CN112457393A - 一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法 - Google Patents

一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及生物酶解提取技术领域，尤其涉及一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：S1.原料处理：将鲈鱼的鱼皮剪去并将与鱼皮粘连的鱼肉也一同刮擦除去后洗净、剪碎，冷冻干燥后备用；S2.浸泡：将步骤S1处理后的鱼皮浸泡在质量浓度为5％～10％的氯化纳或碳酸钠溶液中，搅拌过滤后蒸馏水水洗，重复若干次；S3.酶解：将步骤S2得到的鱼皮加入蒸馏水，用碱性蛋白酶水解提取胶原蛋白肽，酶解温度为45℃～65℃，酶解时间为4h～5h，通过碱性蛋白酶酶解鲈鱼鱼皮制备胶原蛋白肽，通过控制酶解过程中的温度、时间、pH、加酶量和料液比5个因素对肽得率的影响，获得了制备鲈鱼皮胶原蛋白肽的最佳工艺条件，有效的提高了胶原蛋白肽的得率。

Description

一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法
技术领域
本发明涉及生物酶解提取技术领域，尤其涉及一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法。
背景技术
胶原蛋白是一种生物性高分子物质，具有多种生物功能是动物结缔组织中扮演结合组织的角色。胶原蛋白是生物科技产业最具关键性的原材料之一，也是需求量十分庞大的最佳医用、保湿、修复、延缓衰老、营养等材料。是维持皮肤与组织器官形态、结构的主要成分，也是修复各损伤组织的重要原料物质。
过去获取天然胶原蛋白及其胶原肽的主要途径来源于畜禽动物皮组织，但由于相关畜类疾病和某些宗教信仰，也存在感染疯牛病和其它相关疾病的可能而限制了人们对陆生哺乳动物胶原蛋白及其制品的使用。现今正在逐步转向鱼类皮、鳞等胶原蛋白肽的方法，鱼胶原蛋白在一些方面明显优于陆生动物的胶原蛋白，比如具有低抗原性、低过敏性等特性，可能逐步替代陆生动物胶原蛋白。
世界上鲈鱼广泛运用于加工成各种水产制品，但是鱼皮处于加工后废弃物或低端水产制品处理，易造成资源浪费与环境污染，但鲈鱼的胶原蛋白含量并不低，所以如何实现鲈鱼中提取活性蛋白肽是一个有待解决的问题。
发明内容
本发明要解决的技术问题克服现有的缺陷，提供一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法。
为了解决上述技术问题，本发明提供了如下的技术方案：一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，包括以下步骤：
S1.原料处理：将鲈鱼的鱼皮剪去并将与鱼皮粘连的鱼肉也一同刮擦除去后洗净、剪碎，冷冻干燥后备用；
S2.浸泡：将步骤S1处理后的鱼皮浸泡在质量浓度为5％～10％的氯化纳或碳酸钠溶液中，搅拌过滤后蒸馏水水洗，重复若干次；
S3.酶解：将步骤S2得到的鱼皮加入蒸馏水，用碱性蛋白酶水解提取胶原蛋白肽，酶解温度为45℃～65℃，酶解时间为4h～5h，加酶量为6000U/g～ 10000U/g，料液比为1：(10～30)，通过添加调节液控制PH为8～11；
S4.灭酶：酶解结束后沸水浴加热，使酶失活；
S5.离心：离心得上清液即为胶原蛋白肽液；
S6.干燥：得鱼鳞胶原蛋白肽粉；
S7.煅烧：将步骤S5沉淀所得的残渣干燥、粉碎后置于马弗炉中在600～ 900℃煅烧0.5～1h，得到羟基磷灰石。
作为优选，在S5.离心和S6.干燥之间还设有S8.超滤：将离心得到的上清液进行超滤分离，通过分子量≤10kDa的超滤膜，分离得到胶原蛋白肽液。
作为优选，所述步骤S3中酶解温度为60℃，酶解时间为3h，加酶量为 4800U/g，料液比为0.8：10，控制PH为8-9。
作为优选，步骤S3中PH调节液为0.01mol/LHCL或0.01mol/LNaOH溶液。
作为优选，步骤S5中离心时间10min，离心过程的转速为8000rpm。
作为优选，所述鲈鱼为河鲈、大口黑鲈和华鲈。
作为优选，所述碱性蛋白酶具体为以下至少一种的蛋白酶：真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。
本发明有益效果：本发明提取工艺简单，通过对提取工艺条件的优化，鲈鱼皮胶原蛋白肽的得率高。通过碱性蛋白酶酶解鲈鱼鱼皮制备胶原蛋白肽，通过控制酶解过程中的温度、时间、pH、加酶量和料液比5个因素对肽得率的影响，获得了制备鲈鱼皮胶原蛋白肽的最佳工艺条件，有效的提高了胶原蛋白肽的得率。
附图说明
图1是酶解温度对肽得率的影响；
图2是酶解时间对肽得率的影响；
图3是酶解pH对肽得率的影响；
图4是加酶量对肽得率的影响；
图5是料液比对肽得率的影响；
图6是不同分子量胶原蛋白多肽对O2-的清除作用比较；
图7是不同分子量胶原蛋白多肽对羟自由基(·OH)的清除作用比较；
图8是不同分子量胶原蛋白多肽对二苯代苦味酰基自由基(DPPH·)的清除作用比较。
具体实施方式
以下对本发明的优选实施例进行说明，应当理解，此处所描述的优选实施例仅用于说明和解释本发明，并不用于限定本发明。
S1.原料处理：将鲈鱼皮剪去并将与鱼皮粘连的鱼肉也一同刮擦除去后洗净、剪碎，冷冻干燥后备用。
S2.浸泡：将步骤S1处理后的鱼皮浸泡在质量浓度为5％～10％的氯化纳或碳酸钠溶液中，连接搅拌6h，过滤后蒸馏水水洗，重复3次。通过该步骤，可去除鱼皮中的非胶原蛋白。
S3.酶解：将步骤S2得到的鱼皮加入蒸馏水，用碱性蛋白酶水解提取胶原蛋白肽，酶解温度为45℃～65℃，酶解时间为4h～5h，加酶量为6000U/g～10000U/g，料液比为1：(10～30)，通过添加调节液控制PH为8～11。PH调节液为0.01mol/LHCL或0.01mol/LNaOH溶液。
S4.灭酶：酶解结束后沸水浴加热10min，使酶失活。
S5.离心：离心10min，转速8000rpm，制得上清液即为粗提取的胶原蛋白肽液。
S6.超滤：将离心得到的上清涂进行超滤分离，通过分子量≤10kDa的超滤膜，分离得到胶原蛋白肽液。
S7.将步骤S6得到的胶原蛋白肽液冻干得到胶原蛋白肽粉末。
通过上述方法制备得到胶原蛋白肽液及胶原蛋白肽粉末。通过单因素及正交实验考察酶解温度、酶解时间、酶解pH、酶活、液料比对肽得率的影响。
一、单因素试验
1、酶解温度鲈鱼皮胶原蛋白肽制备的影响
固定液料比1:10，调节pH值为9.0(调节液为0.01mol/LHCl或 0.01mol/LNaOH溶液)，酶活4000U/g，酶解时间4h，分别在45℃、50℃、55℃、 60℃和65℃的温度条件下水解4h提取胶原蛋白肽。测定不同温度条件下的胶原蛋白肽得率，结果如图1所示。
从图1中可知，酶解温度对酶促反应速度具有两重影响，在同一时间条件下，伴随温度的升高，肽得率呈现先增加后下降的波动趋势，在45～50℃的温度范围内，反应温度的升高促使酶促反应速度加快，能高效酶解鲈鱼的鱼皮，在50℃时酶解程度达到最高。反应温度的升高也会导致酶的变性反应加剧，酶活下降使得酶解反应的水解度不断下降，因此当温度高于50℃时水解度开始下降，胶原蛋白肽得率降低。终上，最佳酶解温度为50℃。
2、酶解时间对鲈鱼皮胶原蛋白肽制备的影响
固定液料比1:10，调节酶解液pH值为9.0(调节液为0.01mol/LHCl或 0.01mol/LNaOH溶液)，酶活4000U/g，酶解温度50℃，分别在1h、2h、3h、 4h、和5h的时间条件下酶解，测定不同温度条件下的胶原蛋白肽得率，结果如图2所示。
从图2可知，酶解时间对胶原蛋白肽水解效果有直观的影响。随着酶解时间的延长，胶原蛋白肽得率呈上升趋势，水解4h后水解度上升趋势缓慢，这可能是由于胶原蛋白肽进一步水解为氨基酸。因此，在不会对肽分子量大小影响的前提下，为了获得较多胶原蛋白肽，初步确定酶解时间为4h。
3、酶解pH对鲈鱼皮胶原蛋白肽制备的影响
固定液料比1:10，酶活4000U/g，酶解温度50℃，酶解时间4h，调节pH 值(调节液为0.01mol/LHCl或0.01mol/LNaOH溶液)分别为7.0、8.0、9.0、10.0 和11.0的pH条件下酶解。测定不同pH条件下的胶原蛋白肽得率，结果如图 3所示。
从图3可知，伴随pH的升高，肽得率呈现先增加后下降的波动趋势，在 pH7.0～pH9.0的pH范围内，反应pH的升高促使酶促反应速度加快，能高效酶解鲈鱼皮，在pH8.0～pH9.0范围内肽得率上升趋势愈渐缓慢，当pH＞9.0 时酶活下降使得酶解反应的水解度反而不断下降，胶原蛋白肽得率减少。所以当pH为9.0时胶原蛋白肽得率最高。故酶解液酸碱度条件确定为pH＝9.0。
4、加酶量对鲈鱼皮胶原蛋白肽制备的影响
固定液料比1:10，酶解温度50℃，酶解时间4h，酶解pH9.0，选择酶活分别在4000U/g、6000U/g、8000U/g、10000U/g、和12000U/g下酶解。测定不同温度条件下的胶原蛋白肽得率，结果如图4。
从图4可知，胶原蛋白肽得率呈现一种先上升后下降最后趋于平稳的趋势。随着碱性蛋白酶的酶活酶增加，在酶活较小，底物浓度高的环境时，酶解反应与酶活成正比，酶活增加，肽得率也越高；当酶活升高与反应底物浓度达到合适比例时，肽得率达到最大值；酶活过大，将使酶的活力收到抑制，且相对于底物浓度酶的浓度过高，底物浓度逐渐降低，酶解速率受到反应底物浓度的影响。故采用加酶量为8000U/g进行酶解。
5、酶解料液比对鲈鱼皮胶原蛋白肽制备的影响
酶解温度50℃，酶解时间4h，酶解pH9.0，酶活8000U/g、料液比分别为1:10、1:20、1:30、1:40、1:50条件下酶解。测定不同温度条件下的胶原蛋白肽得率，结果如图5。
底物料液比对酶解反应有着直接的影响，由图可见，随着料液比的增大，肽得率呈现一直减小的趋势。产生这种现象的原因是，随着料液比的增加，反应底物浓度逐渐减小，得到的反应产物的浓度也呈现变小的趋势，从而对酶解反应速率产生了抑制作用。当料液比为1:10时肽得率最高。故选择料液比为1:10为固定条件。
二、正交实验优化分析
根据以上的单因素实验结果分析，以肽得率为指标，设计涵盖酶解温度、酶解时间、酶解pH、加酶量、底物固液的五因素五水平正交实验L9(34)见表 1，试验方案及结果见表2。
表1正交因素水平
Figure BDA0002812277560000081
表2正交实验分析表
Figure BDA0002812277560000091
以肽得率为参考指标，由表2得到A＞B＞D＞C，即在该实验中对肽得率的影响排列因素从大到小为温度＞加酶量＞酶解pH＞时间。由表3：方差分析表可得出温度、加酶量、酶解pH三因素均达到显著水平，时间对肽得率没有太大影响，从节约时间成本上来看，选择酶解时间为4h，因此通过极差分析得出的鲈鱼皮胶原蛋白肽的最佳提取工艺为A2B3D2C2。
表3方差分析表
方差来源 平方和 自由度 均方 F值 显著水平
温度A 7.54 2 3.77 377 **
酶活B 2.26 2 1.33 133 **
时间C 0.02 2 0.01 1
pH D 1.22 2 0.61 61 **
总变异 8
方差来源平方和自由度均方F值显著水平温度A7.5423.77377**酶活B2.2621.33133**时间CO.0220.011pHD1.2220.6161**总变异8
经由上述正交实验即可确定双斑鲈鱼皮胶原蛋白肽的最佳提取条件。即得到提取鲈鱼皮胶原蛋白肽的最佳条件为：料液比1：10、酶解温度50℃、酶活8000U/g、酶解pH为9.0、酶解时间为4h。在此条件下，采用上述工艺条件进行实验验证，三次平行实验测得的提取率双斑东方鲀鱼皮胶原蛋白肽的提取率为47.93％、47.65％、47.82％，即47.80％±0.12％。
三、鲈鱼皮胶原蛋白肽功效实验
1.将本发明制得粗提取的胶原蛋白肽液依次通过截留分子量为10kDa、 5kDa、1kDa的超滤膜，分离得到四种不同分子量的鲈鱼胶原蛋白肽组分 SBCP1(Mw＜10000Da)、SBCP2(1000Da＜Mw＜5000Da)、SBCP3(5000Da＜Mw ＜10000Da)和SBCP4(Mw＞10000Da)。经冻干得到四种鲈鱼胶原蛋白肽粉末。将四种不同分子量的肽粉分别按1mg/mL、2mg/mL、3mg/mL、4mg/mL、5mg/mL 浓度配制成溶液进行鲈鱼皮胶原蛋白肽进行抗氧化肽活性实验，考察不同分子量肽粉在不同浓度下对超氧阴离子(O2-)、羟自由基(·OH)、二苯代苦味酰基自(DPPH·)等的清除作用，结果如图6、图7、图8所示。相较于其它来源的蛋白肽，不同分子量范围的双斑东方鲀鱼皮胶原蛋白肽均具有更好的自由基清除效果，且分子量越小，清除率越高，最佳清除率分别为72.85％、90.22％、 82.1％，IC50分别为1.659mg/mL、5.582mg/mL、1.801mg/mL。
2.建立紫外线UVB(50mJ/cm2)对L929细胞氧化损伤和凋亡的模型，研究双斑东方鲀鱼皮胶原蛋白肽对UVB损伤L929细胞的保护作用。实验过程如下：
(1)小鼠成纤维细胞复苏
对L929细胞株复苏、体外培养。配置10％FBS、1％P/SRPMI培养基。取出L929细胞株，于37℃水浴融化细胞，待细胞完全融化后，移液至15mL离心管。加入9mL10％FBS、1％P/S培养基，1500r/min下离心3min，弃上清液，取2mL10％FBS、1％P/S培养基重悬细胞沉淀，充分吹打沉淀细胞使其充分混匀，移液培养瓶，加入10mL10％FBS、1％P/S培养基，十字摇晃接种瓶混匀培养基。于培养箱常规培养定期观察。
(2)细胞传代
定期观察接种瓶中细胞生产状态，当细胞融合约90％左右时，即可传代。弃去接种瓶中培养基，吸取2mLPBS对细胞进行润洗，弃去PBS，重复2遍，吸取2mL0.25％EDTA于接种瓶内，倒置接种瓶于细胞培养箱加热2min，再正置接种瓶消化细胞2min。取出细胞在倒置显微镜下观察细胞消化状态，待大部分细胞变圆后用手轻拍培养瓶，使细胞脱落，加入2mL10％FBS、1％P/S培养基重悬终止消化，1500r/min下离心3min，弃上清液。取6mL10％FBS、1％ P/S培养基重悬细胞沉淀，制成细胞悬液，按比例1:3转至培养瓶中，补足10％ FBS、1％P/S培养基，于培养箱常规培养定期观察。
(3)细胞种板
细胞种板前处理同细胞传代。取10μL细胞悬液于血球计数板上，放置于显微镜下计数。计算出的细胞浓度，将细胞悬液配置成所需种板浓度，100μL/ 孔接种96孔板；300μL/孔接种48孔板。于超净工作台静置30min后培养箱常规培养定期观察。
(4)台盼蓝染色
将细胞接种于96孔板，待细胞90％融合后进行染色处理，每孔加入 10μL0.4％台盼蓝染色，待其混合均匀，置于倒置显微镜下拍照记录。
(5)MTS、RTCA法检测细胞增殖
MTS法：将细胞接种于96孔板，待细胞90％融合后进行实验处理，在关闭照明的超净工作台上弃上清液，以每孔120μL加入MTS溶液，放置细胞培育箱2h后，于波长492nm的酶标仪上测定吸光值记录数据结果。
RTCA法：1、向E-Plate检测板中加入培养基并测定背景阻抗值。2、收集对数时期细胞并计数，配制1×105cfu/mL细胞浓度悬液，以每孔100μL加入E-Plate检测板中，室温放置超净工作台30min。3、将加入细胞的E-Plate检测板放入检测台，进行实时动态细胞增殖检测。4、向各培养孔中加入配制好的梯度浓度胶原蛋白肽溶液并继续进行实时动态监测，即可得到化合物介导的细胞效应曲线。本实验以3％FBS、1％P/S培养基做空白对照。
(6)不同血清浓度对L929细胞饥饿培养影响
按(3)过程配制成浓度为5×104cfu/mL、1×105cfu/mL的细胞悬液接种于96 孔板。待细胞贴壁生长24h，弃上清液，以每孔100μL加入FBS浓度分别为0％、 1％、3％、5％、10％的培养基后再分别放置培养箱以12h、24h、48h和72h 进行细胞饥饿。通过台盼蓝染色法和MTS法筛选出细胞饥饿的最佳条件。
(7)不同UVB辐照剂量对L929细胞生长影响
按(3)过程配制成浓度为1×104cfu/mL的细胞悬液接种于48孔板。待细胞贴壁生长24h，进行饥饿培养，饥饿培养后弃上清液，以每孔100μL加入PBS 后分别以0mJ/cm2、12.5mJ/cm2、25mJ/cm2、50mJ/cm2、100mJ/cm2、200mJ/cm2、 400mJ/cm2的辐照剂量进行UVB辐照。辐照后弃上清液，以每孔100μL加入 3％FBS、1％P/S培养基于培养箱24h。MTS实验记录数据结果，选取最佳辐照剂量为50mJ/cm2。
制备不同浓度的胶原蛋白肽溶液及细胞饥饿，饥饿后弃上清液，以每孔 100μL加入胶原蛋白肽溶液，以3％FBS、1％P/S的RPMI培养基做空白对照孔，于培养箱贴壁生长12h，取出96孔板，弃上清液，设置对照组和辐照组(UVB)，以每孔30μL加入PBS于最佳辐照剂量下进行UVB辐照,辐照后弃上清液每孔吸取100μL胶原蛋白肽溶液，于培养箱12h后做MTS实验记录数据结果。
细胞MTS结果中，UVB辐照使L929细胞活性下降了31.89％。与辐照组相比，辐照前添加&lt；1kD的鲈鱼皮胶原蛋白，L929细胞的损伤程度明显减轻，且当浓度为40mg/mL时的细胞活力上升了60.09％，证明鲈鱼皮胶原蛋白具有预防L929细胞光损伤能力。
通过以上实验可知，鲈鱼皮胶原蛋白肽粉具有良好的抗氧化性，可用于化妆品及洗发护发产品上。同时由于其还具有UVB辐射后防止L929细胞氧化损伤的功效性，因此可用于抗辐射的化妆品产品上。
以上为本发明较佳的实施方式，本发明所属领域的技术人员还能够对上述实施方式进行变更和修改，因此，本发明并不局限于上述的具体实施方式，凡是本领域技术人员在本发明的基础上所作的任何显而易见的改进、替换或变型均属于本发明的保护范围。

Claims (7)

1.一种从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，其特征在于：包括以下步骤：
S1.原料处理：将鲈鱼的鱼皮剪去并将与鱼皮粘连的鱼肉也一同刮擦除去后洗净、剪碎，冷冻干燥后备用；
S2.浸泡：将步骤S1处理后的鱼皮浸泡在质量浓度为5％～10％的氯化纳或碳酸钠溶液中，搅拌过滤后蒸馏水水洗，重复若干次；
S3.酶解：将步骤S2得到的鱼皮加入蒸馏水，用碱性蛋白酶水解提取胶原蛋白肽，酶解温度为45℃～65℃，酶解时间为4h～5h，加酶量为6000U/g～10000U/g，料液比为1：(10～30)，通过添加调节液控制PH为8～11；
S4.灭酶：酶解结束后沸水浴加热，使酶失活；
S5.离心：离心得上清液即为胶原蛋白肽液；
S6.干燥：得鱼鳞胶原蛋白肽粉；
S7.煅烧：将步骤S5沉淀所得的残渣干燥、粉碎后置于马弗炉中在600～900℃煅烧0.5～1h，得到羟基磷灰石。
2.根据权利要求1所述的从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，其特征在于：在S5.离心和S6.干燥之间还设有S8.超滤：将离心得到的上清液进行超滤分离，通过分子量≤10kDa的超滤膜，分离得到胶原蛋白肽液。
3.根据权利要求1所述的从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述步骤S3中酶解温度为60℃，酶解时间为3h，加酶量为4800U/g，料液比为0.8：10，控制PH为8-9。
4.根据权利要求1所述的从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤S3中PH调节液为0.01mol/LHCL或0.01mol/LNaOH溶液。
5.根据权利要求1所述的从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，其特征在于：步骤S5中离心时间10min，离心过程的转速为8000rpm。
6.根据权利要求1所述的从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述鲈鱼为河鲈、大口黑鲈和华鲈。
7.根据权利要求1所述的从鲈鱼中提取活性蛋白肽的制备方法，其特征在于：所述碱性蛋白酶具体为以下至少一种的蛋白酶：真菌蛋白酶、细菌蛋白酶、碱性蛋白酶、胰蛋白酶、组织蛋白酶、木瓜蛋白酶、菠萝蛋白酶。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN112807417A (zh) * 2021-04-08 2021-05-18 北京瀚梅生物科技有限公司 含有胶原蛋白的美白和抗皱的药物或者化妆品
CN113082192A (zh) * 2021-04-29 2021-07-09 北京瀚梅生物科技有限公司 胶原蛋白与脂肪干细胞的组合物在制备药物或者化妆品中的用途
CN117562979A (zh) * 2023-11-20 2024-02-20 山东大学齐鲁医院 一种用于治疗子痫前期综合症的生物制剂

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