CN108178795A - 从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括：预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，首先将比目鱼鱼鳞以稀盐酸浸泡除杂，以乙酸溶液提取，加入胃蛋白酶酶解制得胶原蛋白，在胶原蛋白溶液中加入木瓜蛋白酶、茴香丙酮酶解，经超滤后制得胶原蛋白肽。有益效果为：两次酶解法制备得到比目鱼鱼鳞胶原蛋白肽，成本低廉，酶解效率较高，反应时间较短，胶原蛋白肽的分子量均匀，活性较高。
Description
技术领域
本发明涉及胶原蛋白肽提取领域，尤其是涉及从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法。
技术背景
比目鱼又叫鲽鱼，硬骨鱼纲鲽形目鱼类的统称。体甚侧扁，呈长椭圆形、卵圆形或长舌形，最大体长可达5米。成鱼身体左右不对称。两眼均位于头的左侧或右侧。口稍突出。鳍一般无鳍棘。背鳍和臀鳍基底长，与尾鳍相连或不连。广泛分布于各大洋的暖热海域中，主要以底栖无脊椎动物和鱼类为食。种类繁多，全世界有540余种，中国产120种，主要类别有鳒、鲆、鲽、鳎、舌鳎等，为经济鱼类。栖息在浅海的沙质海底，捕食小鱼虾。它们特别适于在海床上的底栖生活。由于它们的身体扁平。双眼同在身体朝上的一侧，这一侧的颜色与周围环境配合得很好；它们身体的朝下一侧为白色。比目鱼的身体表面有极细密的鳞片。比目鱼只有一条背鳍，从头部几乎延伸到尾鳍。它们主要生活在温带水域，是温带海域重要的经济鱼类。
鱼鳞：指鱼外表保护自身，防止水流失的外壳，一般呈扇状。鱼鳞含有丰富的蛋白质、脂肪和多种维生素，还有铁、锌、钙和多种人体必需的微量元素以及胶质。鱼鳞通常都是当做废物丢弃，既污染了环境，又浪费了资源。
发明内容
本发明的目的在于提供从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，本提取方法简单易行，成本低廉，酶解效率较高，反应时间较短，胶原蛋白肽的分子量均匀，活性较高。
本发明针对背景技术中提到的问题，采取的技术方案为：从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括：预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，具体包括以下步骤：
预处理：将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入0.5-0.8mol/L稀盐酸溶液中浸泡45-60分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80-100目筛；预处理可以去除鱼鳞中的污泥、粘液、金属离子等杂质，可以降低杂质对提取过程的影响程度，提高提取效率；
提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入6-8倍量的3-5%乙酸溶液，然后在2-4℃温度下提取12-24小时；在2-4℃、8500-9000r/min条件下将酸提液离心20-40分钟，收集上清液；剩余残渣按1g:10-15mL的比例浸入3-5g/L胃蛋白酶溶液中，调节pH为1.2-2.5，温度为10-15℃，在频率为40-60kHz、密度为0.50-0.53W/cm2的超声波辅助下提取6-8小时；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液；酸法浸提配合胃蛋白酶提取可以将比目鱼鱼鳞中85%以上的蛋白质提取出来，提取效率较高，而且用时较短，成本低廉；
提取胶原蛋白肽：将胶原蛋白液调整为浓度为1.5-1.6%，调节pH值至6.2-6.5，然后，加入胶原蛋白液溶质重量4-8%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量5.0-7.0%的茴香丙酮，在60-62℃温度下酶解25-30分钟，将酶解液置于沸水中处理10-15分钟灭酶，冷却后于4000-6000r/min条件下离心20-45分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高pH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本；同时茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的胶原蛋白肽；
纯化：将胶原蛋白肽溶液在2-4℃温度下依次使用30kDa、10kDa、3kDa的超滤膜进行超滤，可得到分子量分别为10-30kDa、3-10kDa、<3kDa的胶原蛋白肽组分；胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。
与现有技术相比，本发明的优点在于：1）以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高pH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本；同时茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的胶原蛋白肽；2）胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明方案作进一步说明：
实施例1：
从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括以下步骤：
1）将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入0.5mol/L稀盐酸溶液中浸泡45分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80目筛；2）准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入6倍量的3%乙酸溶液，然后在2℃温度下提取12小时；在2℃、8500r/min条件下将酸提液离心20分钟，收集上清液；剩余残渣按1g:10mL的比例浸入3g/L胃蛋白酶溶液中，调节pH为1.2，温度为10℃，在频率为40kHz、密度为0.50W/cm2的超声波辅助下提取6小时；3）将胶原蛋白液调整为浓度为1.5%，调节pH值至6.2，然后，加入胶原蛋白液溶质重量4%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量5.0%的茴香丙酮，在60℃温度下酶解25分钟，将酶解液置于沸水中处理10分钟灭酶，冷却后于4000r/min条件下离心20分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；4）将胶原蛋白肽溶液在2℃温度下依次使用30kDa、10kDa、3kDa的超滤膜进行超滤，可得到分子量分别为10-30kDa、3-10kDa、<3kDa的胶原蛋白肽组分；胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。
实施例2：
从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括：预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，具体包括以下步骤：
1）预处理：将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入0.8mol/L稀盐酸溶液中浸泡60分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过100目筛；预处理可以去除鱼鳞中的污泥、粘液、金属离子等杂质，可以降低杂质对提取过程的影响程度，提高提取效率；
2）提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入8倍量的5%乙酸溶液，然后在4℃温度下提取24小时；在4℃、9000r/min条件下将酸提液离心40分钟，收集上清液；剩余残渣按1g:15mL的比例浸入5g/L胃蛋白酶溶液中，调节pH为2.5，温度为15℃，在频率为60kHz、密度为0.53W/cm2的超声波辅助下提取8小时；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液；酸法浸提配合胃蛋白酶提取可以将比目鱼鱼鳞中85%以上的蛋白质提取出来，提取效率较高，而且用时较短，成本低廉；
3）提取胶原蛋白肽：将胶原蛋白液调整为浓度为1.6%，调节pH值至6.5，然后，加入胶原蛋白液溶质重量8%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量7.0%的茴香丙酮，在62℃温度下酶解30分钟，将酶解液置于沸水中处理15分钟灭酶，冷却后于6000r/min条件下离心45分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高pH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本；同时茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的胶原蛋白肽；
4）纯化：将胶原蛋白肽溶液在4℃温度下依次使用30kDa、10kDa、3kDa的超滤膜进行超滤，可得到分子量分别为10-30kDa、3-10kDa、<3kDa的胶原蛋白肽组分；胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。
实施例3：
从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，包括：预处理、提取胶原蛋白、提取胶原蛋白肽、纯化，具体包括以下步骤：
预处理：将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入0.6mol/L稀盐酸溶液中浸泡50分钟，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80目筛；预处理可以去除鱼鳞中的污泥、粘液、金属离子等杂质，可以降低杂质对提取过程的影响程度，提高提取效率；
提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入7倍量的4%乙酸溶液，然后在3℃温度下提取16小时；在3℃、8600r/min条件下将酸提液离心30分钟，收集上清液；剩余残渣按1g:12mL的比例浸入4g/L胃蛋白酶溶液中，调节pH为2.0，温度为12℃，在频率为45kHz、密度为0.52W/cm2的超声波辅助下提取7小时；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液；酸法浸提配合胃蛋白酶提取可以将比目鱼鱼鳞中85%以上的蛋白质提取出来，提取效率较高，而且用时较短，成本低廉；
提取胶原蛋白肽：将胶原蛋白液调整为浓度为1.5%，调节pH值至6.4，然后，加入胶原蛋白液溶质重量6%的木瓜蛋白酶，再加入木瓜蛋白酶重量6.0%的茴香丙酮，在60℃温度下酶解28分钟，将酶解液置于沸水中处理13分钟灭酶，冷却后于5500r/min条件下离心35分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；以胃蛋白酶酶解后无需灭酶即升高pH值并以木瓜蛋白酶酶解，不仅减少了提取时间，而且降低了提取的功耗与成本；同时茴香丙酮可以作用于木瓜蛋白酶的活性中心半胱氨酸的巯基，提高木瓜蛋白酶的活性，进而加快酶解反应的进行，提高酶解效率，降低反应时间，获得分子量均匀、活性较高的胶原蛋白肽；
纯化：将胶原蛋白肽溶液在3℃温度下依次使用30kDa、10kDa、3kDa的超滤膜进行超滤，可得到分子量分别为10-30kDa、3-10kDa、<3kDa的胶原蛋白肽组分；胶原蛋白肽具有较强的抗氧化作用，能够清楚机体多余的自由基，同时比目鱼胶原蛋白肽中的咪唑基具有螯合金属离子的作用，能有效的阻止金属离子的催化作用，特别地，分子量位于3-10kDa之间的肽链内氨基酸间的短程相互作用，强化了酪氨酸等作为质子供体的能力，增强了与体内自由基的相互作用，表现为尤为高效的抗氧化作用。
本发明操作步骤中的常规操作为本领域技术人员所熟知，在此不进行赘述。
以上所述的实施例对本发明的技术方案进行了详细说明，应理解的是以上所述仅为本发明的具体实施例，并不用于限制本发明，凡在本发明的原则范围内所做的任何修改、补充或类似方式替代等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (8)
1.从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述的提取胶原蛋白肽的方法包括：
预处理：将比目鱼鱼鳞清洗干净，放入稀盐酸溶液中浸泡，处理完成后用清水洗涤至中性，然后烘干、粉碎，过80-100目筛；
提取胶原蛋白：准确称取预处理过的鱼鳞样品，加入6-8倍量乙酸溶液中提取；在2-4℃、8500-9000r/min条件下将酸提液离心20-40分钟，收集上清液；剩余残渣按1g:10-15mL的比例浸入胃蛋白酶溶液中，在超声波辅助下提取；酶提液在相同条件下离心后，合并上清液，即得到胶原蛋白液；
提取胶原蛋白肽：调节胶原蛋白液的浓度与pH值，然后，加入木瓜蛋白酶、茴香丙酮酶解，将酶解液置于沸水中处理10-15分钟灭酶，冷却后于4000-6000r/min条件下离心20-45分钟，收集上清液即的胶原蛋白肽溶液；
纯化：将胶原蛋白肽溶液在2-4℃温度下使用超滤膜进行超滤，可得到胶原蛋白肽组分。
2.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述预处理步骤中稀盐酸溶液的浓度为0.5-0.8mol/L，浸泡时间为45-60分钟。
3.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述提取胶原蛋白步骤中，乙酸溶液的质量分数为3-5%，提取温度为2-4℃，提取时间为12-24小时。
4.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述提取胶原蛋白步骤中，胃蛋白酶溶液的浓度为3-5g/L，pH为1.2-2.5，温度为10-15℃，酶解时间为6-8小时。
5.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述提取胶原蛋白步骤中，超声波的频率为40-60kHz、密度为0.50-0.53W/cm2。
6.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述提取胶原蛋白肽步骤中，将胶原蛋白液调整为浓度为1.5-1.6%。
7.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述提取胶原蛋白肽步骤中，木瓜蛋白酶的添加量为胶原蛋白液溶质重量的4-8%，茴香丙酮的添加量为木瓜蛋白酶重量的5.0-7.0%，酶解温度为60-62℃，pH值为6.2-6.5，酶解时间为25-30分钟。
8.根据权利要求1所述的从比目鱼鱼鳞中提取胶原蛋白肽的方法，其特征在于：所述纯化步骤中的超滤膜为30kDa、10kDa、3kDa。
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Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109735590A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-05-10 | 江西师范大学 | 一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法 |
| CN112724245A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-04-30 | 海南华研胶原科技股份有限公司 | 一种鱼鳞酶解提取小分子胶原蛋白肽的方法 |
| CN114480538A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-05-13 | 海南三元星生物科技股份有限公司 | 一种海洋生物抗氧化活性肽组合物及其制备方法 |
Citations (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017171598A (ja) * | 2016-03-23 | 2017-09-28 | 富士フイルム株式会社 | Ｅｎｄｏ１８０亢進剤及び化粧料 |
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| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| JP2017171598A (ja) * | 2016-03-23 | 2017-09-28 | 富士フイルム株式会社 | Ｅｎｄｏ１８０亢進剤及び化粧料 |
Non-Patent Citations (1)
| Title |
|---|
| 贺江等: "草鱼鱼鳞胶原蛋白提取及活性肽制备研究", 《食品研究与开发》 * |
Cited By (3)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN109735590A (zh) * | 2019-02-28 | 2019-05-10 | 江西师范大学 | 一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法 |
| CN112724245A (zh) * | 2021-02-04 | 2021-04-30 | 海南华研胶原科技股份有限公司 | 一种鱼鳞酶解提取小分子胶原蛋白肽的方法 |
| CN114480538A (zh) * | 2021-12-24 | 2022-05-13 | 海南三元星生物科技股份有限公司 | 一种海洋生物抗氧化活性肽组合物及其制备方法 |
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