어 각각의 분획에 대하여 뉴라미니데이즈 활성을 평가하였다. 이후 높은 뉴라미니데이즈 활성을 나타내는 분획 4를 MeCN-H₂O(0-60min: 59 → 65% MeOH, 60-65min: 65 → 100% MeCN)을 사용하여 HPLC [Optima Pak C₁₈ column 20×150mm; 10μM 입자 크기 2㎖l/min; UV detection:205nm]를 실시하여 화학식 1로 표시되는 화합물 1 내지 화합물 3을 순수하게 얻을 수 있었다(도 1 참조).

상기 뉴라미니데이즈 활성은 실시예 6의 방법을 이용하였고 실시예 8과 표 3 및 표 4에서 결과를 나타내었다.

< 실시예 3 : 디아릴헵타노이드계 화합물의 물리 화학적 특성 및 화학구조 분석>

상기 울금으로부터 분리된 화합물은 공통적으로 디아릴헵타노이드계 화합물의 특징을 갖음을 ¹H, ¹³C-NMR 분석 결과로부터 확인하였다. 디아릴헵타노이드계 화합물은 ¹H-NMR 스펙트럼에서 1,4 치환된 2개의 벤젠환이나, 1,3,4 치환된 벤젠환의 화학적 이동값을 공통적으로 관찰함으로서 커큐모노이드 계열의 화합물임을 확인할 수 있었다. ¹H-NMR 스펙트럼에서 1,4치환된 벤젠환을 가진 경우 7.0 ppm 과 6.75 ppm 근처에서 더블렛(doublet)으로 갈라지는 수소수 2개, 4개의 차이로부터 이들 화합물의 대칭성 및 골격의 차이를 유추할 수 있었으며, 1,3,4 치환된 벤젠환은 특징적인 치환형식 [7.21 (1H, d, J = 2.0 Hz), 7.03 (1H, dd, J = 2.0, 8.0 Hz), 6.89 (1H, d, J = 8.0 Hz)]으로부터 벤젠 부분의 구조를 확인할 수 있었다. 따라서, 본 발명자들은 울금으로부터 얻은 화합물의 ¹H, ¹³C-NMR 등의 1D NMR 데이터와 COSY, NOESY, HMQC, HMBC 등의 2D NMR 스펙트럼을 통하여 구조를 확인한 결과 이들 화학물은 울금 중에 다량 존재하는 커큐미노이드계 화합물로 화합물 1은 커큐민(curcumin), 화합물 2는 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin) 및 화합물 3은 비스데메톡시커큐민(bisdemethoxycurcumin)으로 확인되었으며 다른 커큐미노이드는 조류 인플루엔자 바이러스, 신종플루 바이러스 및 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈에 활성이 커큐민보다 약하였지만 활성이 존재하였으나, 3종류의 화합물이 공지의 방법으로 쉽게 얻을 수 있는 주 화합물이기 때문에 모든 실험들은 주 화합물을 이용하여 활성을 확인하였다. [Journal of Natural Products. 1998 61:1531; Magnetic Resonance in Chemistry, 2009 47: 902].

< 실시예 4 : 인플루엔자 바이러스의 준비>

4-1. 조류 인플루엔자(H9N2) 바이러스

실험에 사용한 조류 인플루엔자 바이러스는 저병원성 조류 인플루엔자 바이러스인 A/chicken/Korea/01310/2001(H9N2)를 사용하였다. 이것을 10일령의 SPF(Specific-Pathogen Free) 수정란의 요막강(Allantoic Cavity)에 접종하고 2일 후 채독하여 바이러스를 신장 세포에 속하는 MDCK(Madin-Darby canine kidney)에 접종하여 5일간 배양하여 원심분리 후 상등액층의 배양액을 H9N2 기원의 바이러스 뉴라미니데이즈의 활성 측정에 사용하였다.

4-2. 돼지인플루엔자(H1N1) 바이러스

실험에 사용한 돼지 인플루엔자 바이러스는 중앙백신연구소의 돼지 인플루엔자 바이러스인 A/Sw/Kor/CAN1/04(H1N1, KCTC 11165BP)를 사용하였다. 이 바이러스를 10일령의 Specific-Pathogen Free(SPF) Egg 요막강(Allantoic Cavity)에 접종하고 2일 후 채독하여 씨드 바이러스(seed virus)를 증식시켰다. 이후 배양된 씨드 바이러스를 SPF 달걀의 요막강에 재접종하여 바이러스 배양액을 얻은 후 H1N1 기원의 바이러스 뉴라미니데이즈의 활성 측정에 사용하였다.

< 실시예 5 : 뉴라미니데이즈 클로닝 >

신종플루 바이러스는 전염성이 강하고 감염될 경우에는 질환으로 사망할 가능성이 높기 때문에 일차적으로 신종플루 바이러스 자체를 이용하여 효과가 있는 활성물질을 검색하고 확인하기보다는 신약의 표적이 되는 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈만을 동물 세포주에서 발현시켜서 신약 후보 물질의 활성을 검증하는 방법을 사용하였다. 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈 유전자서열을 NCBI의 유전자은행으로부터 확인하여 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈를 클로닝(cloning)하였으며, 타미플루에 내성을 가지는 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈 점 돌연변이체를 인위적으로 제작하여 천연물의 활성 탐색에 사용하였다. 이하 클로닝에 사용된 각 염기서열은 다음과 같다.

* 사용된 신종플루 뉴라미니데이즈 펩타이드 서열 *

5-1. 신종플루(H1N1) 바이러스의 뉴라미니데이즈 펩타이드 서열

MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISHSIQLGNQNQIETCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDGINWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNYHYEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSISSRNGFEMIWDPNGWTGTDNNFSIKQDIVGINEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK

5-2. 타미플루에 내성을 가지는 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈 펩타이드

밑줄 처진 부분이 점돌연변이에 의해서 바뀌는 부분임 (H → Y)

MNPNQKIITIGSVCMTIGMANLILQIGNIISIWISHSIQLGNQNQIETCNQSVITYENNTWVNQTYVNISNTNFAAGQSVVSVKLAGNSSLCPVSGWAIYSKDNSVRIGSKGDVFVIREPFISCSPLECRTFFLTQGALLNDKHSNGTIKDRSPYRTLMSCPIGEVPSPYNSRFESVAWSASACHDGINWLTIGISGPDNGAVAVLKYNGIITDTIKSWRNNILRTQESECACVNGSCFTVMTDGPSNGQASYKIFRIEKGKIVKSVEMNAPNY Y YEECSCYPDSSEITCVCRDNWHGSNRPWVSFNQNLEYQIGYICSGIFGDNPRPNDKTGSCGPVSSNGANGVKGFSFKYGNGVWIGRTKSISSRNGFEMIWDPNGWTGTDNNFSIKQDIVGINEWSGYSGSFVQHPELTGLDCIRPCFWVELIRGRPKENTIWTSGSSISFCGVNSDTVGWSWPDGAELPFTIDK

상기의 서열로 각각의 유전자를 클로닝 한 후 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈에 해당하는 유전자를 PCR 증폭 방법을 이용하였고, 증폭된 산물은 인비트로젠(Invitrogen)사의 pcDNA3.1/V5-His Topo 벡터에 클로닝하였다. 클로닝의 확인은 제한효소 절단(restriction enzyme cutting)을 통해서 일차적으로 확인하고, 염기서열 분석법(DNA sequencing)을 통해서 최종 확인하였다. 또한, 타미플루에 내성을 가지는 뉴라미니데이즈를 문헌조사를 통해 중간의 히스티딘(Histidine) 아미노산을 티로신(Tyrosine)으로 치환함으로써 획득하였다. 사용한 방법은 PCR을 이용하는 퀵체인지(Quick change)방법을 이용하였다. 이 방법은 치환하려고 하는 부분에 해당하는 올리고뉴클레오티드(oligonucleotide)를 제작한 후, PCR 효소를 사용하여 플라스미드를 시험관 내에서 증폭시켰으며, 기존의 염기서열을 가진 플라스미드를 제거하기 위해서 메틸레이션(methylation)되어 있는 플라스미드만 절단하는 DpnI 효소를 처리하였다. 돌연변이가 일어난 플라스미드는 박테리아에서 증폭하였으며, 염기서열 분석법(DNA sequencing)을 통해서 아미노산 치환을 최종 확인하여 실험에 사용하였다.

< 실시예 6 : 뉴라미니데이즈의 활성 측정>

뉴라미니데이즈 활성은 정확한 저해율을 측정하기 위하여 메이어(Myers) 등이 고안한 방법을 변경하여 사용하였다. 각각의 뉴라미니데이즈가 포함된 샘플에 0.04M sodium acetate 완충액(pH 5.0) 20㎕와 0.04mM 4-methylumbelliferyl-α-D-N-acetylneuraminic acid(Sigma M8639) 80㎕를 혼합하여 10분간 반응시킨 후 0.1 M glycine-NaOH 완충액 100㎕을 첨가하여 반응을 중지시킨 후 형광광도계를 이용하여 360nm/440nm에서의 형광차이를 이용하여 활성을 측정하였다. 이 때 타미플루, 화합물이나 각각의 용매 및 분획 추출물은 세포에 미리 처리하거나 바이러스를 배양할 때 같이 투여되어 활성억제가 되도록 하였다(화합물을 샘플에 직접 처리하려면 상기 형광 반응에 1㎕의 화합물을 넣으면 된다). 또한, 시료의 발광도를 보정하기 위하여 측정 발광도를 A, 시료를 녹인 용매의 발광도를 C, 시료 혼합액의 발광도를 B로 하여 저해율을 계산하였다.

저해율 : {C-(A-B)/C}×100

화합물의 Kinetic 연구를 위하여 4-methoxyumbelliferone의 농도를 반응을 중지시키기 위하여 넣는 0.1M glycine-NaOH buffer를 첨가하기 전에 측정되었으며, Sigmaplot 11.0(SPCC Inc., Chicago, IL)에서 계산하였다. 또한 효소의 가역반응을 측정하기 위하여, 효소와 저해물질이 들어간 반응액을 희석하는 방법을 사용하여 측정하였다.

< 실시예 7 : 뉴라미니데이즈를 직접 발현하는 세포의 파쇄액에서 뉴라미니데이즈의 활성 측정>

신종플루 및 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈를 직접 발현하는 세포의 파쇄액에서 뉴라미니데이즈의 활성을 측정하기 위해 인간 신장세포인 HEK293T 세포에 0.25%의 트립신(trypsin)을 처리하여 모은 후, 상층액을 제거한 뒤 우혈청이 제거된 DMEM 배지로 현탁하였다. 그리고 우혈청이 포함되지 않는 DMEM 100㎕에 3㎕의 리포펙타민(Lipofectamin, Invitrogen, Inc)을 세포 현탁액에 점적한 후 천천히 섞어 15분간 실온에 방치하였다. 이후, 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈(실시예 5-1), 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈(실시예 5-2)를 발현하는 플라스미드를 트랜스펙션(transfection, DNA를 동물 세포에 유입하는 방법)하기 위하여 미세 원침 튜브에 30초에 걸쳐 1㎍씩의 각각의 플라스미드를 천천히 점적하면서 혼합하여 실온에서 다시 15분간 방치하였다. 리포펙타민과 DNA-플라스미드의 혼합액과 HEK293T 세포주를 천천히 섞어 현탁액 상태로 20분간 실온에서 배양한 후 35mm 배양용기에 분주하고 CO₂ 배양기에서 24시간 동안 배양하였다. HEK293T 세포를 PBS로 2회 세척하고 각각의 배양용기에 500㎕의 추출용액을 가하여 세포를 파괴한 뒤 14,000rpm에서 5분간 원심분리 하였고, 얻어진 상층액을 실시예 6의 방법을 이용하여 뉴라미니데이즈 활성 실험에 사용하였다.

표 2는 울금 추출물로부터 분리한 용매추출물과 디아릴헵타노이드계 화합물 1 내지 화합물 3의 뉴라미니데이즈에 대한 활성을 측정한 결과이다. 표 2에 도시된 바와 같이 울금으로부터 분리한 디아릴헵타노이드계 화합물 1 내지 화합물 3의 IC₅₀값을 확인한 결과이다. 측정 결과 디아릴헵타노이드계 화합물 1 내지 화합물 3은 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈와 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈에 대하여 비슷한 농도인 6.50±0.53~13.74±1.64㎍/㎖ 농도에서 활성이 50% 정도로 저해되었다. 그러나, 타미플루는 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈에 대하여 1nM 정도에서 IC₅₀ 값을 보여 주었으나, 인위적으로 발생시킨 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈에 대하여 20nM 이상에서 IC₅₀ 값을 보일 정도로 억제활성이 현저히 줄어들었다. 이는 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈의 발생시 위험도를 보여주는 것으로, 울금으로부터의 디아릴헵타노이드계 화합물 1 내지 화합물 3은 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈와 타미플루 내성 신종플루 바이러스의 뉴라미니데이즈에 대한 사용 가능성을 나타낸다.

조건	신종플루(novel influenza) 바이러스의 뉴라미니데이즈에 대한 IC₅₀	타미플루 내성 바이러스의 신종플루 뉴라미니데이즈에 대한 IC₅₀
화합물 1 (㎍/㎖)	3.46±0.06	6.50±0.53
화합물 2 (㎍/㎖)	4.37±0.57	11.29±0.55
화합물 3 (㎍/㎖)	6.95±1.00	13.74±1.64
타미플루 (nM)	1	> 20
curcumin, M.W. 368 ; demethoxycurcumin, M.W. 338 ; bisdemethoxycurcumin, M.W. 308

< 실시예 8 : 바이러스 배양액을 이용한 뉴라미니데이즈의 활성 측정>

바이러스 기원의 뉴라미니데이즈 활성을 측정하기 위하여 조류 인플루엔자 바이러스(H9N2)와 돼지 인플루엔자 바이러스(H1N1)에서 유래한 바이러스 배양액으로부터 뉴라미니데이즈 활성을 측정하는 방법을 사용하였다.

바이러스 배양액을 이용한 뉴라미니데이즈의 활성은 실시예 4-1 및 실시예 4-2의 바이러스 배양액을 이용하여 실시예 6의 방법으로 측정하였고 에탄올 추출물의 각 분획 및 화합물 1 내지 화합물 3을 사용하여 뉴라미니데이즈의 활성을 측정한 결과 표 3과 표 4에 나타내었다. 표 3에서 보여준 바와 같이 에탄올 추출물 및 용매 분획물의 뉴라미니데이즈에 대한 활성정도를 비교하기 위하여 각각의 추출물을 최종농도 20㎍/㎖의 농도로 바이러스 배양액으로부터 얻은 뉴라미니데이즈에 대한 각각 추출물의 활성정도를 측정하였다. 표 3에서 보여준 결과에서 볼 수 있는 바와 같이, 추출물은 에틸아세테이트 분획 및 부탄올 분획에서 활성이 존재함을 확인하였다. 또한 에틸아세테이트 분획의 활성이 부탄올 분획보다 높음을 확인하였다.

조건	조류 인플루엔자 바이러스 (H9N2)의 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성(20μg/㎖)	돼지 인플루엔자 바이러스 (H1N1)의 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성(20μg/㎖)
A 분획 (에탄올 추출물)	27.8%	35.0%
B 분획 (헥산 추출물)	0%	5.2%
C 분획 (에틸아세테이트 추출물)	58.3%	55.8%
D 분획 (부탄올 추출물)	49.1%	51.7%

표 4에서 볼 수 있는 바와 같이 타미플루는 조류 인플루엔자 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성(12.05±1.00nM)이 돼지 인플루엔자 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 대한 저해활성(96.89±7.41nM) 보다 좋음을 확인할 수 있었다. 이러한 결과는 타미플루가 조류 인플루엔자에 선택적으로 작용하며 돼지 인플루엔자나 신종플루에 대한 활성이 적을 수 있음을 예시한다. 그러나, 본 특허의 화합물 1 내지 화합물 3은 표 4에서 보여주는 바와 같이 조류 인플루엔자 및 돼지 인플루엔자 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에게 둘 다 비슷한 농도에서 저해함을 확인하였다.

타미플루는 조류 인플루엔자의 뉴라미니데이즈 단백질 구조를 확인한 후 활성잔기에 선택적으로 결합하는 화합물을 합성하여 만든 것이다. 즉, 타미플루는 뉴라미니데이즈의 경쟁적 저해제(competitive inhibitor)로 활성잔기에 작용한다. 그러나, 최근 타미플루에 대한 내성 바이러스는 타미플루가 작용하는 활성잔기를 변형시키는 방법을 사용하여 내성작용을 획득하였다. 발명자들은 디아릴헵타노이드 계열의 화합물의 저해양식을 결정하기 위하여 화합물의 농도를 변화시키는 방법을 사용하여 저해형식을 검토하였다. 도 2에서와 같이 울금의 대표 화합물인 커큐민(화합물 1)은 비경쟁적 저해제로 돼지 인플루엔자 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈를 가역적으로 저해함을 알았다. 이러한 결과는 디아릴헵타노이드 계열의 화합물이 비경쟁적으로 뉴라미니데이즈에 작용하므로 내성 바이러스의 등장에도 불구하고 단독, 혹은 타미플루와 병용하여 광범위하게 사용할 수 있음을 확인시켜 준다.

조건	조류 인플루엔자 바이러스 (H9N2)의 뉴라미니데이즈에 대한 IC₅₀측정값	돼지 인플루엔자 바이러스 (H1N1)의 뉴라미니데이즈에 대한 IC₅₀측정값
화합물 1 (μg/㎖)	6.18±0.27	8.20±0.99
화합물 2 (μg/㎖)	7.73±0.20	10.26±0.54
화합물 3 (μg/㎖)	9.90±0.86	13.10±0.53
타미플루 (nM)	12.05±1.00	96.89±7.41

< 실시예 9 : 바이러스 배양액을 이용한 타미플루와 화합물의 병용 사용으로 뉴라미니데이즈의 활성 측정>

실시예 8에서 확인한 돼지 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니데이즈에 대한 타미플루의 50% 저해율은 96.89±7.41nM이었고, 조류 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니데이즈에 대한 타미플루의 50% 저해율은 12.05±1.00nM로 타미플루는 경쟁적 저해제로 확인되었다(본 특허에 경쟁적 저해제의 결과는 나타내지 않음). 실시예 8에서 확인된 결과로 본 발명의 화합물 중 하나인 커큐민은 비경쟁적 저해제(noncompetitive inhibitor)로 돼지 인플루엔자에 대하여 50% 저해율을 보이는 농도가 8.20±0.99㎍/㎖이었다. 경쟁적 저해제는 뉴라미니데이즈 효소가 화합물과 결합하는 효소 작용점(active pocket)에서 작용하므로 비경쟁적 저해제로서 뉴라미니데이즈 효소의 다른 부위에서 작용하는 커큐민을 첨가한다면 타미플루의 활성을 증가시킬 수 있다는 가정하에 커큐민을 이용하여 타미플루의 저해율을 계산하였다.

이를 위해 울금으로부터 나온 커큐민의 농도를 10μM로 고정한 후 실시예 4-1 및 실시예 4-2의 바이러스 배양액을 이용하여 돼지 인플루엔자 바이러스와 조류 인플루엔자 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈에 대한 타미플루의 50% 저해율을 실시예 6의 방법으로 측정한 결과, 돼지 인플루엔자 바이러스에 대한 타미플루의 50% 저해율은 5.92±0.77nM로 측정되어 타미플루과 커큐민을 병용시 타미플루의 활성을 약 16배 정도 증가시킬 수 있었으며, 조류 인플루엔자 바이러스의 경우 약 10배 정도 활성을 증가시킬 수 있었다. 현재 신종플루나 조류 인플루엔자의 대유행에 대하여 권장되고 있는 치료방법으로 타미플루 단독, 타미플루와 아만타딘(주로 rimantidine, 리만티딘), 잔나비르 등의 처방이 권장되고 있는 실정이나 아만타딘 계열은 높은 독성을 갖고 있다. 따라서 디아릴헵타노이드 계열의 화합물과 타미플루의 병용 치료법은 내성 바이러스 치료에 효과적인 전략이다. 표 5은 커큐민 10 μM과 병행한 타미플루 농도(nM)에 따른 조류 인플루엔자, 돼지 인플루엔자 바이러스의 뉴라미니데이즈 활성 저해율을 나타낸 것이다.

뉴라미니데이즈 종류	커큐민 10μM과 병행한 타미플루 농도
뉴라미니데이즈 종류	0.24 nM	0.48 nM	0.98 nM	1.9 nM	3.9 nM	7.8 nM	15.6 nM	31.3 nM	62.5 nM	125 nM
조류 인플루엔자 바이러스(H9N2)의 뉴라미니데이즈 활성 저해율(%)	37.1%	48.5%	50.0%	51.9%	53.0%	58.9%	67.6%	77.9%	93.3%	98.7%
돼지 인플루엔자 바아러스(H1N1)의 뉴라미니데이즈활성 저해율(%)	33.2%	34.8%	36.5%	42.2%	47.2%	52.1%	53.1%	61.1%	75.3%	84.0%

< 실시예 10 : 조류 및 돼지 인플루엔자 바이러스에 대한 적혈구응집시험>

분리된 화합물들의 항바이러스 활성을 측정하기 위하여 조류 인플루엔자 바이러스(H9N2)와 돼지 인플루엔자 바이러스(H1N1)를 이용하여 측정하였다. 신장 세포에 속하는 MDCK(Madin-Darby canine kidney) 세포를 계대 배양하여 300,000세포/㎖로 부유한 후, 96-웰 플레이트에 웰당 100㎕/웰씩 분주한 뒤 37℃ CO₂ incubator에서 1일간 배양한 후 10⁴ TCID₅₀/㎖로 희석된 조류 및 돼지 인플루엔자 바이러스를 감염시키고 37℃ CO₂ 배양기에서 1시간 동안 반응시킨다. 이후, 감염된 세포를 PBS로 3회 세척한 뒤 화합물을 최종농도 10㎍/㎖이 되도록 희석하여 3개 웰에 각각 분주하고 37℃ CO₂ 배양기에서 5일간 배양하였다. 양성대조군으로서 타미플루를 동일한 농도로 첨가하고, 음성대조군은 조류 및 돼지 인플루엔자 바이러스만 감염시켜 비교 평가하였다. 바이러스가 숙주세포에 유착하면 특정 적혈구의 응집을 일으키므로 세포 배양액 중에 존재하는 바이러스를 간접적으로 정량하는 방법 중의 하나인 적혈구응집시험(HA; Hemagglutination assay)을 실시하여 활성을 평가하여 표 6에 나타내었다.

표 6의 결과를 보면 적혈구 응집시험의 결과 뉴라미니데이즈를 저해하는 화합물 1 내지 화합물 3이 적혈구 응집을 저해함을 확인하였으며, 동일 농도로 사용한 타미플루도 적혈구 응집을 저해함을 확인하였다.

조건	조류 인플루엔자 바이러스(H9N2)의 적혈구 응집저해작용	돼지 인플루엔자 바이러스(H1N1)의 적혈구 응집저해작용
A 분획 (에탄올 추출물)	없음(-)	없음(-)
B 분획 (헥산 추출물)	없음(-)	없음(-)
C 분획 (에틸아세테이트 추출물)	있음(+)	있음(+)
D 분획 (부탄올 추출물)	없음(-)	없음(-)
화합물 1	있음(+)	있음(+)
화합물 2	있음(+)	있음(+)
화합물 3	있음(+)	있음(+)
타미플루	있음(+)	있음(+)

< 실시예 11 : 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 닭의 수정란 이용 활성측정>

본 발명의 화합물이 조류 인플루엔자 바이러스의 성장에 미치는 영향을 알아보기 위하여 닭의 수정란(embryonated egg)을 이용한 조류 인플루엔자 바이러스의 성장 저해 실험을 수행하였다. 적혈구응집시험(HA)에서 바이러스 저해 효과를 나타내는 화합물과 조류 인플루엔자 바이러스를 10⁴ EID₅₀/㎖로 희석한 후 화합물 1 내지 화합물 3, 추출용매를 달리한 추출물 또는 및 분리정제 단계에서 각각의 추출분획 및 대조군으로 사용한 타미플루를 최종농도 10㎍/㎖으로 고정시킨 뒤 바이러스와 1:1로 혼합하여 실온에서 1시간 반응시킨 후 11일령 발육란의 요막강(Allantoic cavity)에 100㎕씩 접종하였다. 음성 대조군은 발육란에 조류 인플루엔자 바이러스만 접종하였고, 양성 대조군으로는 타미플루를 사용하여 실시하였다. 바이러스 접종 후 바로 부화기(37.8℃, 60%)에 48시간 배양한 후 4℃ 냉실에 12시간 보관하였다. 이 후 각각의 수정란 접종부의 상층부 난각을 제거하여 요막강액만을 취한 후 이진법으로 희석한 후 1% 닭 적혈구(chicken RBCs)를 사용하여 적혈구 응집반응을 하여 바이러스 증식 저해 능력을 측정하였다.

바이러스의 저해 능력을 측정한 결과 표 7에서 보듯이, 울금으로부터 분리한 화합물 1 내지 화합물 3을 투여한 군에서는 바이러스 증식이 저해되었으나 타미플루를 투여한 군에서는 바이러스 증식이 진행되고 있는 것을 관찰하였다. 이는 타미플루는 감염초기에 바이러스의 확산을 방지하는 역할을 하나 바이러스의 복제단계에서는 역할을 하지 못하는 것이라고 추측된다. 이러한 결과로부터 울금으로부터의 화합물은 뉴라미니데이즈의 비선택적인 저해능력뿐만이 아니라 바이러스 자체의 복제단계에서 저해 역할을 하는 것으로 추정할 수 있다.

조건	수정란 1	수정란 2	수정란 3	수정란 4
1. 메탄올 30% 추출물	1:128	1:128	1:256	1:128
2. 메탄올 70% 추출물	-^*	-	1:128	1:128
3. 메탄올 100% 추출물	1:128	-	1:256	-
4. 아세톤 추출물	1:64	1:256	1:128	1:128
5. 에탄올 30% 추출물	1:256	1:256	1:256	1:256
6. 에탄올 70% 추출물	1:128	1:128	1:256	1:256
7. 에탄올 100% 추출물 (실시예 1의 A 분획)	1:32	1:256	1:128	1:128
8. n-헥산 분획 (실시예 1의 B 분획)	1:128	1:128	1:128	1:256
9. 에틸아세테이스 분획 (실시예 1의 C 분획)	-	1:256	1:128	-
10. 부탄올 분획 (실시예 1의 D 분획)	1:128	1:256	1:256	1:128
11. 화합물 1	-	-	-	-
12. 화합물 2	-	-	-	-
13. 화합물 3	-	-	-	-
14. 타미플루 (양성대조군)	1:256	1:256	1:256	1:256
15. 음성대조군	1:256	1:256	1:256	1:256
상기 조건 1 내지 7은 울금 1㎏을 사용 용매 3ℓ을 사용하여 4시간 동안 3회에 걸쳐 환류 냉각기를 이용하여 얻은 다음 용매를 제거하여 얻은 울금 추출물임 -^* <1:2의 음성을 의미함 1:32, 1:64, 1:128, 1:256; 배양액의 희석배수(HA units)

< 실시예 12 : 조류 인플루엔자 바이러스에 대한 병아리 이용 in - vivo 활성>

본 실험을 진행하기 위하여 300 g의 체중을 갖고 있는 병아리를 군당 5마리씩 준비하였으며, 1주간의 적응기간을 가진 후, 12시간 간격의 낮(오전 7시~오후 17시)과 밤의 주기에 따라 관리하였다. 군은 1) 커큐민 투여군(20mg/kg/day), 2) 타미플루 투여군(10mg/kg/day), 3) 대조군(30% PEG 용액) 투여군의 총 3개 군으로 나뉘어 실시하였다.

모든 그룹의 닭에 조류 인플루엔자 바이러스인 A/Chicken/Korea /01310/2001(H9N2)을 비강을 통하여 수당 10^5.5EID₅₀으로 공격접종 한 후 공격접종일부터 매일 동일한 시간에 1회씩(24시간마다) 화합물을 0.4㎖씩 경구 투여하였다. 접종 4일째 및 6일째에, 상부기도(기관)를 전용면봉으로 긁어내어 상부기도 내의 공격접종 바이러스의 함량을 표 8의 조건의 리얼타임 PCR을 사용하여 분석 하였다. 리얼타임 PCR은 Ct값으로 비교하였는데 Ct값은 일정한 수치까지 DNA 양이 도달하기 위한 PCR 주기를 말하며 따라서 특정 유전자에 대한 Ct값이 적을수록 해당 유전자의 양이 많다는 것이며 Ct값이 높다는 것은 해당 유전자의 양이 적다는 것을 의미한다. 해당 유전자의 양이 극도로 적을 때는 ‘Undetermined’로 표기된다.

Specificity and size	Primer/Probe	Sequence*
Matrix gene, 100 base pairs	M-F	5'-AGA TGA GTC TTC TAA CCG AGG TCG-3'
	M-R	5'-TGC AAA AAC ATC TTC AAG TCT CTG-3'
	M-Probe	FAM-TCA GGC CCC CTC AAA GCC GA-TAMRA
* Realtime PCR target gene : Influenza virus type A의 Matrix gene (Reference : J. Vet. Diagn. Invest 16:367-373(2004)

표 9에서 보여준 결과에서 보듯이, 닭에서 항바이러스 활성을 측정한 결과 화합물 커큐민을 닭에게 20mg/kg/㎖의 농도로 경구투여한 군에서 좋은 저해 활성을 나타내었다. 타미플루와 커큐민을 4일 경구 투여한 후, 상부기도에서 바이러스의 농도를 측정한 결과 타미플루를 투여한 군에서는 1마리의 닭을 제외하고는 바이러스가 검출되지 않았다. 그러나 울금을 투여한 군에서는 25.3±2.7의 Ct값을 보여주었다. 그러나 특이한 결과는 6일째에 관찰결과 타미플루 투여군에서는 1마리의 미 검출된 개체를 제외한 대부분의 닭에서 31.9±3.1 Ct값으로 바이러스의 검출이 증가된 결과에 반하여 커큐민을 6일 투여한 군에서는 29.5±1.2 Ct값으로 바이러스의 농도가 감소하였다. 이러한 결과는 실시예 11에서 울금으로부터 분리한 화합물 1 내지 화합물 3을 투여한 군에서는 바이러스를 저해하는 능력이 관찰되었으나 타미플루를 투여한 군에서는 바이러스가 관찰된 사실과 동일함을 알 수 있다. 즉, 타미플루에 의한 바이러스 저해활성은 바이러스의 감염단계에서의 뉴라미니데이즈를 저해하여 확산을 방지하는 역할에 기인한 것이다. 즉 감염초기에는 타미플루가 바이러스의 확산을 방지하는 역할을 하나 바이러스의 복제단계에서는 그 역할을 하지 못하기 때문이다. 따라서 울금으로부터 추출된 상기 화합물은 상기 바이러스 유래의 질병에 대한 좋은 치료 후보물질이라는 것을 확인할 수 있다.

조건	각 개체의 ID	정량값(Ct)
조건	각 개체의 ID	4 일	6 일
커큐민(20㎎/㎏/day로 경구 투여한 군)	C-1	25.2	30.21
	C-2	22.5	28.39
	C-3	23.7	28.86
	C-4	29.6	31.29
	C-5	25.7	28.80
	평균	25.3 ± 2.7	29.5 ± 1.2
타미플루(10㎎/㎏/day로경구 투여한 군)	T-1	Undetermined	Undetermined
	T-2	Undetermined	29.0
	T-3	32.8	36.5
	T-4	Undetermined	30.7
	T-5	Undetermined	31.2
	평균	Undetermined	31.9 ± 3.3

<실시예 13: 독성실험>

13-1. 급성독성

울금으로부터 추출된 활성분획과 화합물 1 내지 화합물 3을 단기간에 과량을 섭취하였을 시 급성적(24시간 이내)으로 동물 체내에 미치는 독성을 조사하고, 치사율을 결정하기 위하여 본 실험을 수행하였다. 일반적인 마우스인 ICR 마우스 계통 50 마리를 대조군은 10마리, 실험군은 10마리씩 배정하였다. 대조군에는 30% PEG-400만을 투여하고, 실험군은 울금으로부터 추출된 활성분획을 상기한 실시예 12에서 이용된 투여농도인 20㎎/㎏의 50배(1.0g/㎏)의 농도로 각각 경구 투여하였다. 투여 24시간 후에 각각의 치사율을 조사한 결과, 대조군과 1.0g/㎏ 농도의 울금 에탄올 추출물과 화합물 1 내지 화합물 3을 투여한 실험군에서는 모두 생존하였다.

13-2 : 실험군 및 대조군의 장기 및 조직 독성 실험

장기 독성 실험은 C57BL/6J 생쥐를 대상으로 동물의 각 장기(조직)에 미치는 영향을 조사하기 위하여 화합물 1 내지 화합물 3 및 에탄올 추출물을 투여한 실험군과 용매만을 투여한 대조군의 동물들로부터 8주 후 혈액을 채취하여 GPT(glutamate-pyruvate transferase) 및 BUN(Blood Urea Nitrogen)의 혈액 내 농도를 Select E(Vital Scientific NV, Netherland) 기기를 이용하여 측정하였다. 그 결과, 간독성과 관계있는 것으로 알려진 GPT와 신장독성과 관계있는 것으로 알려진 BUN의 경우, 대조군과 비교하여 실험군은 별다른 차이를 보이지 않았다. 또한, 각 동물로부터 간과 신장을 정취하여 통상적인 조직절편 제작과정을 거쳐 광학현미경으로 조직학적 관찰을 시행하였으며 특이한 이상이 관찰되지 않았다.

<사용예 1 : 약학적 제제예>

1-1. 정제의 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 200g을 락토오스 175.9g, 감자전분 180g 및 콜로이드성 규산 32g과 혼합하였다. 이 혼합물에 10% 젤라틴 용액을 첨가시킨 후, 분쇄해서 14 메쉬체를 통과시켰다. 이것을 건조시키고 여기에 감자전분 160g, 활석 50g 및 스테아린산 마그네슘 5g을 첨가해서 얻은 혼합물을 정제로 만들었다.

1-2. 주사액제의 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 1g, 염화나트륨 0.6g 및 아스코르브산 0.1g을 증류수에 용해시켜서 100㎖를 만들었다. 이 용액을 병에 넣고 20℃에서 30분간 가열하여 멸균시켰다.

< 사용예 2 : 식품 제조예 >

2-1. 조리용 양념의 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 각각 0.2~10 중량부로 건강 증진용 조리용 양념을 제조하였다.

2-2. 밀가루 식품의 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물을 각각 0.1~5.0 중량부를 밀가루에 첨가하고, 이 혼합물을 이용하여 빵, 케이크, 쿠키, 크래커 및 면류를 제조하여 건강 증진용 식품을 제조하였다.

2-3. 스프 및 육즙(gravies)의 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 각각 0.1~1.0 중량부를 스프 및 육즙에 첨가하여 건강 증진용 육가공 제품, 면류의 수프 및 육즙을 제조하였다.

2-4. 유제품(dairy products)의 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 각각 0.1~1.0 중량부를 우유에 첨가하고, 상기 우유를 이용하여 버터 및 아이스크림과 같은 다양한 유제품을 제조하였다.

<사용예 3 : 음료 제조예>

3-1. 야채쥬스 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 0.5g을 토마토 또는 당근 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 야채쥬스를 제조하였다.

3-2. 과일쥬스 제조

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 0.1g을 사과 또는 포도 쥬스 1,000㎖에 가하여 건강 증진용 과일쥬스를 제조하였다.

< 사용예 4 : 사료첨가제 제조예 >

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 10.0g을 부형제를 50.0g에 섞어 사료첨가제를 제조하였다. 그러나, 그 배합비를 임의로 변형 실시하여도 무방하며, 통상의 사료조성물 제조방법에 따라 상기의 성분을 혼합하여 제조에 사용할 수 있다.

< 사용예 5 : 소독물의 제조>

본 발명에 따른 울금 추출물 또는 이로부터 분리된 화합물 3.0g을 첨가한 후 정제수를 1,000㎖에 가하여 무방부제용 천연 소독제를 제조하였다.

도 1은 울금으로부터 분리한 활성 커큐미노이드를 분리하여 구조를 확인한 후, HPLC 상에서 나타나는 피크와 화합물을 도시한 HPLC 분석 스펙트럼을 나타낸 것이다.

도 2는 커큐민(화합물 1)이 비경쟁적 저해제로 돼지 인플루엔자 바이러스 기원의 뉴라미니데이즈를 저해함을 나타낸 것이다.

Claims

울금(Curcuma longa)을 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민의 화합물 중 적어도 하나이상 함유하는 것을 특징으로 하는 울금추출물을 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
울금(Curcuma longa)을 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민의 화합물 중 적어도 하나이상 함유하는 것을 특징으로 하는 울금추출물을 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민 중 적어도 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민 중 적어도 하나 이상을 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품.
울금(Curcuma longa)을 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민의 화합물 중 적어도 하나이상 함유하는 울금추출물과 타미플루를 유효성분으로 포함하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루 및 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
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비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민 중 적어도 하나 이상의 화합물과 타미플루를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루 및 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 치료용 약학조성물.
비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민 중 적어도 하나 이상의 화합물과 타미플루를 유효성분으로 함유하는 것을 특징으로 하는 조류 및 돼지 인플루엔자와 신종플루 및 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 개선용 건강기능식품
울금(Curcuma longa)을 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민 또는 커큐민의 화합물 중 적어도 하나이상 함유하는 것을 특징으로 하는 울금추출물을 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 치료용 사료첨가제.
울금(Curcuma longa)을 에탄올, 메탄올, 아세톤, 에틸아세테이트 또는 클로로포름 중에서 선택된 1종 이상의 추출용매로 추출하여 비스데메톡시커큐민, 데메톡시커큐민(demethoxycurcumin) 또는 커큐민의 화합물 중 적어도 하나이상 함유하는 것을 특징으로 하는 울금추출물을 활성성분으로 포함하는 것을 특징으로 하는 타미플루 내성 신종플루 관련 질환의 예방 또는 치료용 천연소독제.