CN109735590A

CN109735590A - 一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法

Info

Publication number: CN109735590A
Application number: CN201910148851.3A
Authority: CN
Inventors: 涂宗财; 李军; 张露; 卢素珍
Original assignee: Jiangxi Normal University
Current assignee: Jiangxi Normal University
Priority date: 2019-02-28
Filing date: 2019-02-28
Publication date: 2019-05-10

Abstract

本发明公开了一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，以鱼鳞为原料，对鱼鳞进行脱钙，再采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶对鱼鳞进行二步酶解，获得鱼鳞明胶高抗氧化性肽。本发明以草鱼加工副产物鱼鳞为原料，酸法脱钙加速胶原蛋白的溶出，提高抗氧化肽的纯度，先采用碱性蛋白酶一步酶解，后胰蛋白酶对酶解物进行二步酶解，增加抗氧化肽含量。本发明制备高抗氧化肽的方法操作简单，无毒无害，容易实现，制得的抗氧化肽的•OH清除能力高于二丁基羟基甲苯（BHT），有良好的抗氧化性，在保健食品、医药、化妆品等领域具有很高的实用价值。

Description

一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法

技术领域

本发明属于鱼明胶材料技术领域，尤其涉及一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法。

背景技术

我国水域辽阔，淡水鱼资源十分丰富，近年来，随着淡水鱼产量不断增加，淡水鱼加工业也随着增加。但在鱼糜等水产品加工高速发展的同时也会产生大量的副产物。研究表明，这些副产物含有大量的蛋白质、脂肪、矿物质元素等营养活性物质，但副产物一直被人们简单加工成饲料或者作为废弃物处理，这样不仅造成了资源浪费，经济损失，还污染环境。鱼鳞是淡水鱼加工过程中主要的副产物之一，含有大量的胶原蛋白等营养物质，因鱼鳞表面被羟基磷灰石等矿物质附着，导致鱼鳞一直没有被有效利用。

在食品加工过程中，为了提高产品的品质，或延长商品的货架期，通常会加入一定的食品添加剂（如二丁基羟基甲苯），虽然有效的清除自由基、减缓氧化反应，防止食品酸败，但其安全系数较低，对人体健康也存在致癌的风险。抗氧化肽，是蛋白质通过酶解得到的介于一定分子量范围的具有清除体内氧自由基的能力并且可以起到抗氧化、防衰老活性作用的多肽，已成为研究热点。现在由于疯牛病、猪瘟等动物疾病、宗教信仰和素食者的饮食需求，导致哺乳动物多肽的来源受到一定限制，人们逐渐将目光慢慢转移到水产动物上。

发明内容

本发明提供了一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，以鱼鳞为原料，对鱼鳞进行脱钙，再采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶对鱼鳞进行二步酶解，获得鱼鳞明胶高抗氧化性肽。

进一步地，所述制备方法具体步骤为：

1、原料预处理：剔除鱼鳞表面的杂质，冲洗干净，烘干，再采用酸液对鱼鳞进行脱钙处理，脱钙后的鱼鳞冲洗干净并烘干；

2、草鱼鱼鳞明胶的制备：将上述烘干后的鱼鳞加入水中，加热提取，提取后抽滤获得提取液，提取液冷冻干燥，获得冻干的鱼磷明胶；

3、一步酶解：将所述冻干的鱼磷明胶溶解在蒸馏水中得到鱼鳞明胶溶液，采用碱性蛋白酶对所述鱼鳞明胶溶液进行一步酶解处理，酶解结束后灭酶，酶解液离心分离，取上清液进行冷冻干燥，获得冻干的酶解物；

4、二步酶解：将所述冻干的酶解物配制成酶解物溶液，用胰蛋白酶进行二步酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液，即获得所述鱼鳞明胶高抗氧化性肽。

进一步地，所述步骤1中，酸液为浓度0.3～0.7 mol/L的盐酸，鱼鳞与盐酸的料液比为1:10～30 g:mL，脱钙时间为1～3 h。

进一步地，所述步骤2中，所述加热提取的参数为：料液比为1:15～20 g:mL，pH5.0～6.0，在80℃的条件下水浴加热提取2 h以上，pH通过向水中滴加稀盐酸进行调节。

进一步地，所述步骤3中，所述鱼鳞明胶溶液中鱼磷明胶质量分数为10%，所述碱性蛋白酶添加量为鱼鳞明胶溶液中鱼鳞明胶质量的1%，一步酶解条件为pH 8.0、酶解温度50℃、酶解时间4 h，通过0.1 mol/L NaOH溶液将pH调节到8.0。

进一步地，所述步骤4中，所述酶解物溶液中冻干的酶解物配比为50～100 mg/mL，胰蛋白酶的添加质量与酶解物溶液的质量比为0.5%～2%、二步酶解调条件为pH 7～9、温度为40～60℃，酶解时间40～60 min，通过0.1 mol/L NaOH调节溶液pH。

进一步地，所述二步酶解参数为：酶解物溶液中冻干的酶解物配比为100mg/mL 、pH 7.75、温度53.19℃、时间50min。

进一步地，所述鱼鳞为草鱼鱼鳞。

通过上述技术方案可知，本发明的有益效果在于：本发明以草鱼加工副产物鱼鳞为原料，酸法脱钙加速胶原蛋白的溶出，提高抗氧化肽的纯度，先采用碱性蛋白酶一步酶解，后胰蛋白酶对酶解物进行二步酶解，增加抗氧化肽含量。本发明制备高抗氧化肽的方法操作简单，无毒无害，容易实现，制得的抗氧化肽的•OH清除能力高于二丁基羟基甲苯（BHT），有良好的抗氧化性，在保健食品、医药、化妆品等领域具有很高的实用价值。

具体实施方式

下面结合实施例进行详细的说明：

实施例1

一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，具体步骤为

1、原料预处理：剔除草鱼鱼鳞表面中的杂质，用自来水冲洗干净，40℃烘干备用。采用0.3 mol/L盐酸对鱼鳞进行脱钙，鱼鳞与盐酸的料液比为1:10（g:mL），脱钙时间为1 h。脱钙之后用自来水冲洗3-5次，烘干。

2、草鱼鱼鳞明胶的制备：将上述的干鱼鳞加入到蒸馏水中，鱼鳞与水的料液比为1:15（g:mL），pH 5.5(用0.1 mol/L的盐酸调节至指定pH)，在80℃的条件下水浴加热提取2h。抽滤之后的提取液进行冷冻干燥。

3、一步酶解：用蒸馏水将冻干的鱼磷明胶溶解得到鱼鳞明胶质量配比为10%的鱼鳞明胶溶液。加入碱性蛋白酶进行酶解，碱性蛋白酶添加量为鱼鳞明胶质量的1%，酶解条件为pH 8.0(用0.1 mol/L的NaOH水溶液调节至指定pH)、温度50℃、时间4 h。酶解结束之后煮沸10 min进行灭酶，酶解液冷却后4000 r/min离心10 min，上清液进行冻干。

4、二步酶解：将上述冻干的酶解物溶解在水中配制成酶解物配比为50 mg/mL的溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的添加量为0.5%、pH 7.8(用0.1 mol/L的NaOH水溶液调节至指定pH)、温度为40℃，酶解时间40 min。酶解结束后煮沸灭酶酶10 min，离心取上清液，冷冻干燥，即获得所述鱼鳞明胶高抗氧化性肽。

羟自由基清除能力测定

将上述二步酶解的酶解物配制成1 mg/mL的溶液。500 μL的样品与150 μL 8 mM FeSO₄、125 μL 20 mM H₂O₂、500 μL 3 mM水杨酸（乙醇溶解），37°C水浴反应20 min，离心1 min。上清液于510 nm处测吸光值。500 μL蒸馏水代替样品的吸光值为，125 μL甲醇代替H₂O₂的吸光值为。相同浓度的BHT作为阳性对照，实验重复三次。·OH清除率根据公式进行计算：

实验研究表明，碱性-胰蛋白酶水解物的•OH清除率的IC₅₀=0.66 mg/mL，BHT的•OH清除率的IC₅₀=0.78 mg/mL。

实施例2

一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，具体步骤为

1、原料预处理：剔除草鱼鱼鳞表面中的杂质，用自来水冲洗干净，40℃烘干备用。采用0.3 mol/L盐酸对鱼鳞进行脱钙，鱼鳞与盐酸的料液比为1:20（g:mL），脱钙时间为1 h。脱钙之后用自来水冲洗3-5次，烘干。

4、二步酶解：将上述冻干的酶解物溶解在水中配制成酶解物配比为50 mg/mL的溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的添加量为1%、pH 7.8(用0.1 mol/L的NaOH水溶液调节至指定pH)、温度为50℃，酶解时间50 min。酶解结束后煮沸灭酶酶10 min，离心取上清液，冷冻干燥，即获得所述鱼鳞明胶高抗氧化性肽。

测定鱼鳞明胶高抗氧化性肽的·OH清除能力，测定方法同实例一所述。实验结果显示，碱性-胰蛋白酶水解物的•OH清除率的IC₅₀=0.65 mg/mL，BHT的•OH清除率的IC₅₀=0.78mg/mL。

实施例3

一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，具体步骤为

1、原料预处理：剔除草鱼鱼鳞表面中的杂质，用自来水冲洗干净，40℃烘干备用。采用0.7 mol/L盐酸对鱼鳞进行脱钙，鱼鳞与盐酸的料液比为1:30（g:mL），脱钙时间为3h。脱钙之后用自来水冲洗3-5次，烘干。

4、二步酶解：将上述冻干的酶解物溶解在水中配制成酶解物配比为50 mg/mL的溶液，加入胰蛋白酶进行酶解，胰蛋白酶的添加量为2%、pH 7.8(用0.1 mol/L的NaOH水溶液调节至指定pH)、温度为60℃，酶解时间60 min。酶解结束后煮沸灭酶酶10 min，离心取上清液，冷冻干燥，即获得所述鱼鳞明胶高抗氧化性肽。

测定鱼鳞明胶高抗氧化性肽的·OH清除能力，测定方法同实例一所述。实验结果显示，碱性-胰蛋白酶水解物的•OH清除率的IC₅₀=0.68 mg/mL，BHT的•OH清除率的IC₅₀=0.78mg/mL。

实施例4

一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，按照实施例3所述的方法进行原料预处理、草鱼鱼鳞明胶的制备和一步酶解步骤。通过改变二步酶解的参数值，对胰蛋白酶第二步酶解的条件进行优化。优化试验设计为：

对温度、时间和pH三个因素进行响应面试验优化，试验设计方案及结果见表1。

表1试验设计方案与结果

回归方程的建立及方差分析

表2小分子量肽的含量为响应值的回归模型方差分析

注：表中*为显著(P＜0.05)，**为极显著(P＜0.01)

由表2的方差分析可知，因素C对碱性-胰蛋白酶水解物中小分子量肽的含量影响显著(p＜0.01)，因素A和B影响不显著(p＞0.05)，交互相AB、AC和BC影响不显著(p＞0.05)；由F值可知，三个因素对二步酶水解物中组分IV的含量的影响依次是：时间＞温度＞pH。

以小分子量肽的含量为响应值建立的模型P值为0.0020达到极显著水平(p＜0.01)；失拟项F值为0.019，P值为0.8932，不显著(p＞0.05)。表明两模型均拟合良好。

以pH、温度、时间为变量，碱性-胰蛋白酶水解物中小分子量肽的含量为响应值，通过Design-Expert 8.0.5进行回归分析，得到回归方程式 (1)， Y₁代表小分子量肽的含量。

Y₁=-11.338+11.826A+0.560B+0.142C-0.021AB-3.45×10^-3AC-2.888×10^-4BC-0.671A²-3.633×10^-3B²-9.238×10^-4C² (1)

根据响应面优化的条件，得到胰蛋白酶二步酶解的最佳条件是底物浓度100mg/mL 、pH7.75、温度53.19℃、时间50min，小分子量肽的含量是53.4088%。

以上对本发明所提供的技术方案进行了详细介绍，对于本领域的一般技术人员，依据本发明实施例的思想，在具体实施方式及应用范围上均会有改变之处，综上所述，本说明书内容不应理解为对本发明的限制。

Claims

1.一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，以鱼鳞为原料，对鱼鳞进行脱钙，再采用碱性蛋白酶和胰蛋白酶对鱼鳞进行二步酶解，获得鱼鳞明胶高抗氧化性肽。

2.根据权利要求1所述的一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体步骤为：

1)、原料预处理：剔除鱼鳞表面的杂质，冲洗干净，烘干，再采用酸液对鱼鳞进行脱钙处理，脱钙后的鱼鳞冲洗干净并烘干；

2)、草鱼鱼鳞明胶的制备：将上述烘干后的鱼鳞加入水中，加热提取，提取后抽滤获得提取液，提取液冷冻干燥，获得冻干的鱼磷明胶；

3)、一步酶解：将所述冻干的鱼磷明胶溶解在蒸馏水中得到鱼鳞明胶溶液，采用碱性蛋白酶对所述鱼鳞明胶溶液进行一步酶解处理，酶解结束后灭酶，酶解液离心分离，取上清液进行冷冻干燥，获得冻干的酶解物；

4)、二步酶解：将所述冻干的酶解物配制成酶解物溶液，用胰蛋白酶进行二步酶解，酶解结束后灭酶，离心取上清液，即获得所述鱼鳞明胶高抗氧化性肽。

3.根据权利要求2所述的一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，所述步骤1中，酸液为浓度0.3～0.7 mol/L的盐酸，鱼鳞与盐酸的料液比为1:10～30 g:mL，脱钙时间为1～3 h。

4.根据权利要求2所述的一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，所述步骤2中，所述加热提取的参数为：料液比为1:15～20 g:mL，pH 5.0～6.0，在80℃的条件下水浴加热提取2 h以上，pH通过向水中滴加稀盐酸进行调节。

5.根据权利要求2所述的一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，所述步骤3中，所述鱼鳞明胶溶液中鱼磷明胶质量分数为10%，所述碱性蛋白酶添加量为鱼鳞明胶溶液中鱼鳞明胶质量的1%，一步酶解条件为pH 8.0、酶解温度50℃、酶解时间4 h，通过0.1mol/L NaOH溶液将pH调节到8.0。

6.根据权利要求2所述的一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，所述步骤4中，所述酶解物溶液中冻干的酶解物配比为50～100 mg/mL，胰蛋白酶的添加质量与酶解物溶液的质量比为0.5%～2%、二步酶解调条件为pH 7～9、温度为40～60℃，酶解时间40～60 min，通过0.1 mol/L NaOH调节溶液pH。

7.根据权利要求6所述的一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，所述二步酶解参数为：酶解物溶液中冻干的酶解物配比为100mg/mL 、pH 7.75、温度53.19℃、时间50min。

8.根据权利要求1～7任一项所述的一种鱼鳞明胶高抗氧化性肽的制备方法，其特征在于，所述鱼鳞为草鱼鱼鳞。