WO1998056926A1 - Systeme pour exprimer une proteine hyperthermostable - Google Patents

Description

明 細 書 超耐熱性プ口テアーゼ発現系 技術分野

本発明は、 工業用酵素として有用な超耐熱 プロテアーゼ、 それをコードする 遺伝子および該酵素の遺伝子工学的製造方法に関する。 背景技術

プロテアーゼは蛋白質中のペプチド結合を切断する酵素であり、 動物、 植物、 微生物より数多くの酵素が見い出されている。 その用途は研究用試薬、 医薬の他、 洗剤への添加、 食品の加工、 逆反応を利用した化学合成といった工業的分野にも 及び、 産業上極めて重要な酵素といえる。 工業的分野で使用されるプロテアーゼ には物理的、 化学的に高い安定性を要求されることから、 特に耐熱性の酵素が好 んで使用されている。 バチルス （Bacillus) 属細菌の生産するプロテア一ゼは割 合に高い耐熱性を示すことから、 現在、 産業的に使用されているプロテアーゼの 主流を占めている。 しかし、 さらに優れた酵素が望まれており、 高温で生育する 微生物、 例えば、 好熱性バチルス属細菌や超好熱菌より酵素を取得しょうとする 試みもなされている。

例えば、 超好熱菌のひとつであるピロコッカス 'フリォサス （Pyrococcus furiosus) がプロテアーゼを生産することが知られている [アプライド *アン ド 'ェンノくィロンメンタノレ'マイクロノくィォロジー (Appl. Environ.

Microbiol. ) 第 56巻、 第 1992〜 1998頁 （1990) 、 エフ 'ィー 'ェ ム ·エス ·マイクロバイオロジカノレ · レターズ （FEMS Microbiol. Letters) 第 71卷、 第 17〜 20頁 （1990) 、 ジャーナル ·ォブ ·ジェネラル ·マイク 口バイオロジー （J. Gen. Microbiol.) 第 137卷、 第 1 193〜 1 199頁 (1991) ] 。

また、 ピロコッカス属に属する超好熱菌、 KOD 1株 （Pyrococcus sp. strain K0D1) はチオールプロテアーゼ （システィンプロテアーゼ） を生産する ことが報告されている [アプライド 'アンド 'エンバイロンメンタル ·マイクロ ノくィォロジ一 （Appl. Environ. Microbiol. ) 第 6 0卷、 第 4 5 5 9〜4 5 6 6 頁 （1 9 9 4 ) ] 。 同じく超好熱菌であるサーモコッカス （Thermococcus) 属、 スタフイロサーマス （Staphylothermus) 属、 サーモバクテロイデス

(Thermobacteroides) 属の細菌にっレ、てもプロテアーゼの生産が知られている [アプライド ·マイクロバイオロジー 'アンド 'バイオテクノロジー （Appl. Microbiol. Biotechnol. ) 第 3 4卷、 第 7 1 5〜 7 1 9頁 （1 9 9 1 ) ] 。

上記のような超好熱菌由来のプロテアーゼは高い熱安定性を有しており、 現在 使用されている耐熱性プロテアーゼに変わって、 あるいは、 これまではプロテア ーゼの使用が考えられていなかった分野において利用されることが期待されてい る。

しかしながら、 これらの酵素を生産する微生物のほとんどは高温条件でのみ生 育するものであり、 例えば、 ピロコッカス 'フリオサスの場合には 9 0〜1 0 0 °Cでの培養が必要である。 このような高温での培養操作はエネルギーコスト的 にも不利である。 また、 これらの超好熱菌のプロテアーゼ生産量はこれまで使用 されてきた微生物プロテアーゼに比べて低い。 このように超好熱菌由来のプロテ ァーゼの工業的な製造方法は問題を有している。

—方、 目的とする酵素遺伝子を単離し、 培養の容易な宿主微生物にこれを導入 して遺伝子工学的な酵素の生産を行うことは現在広く行われている。 しかしなが ら、 宿主に導入された酵素遺伝子は必ずしも意図したような効率で発現されると は限らない。 これは導入される遺伝子の G C含量ゃコドンの使用頻度が宿主の遺 伝子のものと異なることなどが主たる原因と考えられている。 したがって、 その 使用目的にかなう酵素生産量を得るためには、 導入遺伝子、 宿主ごとに発現方法 を至適化することが必要である。 発明の目的

本発明の目的は上記の課題を解決するために、 工業的な使用に有利な超好熱菌 のプロテアーゼを提供すること、 該超好熱菌のプロテアーゼをコードする遺伝子 を単離すること、 およぴ該遺伝子を用いた超耐熱性プロテアーゼの遺伝子工学的 製造方法を提供することにある。 発明の概要

超好熱菌の生産するプロテアーゼの中には、 そのアミノ酸配列の相同性からサ ブチリシン ·タイプと呼ばれるアル力リ性セリンプロテアーゼに属すると考えら れるものがある。 これらの遺伝子を、 例えば、 タンパクの遺伝子工学的生産に汎 用されるバチルス 'サブチリス （Bacillus subtilis) に導入した場合、 該酵素 の生産量はバチルス ·サブチリスが本来生産しているタンパクには及ばない。 本発明者らは鋭意研究の結果、 発現させようとする超好熱菌由来プロテアーゼ 遺伝子の上流にサブチリシン由来のシグナルペプチド （シグナル配列） をコード する遺伝子を配し、 さらにその切断点周辺のアミノ酸配列を改変することにより、 目的遺伝子がバチルス ·サブチリスにおいて高効率で発現されるようになること を見い出した。 また、 目的とする超好熱菌由来プロテアーゼ遺伝子のうち、 酵素 活性の発現には必須でない部分を欠失させることによっても酵素発現量の改善が 見られることを明らかにし、 本発明を完成させるに至った。

本発明を概説すれば、 本発明の第 1の発明は、 配列表の配列番号 1に示される ァミノ酸配列を有する耐熱性プロテアーゼ、 および配列表の配列番号 1に示され るアミノ酸配列において 1もしくは数個のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入もしくは 付加されたアミノ酸配列を有し、 かつ耐熱性プロテアーゼ活性を有するプロテア ーゼである。

また、 本発明の第 2の発明は、 第 1の発明の耐熱性プロテアーゼをコードする 遺伝子、 および該遺伝子にハイブリダイズする耐熱性プロテアーゼ遺伝子である。 本発明の第 3の発明は、 超好熱菌由来の耐熱性プロテア一ゼを遺伝子工学的に 製造するために使用される遺伝子であり、 式 I ：

S I G-A1 a-G l y-G l y-As n-PRO [I] [式中、 S I Gはサブチリシン由来のシグナルぺプチドのアミノ酸配列を、 P R oは発現させようとするタンパクのアミノ酸配列のアミノ酸配列をそれぞれ示 す]

で表されるアミノ酸配列をコードすることを特徴とする。 S I Gは、 好ましくは 配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列であり、 また、 P R Oは好ましくは 超好熱菌由来の耐熱性プロテアーゼ、 特に好ましくはピロコッカス ' フリォサス 由来のプロテアーゼのアミノ酸配列である。

本発明の第 4の発明は、 タンパクの遺伝子工学的な製造方法に関し、 第 3の発 明の遺伝子を導入したバチルス属細菌を培養し、 該培養物から目的のタンパクを 採取する工程を含有することを特徴とする。

本発明の第 5の発明はタンパクを遺伝子工学的に製造するために使用されるプ ラスミ ドであり、 第 3の発明の遺伝子を挿入されていることを特徴とする。

本発明によって開示されるプロテアーゼを含め、 天然に存在するタンパクには それをコ一ドする遺伝子の多形や変異の他、 生成後のタンパクの生体内および精 製中の修飾反応などによってそのアミノ酸配列中に 1または数個のアミノ酸の欠 失、 挿入、 付加、 置換等の変異が起こりうるが、 それにもかかわらず変異を有し ないタンパクと実質的に同等の生理、 生物学的活性を示すものがあることが知ら れている。 人為的にタンパクのアミノ酸配列に上記のような変異を導入した場合 も同様であり、 この場合にはさらに多種多様の変異体を作製することが可能であ る。 例えば、 ヒトインターロイキン 2 ( I L - 2 ) のアミノ酸配列中のあるシス ティン残基をセリンに置換したポリぺプチドがィンターロイキン 2活性を保持す ることが知られている [サイエンス （Science) 、 第 2 2 4卷、 1 4 3 1頁 （1 9 8 4 ) ] 。 このように本発明に開示されたアミノ酸配列中に 1または数個のァ ミノ酸の欠失、 挿入、 付加、 置換等が生じたアミノ酸配列を有し、 かつ本発明の プロテアーゼと同等の活性を有するプロテア一ゼは本発明の範囲内に属するもの である。

本明細書における 「 （ある遺伝子に） ハイブリダィズする遺伝子」 とは、 ある 遺伝子に類似した塩基配列を有する遺伝子である。 ある遺伝子に類似した塩基配 列を有する遺伝子は、 そこにコードされているタンパク質のアミノ酸配列、 さら に該タンパク質が有している機能も類似している可能性が高い。 遺伝子の塩基配 列の類似性は、 両遺伝子あるいはその一部どうしがストリンジェントな条件にお いてハイブリッドを形成する （ハイブリダィズする） かどうかによつて調べるこ とができ、 これを利用してある遺伝子がコードするタンパクと同様の機能を持つ タンパクをコードする遺伝子を取得することができる。 すなわち、 本発明で得ら れた遺伝子、 あるいはその一部をプローブに用いて公知の方法でハイブリダィゼ ーシヨンを行うことにより、 本発明の遺伝子に類似の塩基配列を有する遺伝子を 取得することができる。 ハイブリダィゼーシヨンは、 例えば、 1989年、 コー ノレド ·スプリング 'ハ一バー 'ラボラトリー発行、 T. マニアテイス （T.

aniatis) ら編集、 モレキュラー クローニング：ァ ラボラトリー マ二ユア ノレ第 2版 (Molecular Cloning ： A Laboratory Manual 2nd ed. j ίこ目：;载された 方法により実施することができる。 さらに具体的には、 例えば、 以下の条件で ハイブリダィゼ一シヨンを行うことができる。 すなわち、 DNAを固定したメン ブレンを 0. 5%SDS、 0. 1%ゥシ血清アルブミン （BSA) 、 0. 1 %ポ リビニルピロリ ドン、 0. 1 %フィコール 400、 0. 01。/。変性サケ精子 DN Aを含む 6 X SSC (1 XS SCは 0. 15M Na C l、 0. 01 5Mクェン 酸ナトリウム、 pH7. 0を示す） 中で、 50°Cにて 12〜20時間、 プロ一ブ とともにインキュベートする。 インキュベーション終了後、 0. 5%SDSを含 む 2 XS SC中、 37°Cでの洗浄から始めて、 53じ濃度は0. I Xまでの範 囲で、 また、 温度は 50°Cまでの範囲で変化させ、 固定された DNA由来のシグ ナルがバックグラウンドと区別できるようになるまでメンブレンを洗浄する。 また、 ハイブリダィゼーシヨンに代えて本発明で得られた遺伝子の塩基配列の —部をプライマーに用いる遺伝子増幅法、 例えば、 PCR法を利用することもで きる。 こうして得られた遺伝子が目的の機能を有するタンパクをコードするもの であるかどうかは、 得られた遺伝子を適当な宿主と発現系とを利用して発現させ、 得られたタンパクの活性を調べることによって知ることができる。 図面の簡単な説明 図 1は、 プラスミ ド p STC 3の制限酵素地図である。

図 2は、 プロテアーゼ PFUS、 プロテア一ゼ TCE Sおよびサブチリシンの アミノ酸配列を比較する図である。

図 3は、 プロテアーゼ PFUS、 プロテアーゼ TCE Sおよびサブチリシンの ァミノ酸配列を比較する図である。

図 4は、 プロテアーゼ PFUS、 プロテアーゼ TCE Sおよびサブチリシンの アミノ酸配列を比較する図である。

図 5は、 プロテアーゼ PFUS、 プロテアーゼ TCE Sおよびサブチリシンの アミノ酸配列を比較する図である。

図 6は、 プラスミ ド p S N P 1の制限酵素地図である。

図 7は、 プラスミ ド p P S 1の制限酵素地図である。

図 8は、 プラスミ ド p NAP S 1の制限酵素地図である。 発明の詳細な説明

本発明に係る超耐熱性プ口テアーゼとしては、 種々の超好熱菌由来のプロテア ーゼがあげられる。 例えば、 WO 95/34645号公報にはピロコッカス · フ リオサスおよびサーモコッカス ·セラー由来のプロテアーゼについて記載されて いる。

ピロコッカス 'フリオサス DSM3638由来のプロテアーゼ遺伝子は該菌株 のゲノム DN Aライブラリーより、 耐熱性のプロテアーゼ活性を指標として単離 された。 該遺伝子を含有するプラスミ ドはプラスミ ド pTPR 12と命名され、 また、 該プラスミ ドで形質転換されたェシェリヒア• y jM109は

Escherichia coli J Ml 09/p TP R 12と命名、 表示され、 平成 6年 5月 24日 （原寄託日） よりブダペスト条約の下、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1 番 3号の、 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP — 5103として寄託されている。

以降、 本明細書においてはこのプロテアーゼを、 プロテア一ゼ PFULと呼ぶ。 プロテアーゼ PFULは高い熱安定性を有するプロテア一ゼであり、 95°Cにお いてもプロテアーゼ活性を示す。

上記のプラスミド pTPR 12に挿入されたピロコッカス ·フリオサス由来の DN A断片の塩基配列はすでに決定されている。 プラスミ ド pT PR 12の挿入 DNA断片のうち、 2つの Dralサイトで挟まれた約 4. 8kb部分の塩基配列を 配列表の配列番号 5に示す。 また、 該塩基配列より推定される遺伝子産物のアミ ノ酸配列を配列表の配列番号 6に示す。 すなわち、 配列表の配列番号 6に示され るァミノ酸配列は上記のプロテアーゼ P F U Lのァミノ酸配列である。 該配列に 示されるように該プロテアーゼ PFULは 1398アミノ酸残基からなり、 分子 量 15万をこえる高分子量のプロテア一ゼである。

配列表の配列番号 6に示される上記のプロテアーゼ PFULのァミノ酸配列を 既知の微生物由来プロテアーゼのアミノ酸配列と比較することにより、 プロテア ーゼ P FULの前半部分のアミノ酸配列とサブチリシンに代表される一群のアル カリ性セリンプロテアーゼ [プロテイン ·エンジニアリング （Protein

Engineering) 第 4卷、 第 719〜 737頁 （1991) ] との間に相同性が存 在し、 特にプロテアーゼの触媒活性に重要とされる 4つのアミノ酸残基周辺に極 めて高い相同性が存在していることが判明している。

このように超好熱菌ピロコッカス ·フリオサスの生産するプロテアーゼ PFU Lのアミノ酸配列中に、 常温菌由来のプロテアーゼに共通して存在する領域が保 存されていることが明らかとなったことより、 ピロコッカス · フリオサス以外の 超好熱菌の生産する同種のプロテアーゼにもこの領域が存在していることが期待 できる。

例えば、 プロテアーゼ PFULのァミノ酸配列のうちサブチリシン等と高い相 同性を示す領域をコードするプロテアーゼ P FUL遺伝子の塩基配列をもとに合 成したオリゴヌクレオチド PRO— 1 F、 PRO— 2F、 PRO— 2Rおよび P RO-4 Rを,組み合わせてプライマーに用い、 各種の超好熱菌の染色体 DNAを 铸型とした PC Rを行うことにより超耐熱性プロテアーゼ遺伝子をスクリーニン グすることができる。 配列表の配列番号 7、 8、 9および 10にそれぞれオリゴ ヌクレオチド PRO— 1 F、 PRO— 2F、 P RO— 2 Rおよび P R〇一 4 Rの 塩基配列を示す。

本発明に係るプロテアーゼの由来する超好熱菌としては、 ピロコッカス属、 サ 一モコッカス属、 スタフイロサーマス属、 サーモパクテロイデス属等に属する細 菌が使用でき、 サーモコッカス属に属する細菌としては、 例えば、 サーモコッカ ス 'セラ一 （Thermococcus celer) D SM2476が使用でき、 該菌株はドィッ チェ ·ザムルンク ·フォン · ミクロオルガニスメン . ゥント .ツェルクルチユウ レン GmbHより入手可能な菌株である。 サーモコッカス ·セラー DSM247 6の染色体 DNAを铸型とし、 上記のオリゴヌクレオチド PRO— 1 Fと PRO - 2 Rの組み合わせ、 あるレ、は PRO— 2 Fと PRO— 4 Rの組み合わせをプラ イマ一に用いて P C Rを行った場合には特異的な D N A断片の増幅が認められ、 プロテアーゼ遺伝子の存在を知ることができる。 また、 これらの DNA断片を適 当なプラスミ ドベクターに挿入した組換えプラスミ ドを作製した後、 挿入 DNA 断片の塩基配列をジデォキシ法で調べることにより、 該断片にコードされるアミ ノ酸配列を推定することができる。 この結果、 これらの DN A断片にはプロテア ーゼ P F U L、 および各種微生物由来のアルカリ' セリンプロテア一ゼのァミノ 酸配列と相同性のあるアミノ酸配列がコードされており、 上記の P C R増幅 D N A断片がプロテアーゼ遺伝子を铸型として増幅されたものであることが明らかと なった。

つぎに、 上記のオリゴヌクレオチド、 あるいは上記の PCRにより得られた増 幅 DNA断片をプローブに用いて超好熱菌の遺伝子ライブラリーをスクリーニン グすることにより、 超耐熱性プロテアーゼ遺伝子、 例えば、 サーモコッカス .セ ラ一の生産する超耐熱性プ口テア一ゼの遺伝子を得ることができる。

例えば、 サーモコッカス ·セラー DSM2476の染色体 DN Aを制限酵素 S au3 A Iで部分消化して得られた DNA断片と、 ラムダ GEM— 1 1ベクター

(プロメガネ; h ) とをライゲーシヨンした後、 イン 'ビトロ 'パッケージング法 によってラムダファージ粒子中にパッケ一ジングすることによって得られるライ ブラリーについて、 上記の P C Rにより得られた增幅 D N A断片をプローブに用 いたプラークハイブリダィゼーシヨンを行い、 目的の遺伝子を含むファージク口 ーンを得ることができる。

このようにして得られたファージクローンに含有される D N A断片を解析した 結果、 約 1 . 9 kbの S a c I断片にプロテアーゼ遺伝子が存在することが示され、 さらにその塩基配列を調べることによってこの断片はプロテアーゼ遺伝子の 5 ' 側領域を欠いていることがわかる。 この 5， 側領域はカセット、 およびカセット プライマーを用いる P C Rを利用して取得することができる （宝酒造遺伝子工学 製品ガイド、 1 9 9 4一 1 9 9 5年版、 第 2 5 0〜 2 5 1頁） 。 こうしてプラス ミ ド p T C S 6に欠けていた超耐熱性プロテアーゼ遺伝子の 5 ' 側領域をカバー する D N A断片を得ることができ、 さらにこの両 D N A断片の塩基配列からサー モコッカス ·セラ一由来の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子全長の塩基配列を知るこ とができる。

得られた塩基配列中に存在するオープン · リーディング · フレームの塩基配列 を配列表の配列番号 1 1に、 また、 該塩基配列から推定されるアミノ酸配列を配 列表の配列番号 1 2にそれぞれ示す。 こうして、 それをコードする遺伝子の塩基 配列、 およびそのアミノ酸配列が明らかにされたサーモコッカス ·セラー由来の 超耐熱性プロテアーゼはプロテア一ゼ T C E Sと命名されている。

上記の 2つの D N A断片を組み合わせることによりプロテアーゼ T C E S遺伝 子の全長を再構成した発現プラスミ ドを構築することができるが、 ェシエリヒ ァ♦ コリを宿主とした場合には目的の発現プラスミ ドが導入された形質転換体は 得られなかった。 これは菌体内に該遺伝子の発現産物が生成されることがェシェ リヒア · コリにとつて有害、 または致死的になることが原因であると予想される。 このような場合には、 例えば、 バチルス ·サブチリスを宿主としてプロテアーゼ を細胞外に分泌発現させ、 その活性を確認することが考えられる。

バチルス ·サブチリスとしてはバチルス♦サブチリス D B 1 0 4が使用でき、 該菌株はジーン （Gene) 第 8 3卷、 第 2 1 5〜 2 3 3頁 （1 9 8 9 ) 記載の公知 の菌株である。 クローニングベクタ一としてはプラスミド p U B 1 8— P 4 3が 使用でき、 該プラスミ ドはカルガリ一大学、 スィ—ラム ' ウォン （Sui- Lam Wong) 博士より恵与されたプラスミドである。 また、 該プラスミ ドは選択マーカ —としてカナマイシン耐性遺伝子を含んでいる。

プラスミ ドベクター pUB 18— P43の P43プロモーター下流にプロテア ーゼ TCES遺伝子が挿入された組換えプラスミ ドはプラスミ ド p STC3と命 名され、 該プラスミ ドで形質転換されたバチルス ·サブチリス D B 104は Bacillus subtilis DB l 04/p STC 3と命名、 表示され、 平成 7年 1 2月 1日 （原寄託日） より、 ブタペスト条約の下、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1 番 3号の、 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP — 5635として寄託されている。

図 1に、 プラスミ ド p STC 3の制限酵素地図を示す。 図中、 太実線がプラス ミ ドベクタ一 pUB 1 8 -P 43への挿入 DN A断片である。

上記の Bacillus subtilis DB l 04 Z P S T C 3を培養し、 培養液上清、 お よび菌体抽出物についてプロテアーゼ活性を調べると、 どちらにも耐熱性のプロ テアーゼ活性が認められる。

該形質転換体培養物より得られるプロテア一ゼの粗酵素標品の主な性質は以下 のとおりである。

( 1 ) 作用：

カゼイン、 ゼラチンを分解し、 短鎖ポリペプチドを生成する。

スクシェル一 L一ロイシルー L—ロイシノレ一 L一バリル一 L—チロシン _4一 メチルクマリン一 7—アミ ド （S u e— L e u— L e u— Va 1— Ty r— MC A) を加水分解し蛍光物質 （7—アミノー 4—メチルクマリン） を生成する。 スクシ二ルー L—ァラエル一 L—ァラニル一 L—プロリル一 L—フエ二ルァラ ニン一 p—二トロア二リ ド （Su e— A l a -A 1 a— P r o— Ph e— p_N A) を加水分解し黄色物質 （p—二トロア二リン） を生成する。

( 2 ) 至適温度：

37〜95 °Cで酵素活性を示し、 その至適温度は 70〜80°Cである。

(3) 至適 pH :

pH5. 5〜 9の間で酵素活性を示し、 その至適 pHは pH7〜8である。

(4) 熱安定性： 80°C、 3時間の処理後も 90%以上の酵素活性を保持している。

プロテアーゼ PFUL、 プロテアーゼ TCE Sおよびサブチリシン [サブチ リシン BP N' 、 ヌクレイック 'ァシッズ ' リサーチ （Nucl. Acids Res.) 第 1 1卷、 第 7911〜 7925頁 （1983) ] のアミノ酸配列を、 図 2〜図 5に 示したように相同性のある領域が一致するように並べてみると、 プロテアーゼ P FULにはその C末端側だけではなく、 相同性がある領域の間にも、 プロテア一 ゼ T C E Sおよびサブチリシンには認められない配列が存在することがわかる。 これより、 ピロコッカス 'フリオサスには、 プロテアーゼ P FULのほかに、 そ れよりも分子量が小さいプロテア一ゼ TCESまたはサブチリシンのようなプロ テアーゼが存在する可能性も考えられる。

そこで、 上記の相同性を有する領域に由来する DN Aプローブを使用し、 ピロ コッカス .フリオサスより調製した染色体 DNAをターゲットにしてサザンハイ ブリダイゼーションを行うと、 プロテアーゼ P F U Lの遺伝子以外にもシグナル が認められ、 さらにもう 1種のプロテアーゼ遺伝子の存在が明らかとなった。 この新規のプロテァ一ゼ遺伝子は以下のような操作によって単離することがで さる。

例えば、 ピロコッカス ♦ フリオサスの染色体 D N Aを適当な制限酵素で消化し た後、 これをターゲットとし、 上記のようなサザンハイブリダィゼーシヨンによ つて新規のプロテア一ゼをコ一ドする遺伝子を含む DNA断片を取得する。 該 D N A断片の塩基配列を調べて、 それが上記のプロテア一ゼと相同性を有するアミ ノ酸配列をコードするものかどうかを確認し、 さらに該 DN A断片が目的の遺伝 子の全長を含んでいなかつた場合にはィンバース P C R法等によって足りなレ、部 分を単離する。

例えば、 ピロコッカス ·フリオサスの染色体 DN Aを制限酵素 Sac Iおよび S pel (宝酒造社製） で消化し、 これを用いてサザンハイブリダィゼーシヨンを行 つた場合には約 0. 6 kbのサイズにシグナルが認められる。 このサイズの DN A 断片を回収し、 これをプラスミ ドベクター pBluescriptSK (-) (ストラタジー ンネ： tS¾ の Spel— Saclサイト間に挿入し、 得られる組換えプラスミ ドでェシ エリヒア 'コリ JM109を形質転換する。 この形質転換体より、 上記のサザン ハイブリダイゼーションに使用したものと同じプローブを用いたコ口ニーハイブ リダィゼーシヨンによって目的の断片が組込まれたクローンを取得することがで きる。 得られたクローンの保持するプラスミ ドがプロテアーゼをコードする配列 を有するかどうかはブラスミ ドの揷入 D N A断片の塩基配列を調べることによつ て確認することができる。 こうしてプロテアーゼ遺伝子の存在が確認されたプラ スミ ドはプラスミ ド p S S 3と命名されている。

該プラスミ ド p S S 3に挿入された D N A断片の塩基配列より推定されるアミ ノ酸配列にはサブチリシン、 プロテアーゼ PFUL、 プロテアーゼ TCES等の 配列と相同性があることが示される。 こうしてピロコッカス .フリオサスより新 たにその一部が得られた、 プロテアーゼ P F U L遺伝子とは異なるプロテアーゼ 遺伝子の産物は、 プロテアーゼ PFUSと命名されている。 該プロテアーゼの N 末端側をコ一ドする領域、 および C末端側をコードする領域はィンバース P C R 法によって得ることができる。

インバース PCRに使用するプライマーは、 上記のプラスミ ド p S S 3に含ま れる挿入 DN A断片の塩基配列をもとに作製することができる。 つぎに、 ピロコ ッカス ·フリオサスの染色体 DNAを適当な制限酵素で消化した後、 生じた DN A断片について分子內ライゲ一シヨン反応を行う。 この反応液を铸型とし、 上記 のプライマーを用いた PC Rを行ってプラスミ ド p S S 3に含まれるプロテア一 ゼ遺伝子の断片に隣接した領域の DNA断片を取得することができる。 こうして 得られた DNA断片の塩基配列を解析することによってその領域にコードされて いる酵素タンパクのアミノ酸配列を推定し、 さらにピロコッカス ·フリオサスの 染色体 DN Aを铸型にしてプロテアーゼ PFUS遺伝子の全長を増幅することが 可能なプライマーを作製することができる。 プロテアーゼ PFUSの開始コドン の直前の塩基配列を有し、 その 5' 側に BamH Iサイ トが導入できるプライマー NPF— 4、 およびプロテアーゼ PFUS遺伝子の 3， 側部分に相捕的な配列を 有し、 その 5， 側に Sphlサイトを導入できるプライマー NPR— 4を設定する ことができる。 上記のプライマー N P F— 4および N P R— 4の塩基配列を配列表の配列番号 13および 14に示す。 この 2種のプライマーを用い、 ピロコッカス .フリオサ スの染色体 DN Aを铸型にしてプロテアーゼ PFUS遺伝子の全長を増幅するこ とができる。

プロテア一ゼ TCESの場合と同様にプロテアーゼ PFUSをバチルス .サブ チリスを宿主として発現させることができる。 プロテアーゼ PFUSを発現させ るためのプラスミ ドは、 プロテアーゼ TCE Sの発現プラスミ ド p STC3をも とにして構築できる。 すなわち、 上記のプライマーを用いた PC Rによって増幅 されるプロテアーゼ PFUS遺伝子全長を含む DNA断片をプラスミ ド p STC 3上のプロテアーゼ TCES遺伝子と置換することにより、 プロテアーゼ PFU Sの発現のためのプラスミ ドを構築することができる。 このようにして構築され た発現プラスミ ドはプラスミ ド p SNP 1と命名され、 また、 該プラスミ ドで形 質転換されたバチルス ·サブチリス DB 104は Bacillus subtilis DB 10 4 p SNP lと命名、 表示され、 平成 7年 12月 1日 （原寄託日） より、 ブタ ぺスト条約の下、 日本国茨城県つくば巿東 1丁目 1番 3号の、 通産省工業技術院 生命工学工業技術研究所に受託番号 FERM BP— 5634として寄託されて レ、る。 図 6にプラスミ ド p SNP 1の制限酵素地図を示す。

プロテア一ゼ P FUSをコードする遺伝子のオープン · リーディング .フレー ム部分の塩基配列を配列表の配列番号 15に、 また、 該塩基配列から推定される プロテア一ゼ P F U Sのァミノ酸配列を配列表の配列番号 16に示す

上記の Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1を培養し、 培養液上清、 および菌体抽出物についてプロテアーゼ活性を調べると、 どちらにも耐熱性のプ 口テア一ゼ活性が認められる。 すなわち、 発現されたプロテアーゼ PFUSの一 部は培養液上清中に分泌されている。

該形質転換体培養物より得られるプロテアーゼの主な性質は以下のとおりであ る。

( 1 ) 作用：

カゼイン、 ゼラチンを分解し、 短鎖ポリペプチドを生成する。 スクシニノレ一 L—口イシノレ一 L—ロイシノレー L—バリノレ一 L—チロシン一 4 - メチノレクマリンー 7—アミ ド （S u e— Le u— L e u— Va 1 -T y r -MC A) を加水分解し蛍光物質 （7—アミノー 4—メチルクマリン） を生成する。 スクシ二ルー L—ァラニル一L—ァラニルー L—プロリル一 L—フエ二ルァラ ニン一 p—二トロア二リ ド （Su e— A l a -A 1 a-P r o-Ph e-p-N A) を加水分解し黄色物質 （p—二トロア二リン） を生成する。

(2) 至適温度：

40〜1 10°Cで酵素活性を示し、 その至適温度は 80〜95°Cである。

(3) 至適 pH '- pHS l 0の間で酵素活性を示し、 その至適 pHは pH 6〜8である。

(4) 熱安定性：

95°C、 8時間の処理後も 90%以上の酵素活性を保持している。

(5) p H安定性

pH5〜l l、 95°C、 60分間の処理後も 95%以上の活性を保持している。

(6) 分子量

SDS— PAGE上で約 45kDaの分子量を示す。

プロテアーゼ TCES遺伝子およびプロテアーゼ P F U S遺伝子の場合と同様 の方法により、 これらの遺伝子に相同性を有するプロテアーゼ遺伝子をピロコッ カス ·フリオサス、 サーモコッカス ·セラー以外の超好熱菌より取得することが できる。

配列表の配列番号 6に示されたプロテアーゼ PFULのアミノ酸配列の 323 番目の残基から 650番目の残基までの配列をコードする約 lkbの DNA断片を 調製し、 これをプローブとしてスタフイロサーマス 'マリナス

(Staphylothermus marinus) DSM3639およぴサーモバクテロイデス ·プ ロテオリティカス （Thermobacteroides proteoliticus) DSM5265の染色 体 DN Aを用いたゲノミックサザンハイブリダィゼーシヨンを行うことができる。 その結果、 Pstl (宝酒造社製） で消化したスタフイロサーマス 'マリナス染色 体 DNAを用いた場合には約 4. 8kbの位置に、 また、 Xbalで消化したサーモ バクテロイデス .プロテオリティカス染色体 DNAでは約 3. 5kbの位置にシグ ナルが認められる。

これより、 スタフイロサーマス 'マリナスおよびサ一モバクテロイデス ·プロ テオリティカスの染色体 DNAにもプロテアーゼ PFUL、 プロテアーゼ P FU S、 およびプロテアーゼ T C E S等の遺伝子と相同性のある配列が存在すること が明らかになった。 こうして検出された DNA断片より、 プロテアーゼ TCES、 およびプロテア一ゼ PFUSをコードする遺伝子を単離、 同定したときと同様の 方法を用いることによって、 スタフイロサーマス ·マリナスおよびサーモバクテ ロイデス ·プロテオリティカスに存在する超耐熱性プロテアーゼをコードする遺 伝子を単離、 同定することができる。

一般に、 遺伝子工学的な手法でタンパクを大量に調製しようとする場合には、 目的のタンパクをコードする遺伝子自身が備えているプロモータ一ではなく、 宿 主において効果的に作用するプロモーターを使用することが有利と考えられる。 この点で、 プロテアーゼ TCES、 PFUSの発現系構築において使用された P 43プロモーターはバチルス 'サブチリス由来のプロモーターであるが、 これら 2種のプロテアーゼの発現には十分な効果を示さなかった。

そこで、 さらに発現量を向上させるためにはバチルス ·サブチリスで高発現さ れる遺伝子、 特に分泌タンパクの遺伝子を利用することが考えられる。 このよう な遺伝子としては、 ひ一アミラーゼゃ種々の菌体外プロテアーゼの遺伝子等が使 用でき、 例えば、 サブチリシンのプロモーターとシグナルペプチドを利用してプ 口テアーゼ PFUSの発現量を増加させることが期待される。

すなわち、 プロモーター領域を含むサブチリシン遺伝子のシグナルペプチドを コードする領域の後にプ口テアーゼ PFUS遺伝子全長を両遺伝子の翻訳のフレ ームが一致するように連結することにより、 サブチリシン遺伝子のプロモーター の制御下に融合タンパクとしてプロテアーゼ PFUSを発現させることができる。 本発明に使用されるサブチリシン遺伝子としては、 例えば、 サブチリシン Eを コードする遺伝子が使用できる。 サブチリシン Eのプロモーターとシグナルぺプ チドはジャーナル'ォブ 'バクテリオロジー （J.Bacteriol.) 第 171卷、 第 2 657〜 2665頁 （1989) に記载のプラスミド p KWZに挿入されている サブチリシン遺伝子のものを使用することができる。 該遺伝子の塩基配列は、 プ 口モータ一配列を含む 5' 上流領域については上記の文献に、 また、 サブチリシ ンをコ一ドする領域についてはジャーナル ·ォブ ·バクテリオロジ一

(J. Bacteriol. ) 第 158卷、 第 411〜 418頁 （1984) にそれぞれ記載 されている。

これらの配列をもとに、 該遺伝子のプロモーター配列上流に EcoR Iサイトを 導入するためのプライマー SUB 4と、 サブチリシン Eのシグナルペプチドをコ ―ドする領域の後ろに BamH Iサイトを導入するためのプライマー B mR 1をそ れぞれ合成する。 配列表の配列番号 17および 18にそれぞれブライマー SUB 4、 BmR 1の塩基配列を示す。 プライマー SUB 4、 BmRlを用い、 プラス ミ ド pKWZを铸型とした PCRによってサブチリシン E遺伝子のプロモーター およびシグナルぺプチドをコ一ドする領域を含む約 0. 3kbの DNA断片を増幅 することができる。

該 DN A断片の下流に接続されるプロテアーゼ PF US遺伝子は、 PCR法に よってピロコッカス ·フリオサスの染色体 DN Aより取得することができる。 該 遺伝子の 5' 側にハイブリダィズするプライマーとしては上記のプライマ一 NP F— 4が使用できる。 また、 3' 側にハイブリダィズするプライマーには、 該遺 伝子の終止コドン下流の塩基配列から設計され、 かつ Sphlサイトを有するブラ イマ一 NPM— 1を使用することができる。 配列表の配列番号 19にプライマー NPM- 1の配列を示す。

—方、 BamH Iサイ トを利用してプロテア一ゼ PF US遺伝子を上記の 0. 3 kbDN A断片に接続する場合には、 該遺伝子中に 1箇所存在する BamH Iサイト が操作の支障となる。 この BamH Iサイトを PC R—変異導入 （mutagenesis) 法によって除くためのプライマー mu t RR、 mu t F Rは配列表の配列番号 1 5に示されるプロテアーゼ P F U S遺伝子の塩基配列をもとに作製することがで きる。 プライマー mu t RR、 mu t F Rの塩基配列をそれぞれ配列表の配列番 号 20、 21に示す。 なお、 これらのプライマーを用いて BamH Iサイトを除去 した場合には、 該サイトに導入される塩基置換のためにそこにコードされるアミ ノ酸、 すなわち、 配列表の配列番号 16に示されるプロテアーゼ PFUSのアミ ノ酸配列中、 560番目に存在するグリシンがパリンに置換される。

これらのプライマーを使用することにより、 サブチリシン E遺伝子のプロモー ターおよびシグナルぺプチドをコ一ドする領域に接続するためのプロテアーゼ P FUS遺伝子を得ることができる。 すなわち、 ピロコッカス 'フリオサスの染色 体 DNAを铸型とし、 プライマー mu t RRと NP F— 4、 およびプライマー m u t FRと NPM— 1の 2通りのプライマー対と、 铸型としてピロコッカス .フ リオサスの染色体 DN Aとを使用する 2種類の PC Rを行う。 さらに、 各々の P CRで增幅された DNA断片を混合して形成されるへテロ ·デュープレックス

(hetero duplex) を铸型とし、 プライマー N P F— 4および N PM— 1を用い て 2回目の PCRを行う。 こうして、 その内部に BamH Iサイトを含まない約 2. 4kbのプロテアーゼ PF US遺伝子全長を增幅することができる。

上記の PC R增幅 DN A断片を BamH I、 Sph Iで消化して得られる約 2. 4 kbの DNA断片を単離し、 上記プラスミ ド p SNP 1中のプロテアーゼ PFUS 遺伝子を含む BamH I— Sph I断片と置き換える。 このようにして構築された発 現プラスミ ドはプラスミ ド p PS 1と命名され、 該プラスミ ドで形質転換された バチルス ·サブチリス DB 104は Bacillus subtilis DB 104ZP PS 1と 命名されている。 該形質転換体を培養した場合、 培養液上清、 および菌体抽出物 の両方にプラスミ ド p SNP 1を使用した場合と同様のプロテアーゼ活性が見い 出され、 上記のアミノ酸置換が酵素活性に影響を与えていないことが確認される。 図 7に、 プラスミ ド p P S 1の制限酵素地図を示す。

上記のサブチリシン Eのプロモーターおよびシダナルぺプチドをコードする領 域を含む約 0. 3kbの DNA断片を EcoR I、 BamH Iで消化し、 上記プラスミ ド p P S 1中の P 43プロモーターとリボソーム結合部位配列を含む EcoR I - BamH I断片と置き換える。 このようにして構築された発現プラスミ ドは pNA P S 1と命名され、 該プラスミ ドで形質転換されたバチルス ·サブチリス DB 1 04は Bacillus subtilis D B 104/p N AP S 1と命名されている。 該形質 転換体を培養し、 培養液上清および菌体抽出物についてプロテアーゼ活性を調べ ると、 どちらにも耐熱性のプロテアーゼ活性が認められ、 その発現量は Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1に比べて増加している。 図 8にプラスミ ド p NAP S 1の制限酵素地図を示す。

該形質転換体の発現するプロテアーゼは、 上記の Bacillus subtilis DB 10 4/p SNP 1の発現するものと同等の酵素化学的性質を示す。 また、 該形質転 換体の発現するプロテアーゼを精製し、 その N末端アミノ酸配列を解析したとこ ろ、 配列表の配列番号 22に示すアミノ酸配列が得られた。 該配列は配列表の配 列番号 15に示されたプロテアーゼ PFUSのアミノ酸配列の 133番目〜 14 4番目の配列に一致しており、 成熟型のプロテアーゼ PFUSはこの部分以降の ポリぺプチドからなる酵素であることが示された。 この結果より推測される成熟 型のプロテア一ゼ P F U Sのァミノ酸配列を配列表の配列番号 4に示す。

Bacillus subtilis D B 104 p N A P S 1が生産するプロテア一ゼの量は Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1 (FERM B P- 5634) と比 較して増加しているが、 さらに生産量をあげることが望まれる。 pNAPS lに はサブチリシンのシグナルぺプチドとプロテアーゼ P F U Sの融合べプチドがコ ードされているが、 この接続部分を改変し、 シグナルペプチドの除去が効率よく 起こるようにすることによりプロテアーゼの発現量が増加することが期待される。 上記のプラスミ ド p NAPS 1においては、 配列表の配列番号 3に示されるサブ チリシン Eのシグナルペプチドの C末端アミノ酸 （A 1 a) とプロテアーゼ PF USの N末端アミノ酸 （Me t) との間には A l a— G l y— S e rの 3ァミノ 酸からなるペプチドが挿入されている。 プラスミ ド p NAP S 1上のこのべプチ ドをコードする部分の DN Aに変異を導入し、 得られる変異プラスミ ドを導入し た形質転換体についてプロテアーゼ生産能を調べることにより、 プロテア一ゼ発 現量の向上した形質転換体を得ることができる。

まず、 プラスミ ド p NAPS 1上のサブチリシン E〜プロテアーゼ PFUSの 融合タンパクをコードする遺伝子について上記の 3アミノ酸ペプチド中の S e r をコードする部分を任意の 2アミノ酸をコードする塩基配列に改変した変異ブラ スミ ドを調製する。 このような変異プラスミ ドは PC Rを利用して作製すること ができる。 たとえば上記の S e rをコードするコドン （丁 CC) 部分を任意の 6 塩基に置換した配列を有するプライマー S POF 0および S POR0 (配列表の 配列番号 24および 25にそれぞれプライマ一 S P〇F 0および S POR0の塩 基配列を示す） と、 この前後の領域の塩基配列から作製したプライマ一 SUB 3 および N PR— 10 (配列表の配列番号 26および 27にそれぞれプライマー S UB 3および NPR— 10の塩基配列を示す） とを使用した PCRを行うことに よって、 上記の S e rをコードするコドン （TCC) 部分に目的の変異が導入さ れた DN A断片を得ることができる。 この断片をプラスミド p NAPS 1上の対 応する領域と置き換えることによって変異を導入されたプロテアーゼ遺伝子を含 有する変異プラスミ ドを得ることができる。

つぎに、 こうして得られた変異プラスミ ドを適当な宿主、 例えば、 バチルス · サブチリス DB 104に導入して得られる形質転換体についてそのプロテアーゼ 発現量を調べることにより、 発現量の上昇した形質転換体を取得することができ る。 プロテアーゼ発現量の確認は、 単離された形質転換体を個別に培養してその 培養物中の活性を調べることによつても行うことができるが、 基質を含有する寒 天プレートを培養に用いることにより、 発現量の上昇した形質転換体を容易に選 択することが可能になる。

すなわち、 上記の変異プラスミ ドを導入された形質転換体をスキムミルクを含 む寒天プレート上に生育させた後、 このプレートをプロテアーゼ P FUSがその 活性を示す温度、 たとえば 70°Cで保温する。 プロテア一ゼを発現する形質転換 体ではそのコ口ニーの周辺のスキムミルクが分解されて透明となるが、 この領域 の大きさからプロテアーゼの発現量を見積もることができる。

こうして得られた、 Bacillus subtilis D B 104/p N AP S 1に比較して プロテアーゼ活性を高発現する形質転換体のひとつは Bacillus subtilis DB 1 04/p SPOl 24と命名されている。 該形質転換体よりそこに含有されるプ ラスミ ド （該プラスミ ドは p S PO 124と命名されている） を調製し、 その塩 基酉 £列を解析した結果、 上記の S e rをコードする部分は塩基配列 GGGAAT に変異しており、 したがって、 S e rが G 1 y— As nに変異したタンパクがコ ードされていることが明らかとなった。

こうして、 サブチリシンのシグナルぺプチドの後に A 1 a— G l y-G 1 y- A s nの 4アミノ酸からなるペプチドを配置したうえで、 目的のタンパクの N末 端に融合させて発現させることにより、 バチルス属細菌を宿主としてその発現量 を増加させることが可能なことが明ら力 となった。 バチルス属細菌の生産するサ ブチリシンには本発明で使用したサブチリシン E (Bacillus subtilis由来） の 他、 バチルス 'アミノリケファシエンス （Bacillus amyloliquefacience) 由来 のサブチリシン BP N' [ヌクレイック ァシッズ リサ一チ （Nucl. Acids Res.) 第 1 1巻、 第 791 1〜 7925頁 （1983) ] 、 バチルス . リケニフ オノレミス （Bacillus licheniformis) 由来のサブチリシン Carlsberg [ヌクレイ ック ァシッズ リサーチ （Nucl. Acids Res. ) 第 13卷、 第 8913〜 892 6頁 （1985) ] 等が知られており、 そのアミノ酸配列には若干の相違がある がこれらのシグナルぺプチドも本発明に好適に使用できる。 また、 本発明におレ、 ては発現を制御するためのプロモータ一として、 サブチリシン E由来のプロモ一 タ一が使用されたが、 これにかえてバチルス属細菌で作用する種々のプロモータ 一を使用することが可能である。

また、 発現させるタンパクについても何ら制限はなく、 遺伝子を入手可能なも のであれば本発明を適用して遺伝子工学的に高発現させることが可能である。 本 発明が宿主以外の生物に由来するタンパクの発現に利用可能なことは、 バチルス 属細菌とは分類学上の位置を異にするピロコッカス ·フリオサス由来のタンパク が高発現されていることからも明らかである。 本発明は、 特に上記のプロテア一 ゼ PFUSと構造的に類似しているプロテアーゼ PFUL、 プロテアーゼ TCE Sゃスタフイロサーマス ·マリナス、 サーモバタテロイデス ·プロテオリティカ ス由来のプロテアーゼの遺伝子工学的生産に好適である。

プロテアーゼ P FU Sはサブチリシンとの相同性から考えてシグナルぺプチド とプロペプチドとを有する前駆体タンパクとして発現され、 その後プロセッシン グを受けて成熟型酵素になると考えられており、 また、 上記のプロテアーゼ PF U S成熟型酵素の N末端ァミノ酸配列解析の結果より、 成熟型酵素は配列表の配 列番号 4に示されるアミノ酸配列からなる酵素であると予想される。 しかしなが ら、 精製された成熟型プロテア一ゼ PFUSの分子量は約 45kDaであり、 この アミノ酸配列から計算されるものに比べて小さい。 このことは前駆体として発現 されたプロテア一ゼ PFUSが、 その C末端側のペプチドもプロセッシングを受 けて成熟型プロテアーゼに転換されていることを示唆している。

このプロセッシングによって除去される C末端側べプチドが酵素活性、 および 酵素タンパクの正しい構造へのフォールディングに必須でなければ、 遺伝子上の この部分をコードする領域を欠失させて発現させることによつてもプロテア一ゼ PFUSの発現量の増加が期待される。

上記の Bacillus subtilis DB 104/p NAP S 1より得られる成熟型プロ テアーゼ P FUSについて、 例えば質量分析装置を用いてその分子量を精密に測 定することができる。 この分子量と、 先に明らかにされた成熟型プロテアーゼ P FUSの N末端アミノ酸配列より、 該プロテア一ゼが配列表の配列番号 15に示 されるアミノ酸配列の 133番目の Alaから 552番目の Thrまでに対応するポリ ペプチドであることがわかる。 さらに、 上記のプラスミ ド p NAPS 1に含まれ るプロテアーゼ p FUS遺伝子の 552番目の Thrをコードする部位の近傍に終 止コドンを導入することにより、 酸素活性には不必要なポリペプチドを欠失した プロテアーゼ PFUSを発現するプラスミ ドを構築することができる。 すなわち、 プラスミ ド p NAPS 1上のプロテアーゼ PFUS遺伝子のうち、 その開始コド ンから 544番目のアミノ酸 （S e r) をコードするコドンの C末端側に終止コ ドン （TGA) を導入することができるプライマー NPR544 (配列表の配列 番号 28にプライマー NPR 544の塩基配列を示す） と、 上記遺伝子上の Nsp Vサイトの上流領域の塩基配列を有するプライマー NPFE81 (配列表の配列 番号 29にプライマー NPFE81の塩基配列を示す） とを使用した PC Rによ り、 目的の終止コドンが導入された塩基配列を有する DNA断片を得ることがで きる。 つぎに、 この断片をプラスミ ド p NAP S 1上の対応する領域と置き換え ることによって目的の変異を導入されたプロテアーゼ遺伝子を含有する変異ブラ スミ ドを得ることができる。 該プラスミ ドはプラスミ ド pNAPSACと命名さ れ、 また該プラスミドで形質転換されたバチルス ·サブチリス D B 104は Bacillus subtilis DB 104/p NAP S ACと命名されている。

該形質転換体はプロテアーゼ PFUSと同等の性質を有するプロテアーゼ活性 を発現し、 その発現量は Bacillus subtilis D B 104/p NAP S 1に比較し て高い。

こうして、 プラスミ ド p NAP SACに含有されるプロテアーゼ PFUS遺伝 子が、 該酵素の活性の発現に十分な領域を有していることが明らかとなった。 該 プラスミ ド上に存在するプロテア一ゼ P F U Sをコ一ドする領域の塩基配列を配 列表の配列番号 2に示す。 また、 該塩基配列にコードされるアミノ酸配列を配列 表の配列番号 1に示す。

さらに、 上記のプラスミ ド p S POl 24上のプロテアーゼ PFUS遺伝子に ついて、 プラスミ ド pNAPSACと同様の変異を導入し、 C末端側ペプチドを 欠失させたプロテアーゼ PFUSを発現させることができる。

すなわち、 上記のプラスミド pNAPSACを NspVと Sphlで消化して得ら れる約 1 3kbの DNA断片を、 予め NspVと Sph Iで消化したプラスミ ド p S P 〇 1 24と混合してライゲーシヨンを行うことにより、 目的とするプラスミ ドを 構築することができる。 該プラスミ ドはプラスミ ド p SPO l 24ACと命名さ れ、 また該プラスミ ドで形質転換されたバチルス ·サブチリス DB 104は Bacillus subtilis DB 104/p SPO124厶 Cと命名、 表示され、 平成 9 年 5月 16日 （原寄託日） より、 ブタペスト条約の下、 日本国茨城県つくば市東 1丁目 1番 3号の、 通産省工業技術院生命工学工業技術研究所に受託番号 FER M BP— 6294として寄託されている。 該形質転換体は Bacillus subtilis DB 104/p NAP S 1に比較してプロテアーゼの発現量が向上している。 上記の形質転換体、 Bacillus subtilis DB 104/p NAP S ACおよび Bacillus subtilis DB 104/p S PO 124 ACの生産するプロテアーゼの 酵素学的、 理化学的性質は、 Bacillus subtilis DB 104/p SNP 1の生産 するプロテア一ゼのものと差は見られない。 すなわちこれらの両形質転換体培養 物より得られるプロテァーゼの主な性質は以下のとおりである。

(1) 作用：

カゼイン、 ゼラチンを分解し、 短鎖ポリペプチドを生成する。

スクシニル— L—ロイシルー L—ロイシノレ一 L—バリル一 L—チロシン一 4一 メチルクマリン一 7—アミド （Su e— L e u— Le u— Va l—Ty r -MC A) を加水分解し蛍光物質 （7—ァミノ一 4—メチルクマリン） を生成する。 スクシニル— L—ァラニルー L—ァラニル一 L—プロリル一 L—フエ二ルァラ ニン一 p—ニトロァニリ ド （Su e— A l a -A 1 a— P r o— Ph e— p— N A) を加水分解し黄色物質 （p—二トロア二リン） を生成する。

(2) 至適温度：

40〜1 10°Cで酵素活性を示し、 その至適温度は 80〜95°Cである。

(3) 至適 p H：

pH5〜l 0の間で酵素活性を示し、 その至適 pHは pH6〜8である。

(4) 熱安定性：

95°C、 8時間の処理後も 90%以上の酵素活性を保持している。

(5) p H安定性

pH5〜l l、 95°C、 60分間の処理後も 95%以上の活性を保持している。

(6) 分子量

SDS— PAGE上で約 45kDaの分子量を示す。

こうして、 高い熱安定性を有するプロテアーゼおよびその遺伝子が提供される。 また、 該プロテアーゼの大量発現を可能にする新規のタンパク発現系も本発明に より開示される。 該発現系は、 本発明のプロテアーゼの他、 種々のタンパクの遺 伝子工学的な製造において有用である。

以下に実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、 本発明はこれらに限 定されるものではない。

実施例 1

(1) ピロコッカス .フリオサスの染色体 DNAの調製

ピロコッカス ·フリオサス DSM3638の培養は以下のとおりに行った。 1% トリプトン、 0. 5%酵母エキス、 1% 可溶性デンプン、 3. 5% ジ ャマリン S ·ソリッド （ジャマリンラボラトリー卞 ± ) 、 0. 5% ジャマリン S . リキッド （ジャマリンラボラトリ一卞±^) 、 0. 003% Mg SO4、 0. 001% N a C 1 0. 0001% Fe SO4 ' 7H2O、 0. 0001% CoS〇4、 0. 0001% CaC l 2 - 7H2O, 0. 0001% ZnSO 4、 0. 1 p pm C u SO4 · 5H 20、 0. l p pm H3B〇3、 0. 1 p pm KA 1 (SO4) 2、 0. 1 p p m N a 2 M o O 4 · 2 H 2〇、 0. 25 p pm N i C l 2 * H2〇の組成の培地を 2リツトル容のメディゥムボトルに 入れ、 120°C、 20分間殺菌した後、 窒素ガスを吹き込んで溶存酸素を除去し た後、 これに上記菌株を接種して 95 °C、 16時間静置培養した。 培養終了後、 遠心分離によつて菌体を集めた。

つぎに、 得られた菌体を 25%スクロースを含む 5 OmM トリス一 HC 1 (p H 8. 0) 4mlに懸濁し、 この懸濁液に 2mlの 0. 2M EDTA、 0. 8mlの リゾチーム （SmgZml) を加えて 20°C、 1時間保温した後、 24mlの SET溶 液 （150mM NaC l、 lmM EDTA、 2 OmM トリスー HC 1、 pH8. 0) 、 4mlの 5%SDS、 400 μ 1のプロティナ一ゼ K (1 Omg/ml) を加え、 さらに 37°C、 1時間保温した。 フエノール一クロ口ホルム抽出を行って反応を 停止した後、 エタノール沈殿を行って約 3. 2 nigの染色体 DN Aを得た。

実施例 2

(1) プラスミ ド pNS P 1の構築のためのプライマーの合成

プロテアーゼ P F U S遺伝子全長の増幅に使用するためのプライマーを合成す るために、 該遺伝子全長を含むプラスミ ド p SNP lを Bacillus subtilis D B I O 4/p SNP 1 (FERM BP—5634) より単離し、 必要な領域の 塩基配列を決定した。 この塩基配列をもとに、 プロテアーゼ PFUS遺伝子の開 始コドンの直前に BamH Iサイトを導入するためのプライマー N P F— 4、 およ ぴ該遺伝子の 3 ' 側にハイブリダイズし、 S ph Iの認識配列を含むプライマー N PM— 1を合成した。 配列表の配列番号 13、 19にそれぞれプライマー NPF —4、 プライマー NPM— 1の塩基配列を示す。 また、 プロテアーゼ PFUS遺伝子の内部、 開始コドンから約 1. 7kb下流に 存在する BamH Iサイトを除くためのプライマー mu t RR、 mu t FRを合成 した。 配列表の配列番号 20、 21にそれぞれプライマー mu t RR、 mu t F Rの塩基配列を示す。

(2) プラスミ ド p P S 1の調製

铸型としてピロコッカス ·フリオサスの染色体 DNAを、 またプライマーとし て上記プライマ一 NPF— 4と mu t RRの組合せ、 あるいはプライマー mu t FRと NPM— 1の組合せを含む 2組の LA_ PC R反応液を調製し、 それぞれ 94°C、 30秒〜55¾、 1分〜 68°C、 3分を 1サイクルとした 30サイクル の反応を行った。 LA— PCR反応液の調製には LA PCR K i t Ve r.

2 (宝酒造社製） を使用した。 この反応液の一部を用いてァガロース電気泳動を 行うと、 プライマー NPF— 4および mu t RRを用いた場合は約 1. 8kbの、 プライマー mu t FRおよび NPM— 1を用いた場合は約 0. 6kbのDNA断片 が増幅した。

上記の 2種類の PC R反応液より SUP REC— 02 (宝酒造社製） を用いて プライマーが除去された増幅 DN A断片を調製した。 これらの両増幅 DN A断片 を含み、 プライマー、 および LA T a qは含まない LA— PCR反応液を調製 して 94°C、 10分間の熱変性を行い、 30分かけて 30°Cまで冷却した後、 3 0°Cで 15分間保温してヘテロ 'デュープレックス （hetero duplex) を形成さ せた。 つぎに、 この反応液に L A T a q (宝酒造社製） を添加して 72 °Cで 3 分間反応させた後、 さらにプライマ一 NPF— 4、 NPM— 1を添加して 94°C、

30秒〜55。〇、 1分〜 68°C、 3分を 1サイクルとして 25サイクルの反 Jiを 行った。 この反応液中には約 2. 4 kbの DN A断片の増幅が見られた。

上記約 2. 4kbの DNA断片を BamH I、 Sphl (ともに宝酒造ネ： h ) で消化 し、 この断片を予め BamH I、 Sph Iで消化してプロテアーゼ P FU S遺伝子全 長を除去したプラスミ ド p SNP 1と混合してライゲーシヨンを行った後、 バチ ルス ·サブチリス DB 104に導入した。 得られたカナマイシン耐性の形質転換 体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 2. 4kb断片 1分子のみが挿入されたブラ スミ ドを選び、 これをプラスミ ド p PS 1と命名した。 また、 該プラスミ ド p P S 1で形質転換されたバチルス ·サブチリス DB 104を Bacillus subtilis D B 104/p PS 1と命名した。

図 Ίにプラスミ ド p P S 1の制限酵素地図を示す。

(3) サブチリシン Ε遺伝子のプロモータ一〜シグナノレぺプチド領域の DNA 断片の増幅

サブチリシン Ε遺伝子のプロモータ一〜シグナルぺプチド領域を得るためのプ ライマーを合成した。 まず、 ジャーナル'ォブ 'バクテリオロジー

(J. Bacteriol. ) 第 1 71卷、 第 2657〜 2665頁 （1989) に記载のサ ブチリシン E遺伝子のプロモーター領域部分の塩基配列を参考に、 該領域の上流 にハイブリダィズし、 EcoR Iサイ トを含むプライマー SUB 4 (配列表の配列 番号 1 7にプライマー SUB 4の塩基配列を示す） を合成した。 次にジャーナ ノレ ·ォブ ·パクテリォロジ一 （J.Bacteriol.) 第 158卷、 第 41 1〜418頁

(1 984) に記載のサブチリシン E遺伝子の塩基配列を参考に、 シグナルぺプ チドの直後に BamH 1サイトを導入できるプライマ一 B mR 1 (配列表の配列番 号 18にプライマー BmR Iの塩基配列を示す） を合成した。

ジャーナル'ォブ 'バクテリオロジー （J. Bacteriol. ) 第 1 71卷、 第 265

7〜 2665頁 （1 989) に記載のサブチリシン E遺伝子を含むプラスミ ド p KWZを铸型とし、 上記のプライマー SUB 4、 BmR 1を含む PC R反応液を 調製し、 94°C、 30秒〜55°〇、 1分〜 68°C、 2分を 1サイクルとする 30 サイクルの反応を行った。 この反応液の一部を用いてァガロース電気泳動を行う と、 約 0. 3kbの DNA断片が増幅していることが確認された。

(4) プロテアーゼ発現プラスミ ド p NAP S 1の構築

上記約 0. 3kbのDNA断片をEcoR I (宝酒造社製） 、 BamH Iで消化した 後、 予め EcoR I、 BamH Iで消化した実施例 3に記載のプラスミド p P S 1と 混合してライゲーシヨンした後、 バチルス ·サブチリス DB 104に導入した。 得られたカナマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 0. 3 kb断片 1分子のみが挿入されたプラスミ ドを選び、 これをプラスミド pNAP S 1と命名した。 また、 該プラスミ ド p NAP S 1で形質転換されたバチルス . サブチリス DB 104を Bacillus subtilis DB 104/p NAP S 1と命名し た。

図 8にプラスミ ド p NAP S 1の制限酵素地図を示す。

(5) プラスミ ド p SNP 2の構築

上記のプラスミ ド p NAPS 1中に存在するサブチリシン Eのシグナルぺプチ ドをコ一ドする領域の上流に BamH Iサイトを導入するためのプライマー S U B 17 R (配列表の配列番号 23にプライマー SUB 17 Rの塩基配列を示す） を 合成した。 該プライマーと上記のプライマー SUB 4、 および铸型としてプラス ミ ド pNAP S 1を含む PCR反応液を調製し、 94°C、 30秒〜55° 1分 〜72°C、 1分を 1サイクルとする 25サイクルの反応を行った。 増幅した約 0. 2 lkbの DNA断片を EcoR Iと BamH Iで消化し、 サブチリシン Eのプロモー ターと SD配列を含む約 0. 2kbの DNA断片を得た。 この断片を、 予め EcoR Iと B amH Iで消化したプラスミ ド p N A P S 1と混合してラィゲーションした 反応液を用いて、 バチルス ·サブチリス DB 104を形質転換した。 得られた力 ナマイシン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 0. 2 kbの D N A断片が挿入されたプラスミ ドを選び、 これをプラスミド p SNP2と命名した。

(6) プロテア一ゼを高発現する変異プラスミ ドの作製

上記のプラスミ ド p NAPS 1中のサブチリシン Eのシグナルペプチドとプロ テアーゼ P FUSの開始コドンとの結合部のアミノ酸の S e r (塩基配列 TC C) を任意の 2つのアミノ酸に置き換えるためのプライマー S POF0と SPO R0 (配列表の配列番号 24および 25にそれぞれプライマー S POF 0と S P OR0の塩基配列を示す） を合成した。 また、 プラスミド pNAPS 1中のサブ チリシン Eのシグナルぺプチドをコ一ドする領域の直前に BamH Iサイトを導入 するためのプライマ一 SUB 3、 およびプロテアーゼ PFUSをコードする領域 内の Spelサイトを含むプライマー NPR— 10 (配列表の配列番号 26および 27にプライマー SUB 3およぴプライマー NPR— 10の塩基配列を示す） を 合成した。 プラスミ ド pNAP S 1を铸型として、 上記プライマー S POF 0と NPR— 10とを含む PC R反応液及び上記プライマー SUB 3と S POR0とを含む P CR反応液を調製し、 94°C、 30秒〜50°〇、 1分〜 72°C、 1分を 1サイク ルとする 20サイクルの反応を行つた。 両反応液で増幅したそれぞれ約 0. 13 kbと約 0. 35kbの DNA断片を混合して 94°Cで 10分間熱変性させた後、 3 7°Cまで徐冷してヘテロ ·デュープレックスを形成させ、 さらに Ta qポリメラ —ゼ （宝酒造 tt ) によってこのへテロ 'デュープレックスから 2本鎖 DNAを 作製した。 こうして得られた 2本鎖 DN Aを铸型とし、 上記のプライマー SUB 3、 プライマー NPR— 10を含む PC R反応液を調製し、 94°C、 30秒〜 5 0°C、 1分〜 72°C、 1分を 1サイクルとする 25サイクルの反応を行った。 増 幅した約 0. 43kbのDNA断片をBaπlH I と Spe I (宝酒造社製） で消ィヒして 得た DN A断片を、 予め BamH Iと Spe Iで消化した上記のプラスミ ド p SNP 2と混合してライゲーシヨンを行い、 この反応液を用いてバチルス ·サブチリス DB 104を形質転換した。

得られたカナマイシン耐性の形質転換体をスキムミルクプレート （10μ g/ml カナマイシン、 1 %スキムミルクを含む LB—高温培養用寒天培地） 上に接種し てコロニーを形成させた後、 このプレートを 70°Cで保温し、 コロニー周辺のス キムミルクの分解の状態から各形質転換体の発現するプロテアーゼ活性を調べた。 その結果、 特に高い活性が検出された 1クローンを単離してこれよりプラスミ ド を調製し、 これをプラスミ ド p S P〇 124と命名した。 また、 該プラスミ ドで 形質転換されたバチルス ·サブチリス DB 104を Bacillus subtilisDB 10 4/p S PO 124と命名した。 プラスミ ド p S PO 124についてその塩基配 列を角军析したところ、 プラスミ ド p NAPS 1において上記の S e rをコードし ていた部分の塩基配列は GGGAATに置換されており、 S e rが G 1 y— As nの 2アミノ酸に変異したタンパクがコードされていた。 また、 この変異と同時 にプロテアーゼ P FUSの開始コドンから 25番目に存在する P r oに対応する コドン （CCA) が L e uをコードするもの （CTA) に変化していることが判 明した。 (7) プロテアーゼ発現プラスミ ド pNAP S ACの構築

上記のプラスミ ド p NAPS 1中のプロテアーゼ PFUS遺伝子の開始コドン から 544番目のアミノ酸の C末端側に終始コドンを導入し、 この部位以降を欠 失したプロテアーゼを発現するプラスミ ドを構築した。 上記遺伝子上の 544番 目のアミノ酸をコードするコドンの C末端側に終止コドン （塩基配列 TGA) を 導入し、 かつ Sphlサイトを有するプライマー NPR544 (配列表の配列番号 28にプライマ一 NPR544の塩基配列を示す） を合成した。 さらに、 上記遺 伝子上の NspVサイトの上流部分の塩基配列をもとに、 プライマー NPFE81 (配列表の配列番号 29にプライマー NPFE 81の塩基配列を示す） を合成し た。

プラスミ ド pNAP S 1を铸型として、 上記プライマー NPFE 81と NPR 544を含む PC R反応液を調製し、 94°C、 30秒〜50°〇、 1分〜 72°C、 1分を 1サイクルとする 20サイクルの反応を行った。 増幅した約 0. 61kbの DNA断片を NspV (宝酒造ネ ± ) と Sphlで消ィ匕し、 終止コドンを含む約 0. 1 3kbの DNA断片を得た。 この DNA断片を、 予め制限酵素 NspVと Sph Iで 消化したプラスミ ド p NAPS 1と混合してライゲーシヨンを行い、 この反応液 を用いて、 バチルス ·サブチリス DB 104を形質転換した。 得られたカナマイ シン耐性の形質転換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 0. 13 kbの D N A断 片が挿入されたプラスミ ドを選び、 これをプラスミ ド p NAP SACと命名した。 さらに、 このプラスミ ド p NAP SACで形質転換されたバチルス ·サブチリス DB 104を Bacillus subtilis DB 104ノ p NAP S Δ〇と命名した。

(8) プロテアーゼ発現プラスミ ド p SP〇1 24厶 Cの構築

上記プラスミ ド p NAP SACを NspVと Sphlで消化して得られる約 1. 3 kbの DNA断片を単離し、 これを予め NspVと Sphlで消化したプラスミド p S POl 24と混合してライゲーシヨンを行った。 この反応液を用いて、 パチル ス ·サブチリス D B 104を形質転換した。 得られたカナマイシン耐性の形質転 換体よりプラスミ ドを調製し、 上記の約 1. 3 kbの DN A断片が挿入されたブラ スミ ドを選ぴ、 これをプラスミ ド p S PO 124 ACと命名した。 さらに、 この プラスミ ド p SPOl 24 ACで形質転換されたバチルス ·サブチリス DB 10 4を Bacillus subtilis DB 104/p SPO124 ACと命名した。

実施例 3

(1) プロテア一ゼ PF US遺伝子を含有するプラスミ ドで形質転換したバチ ルス ·サブチリスの培養と粗酵素液の調製

実施例 2で得られた、 プロテアーゼ PFUS遺伝子を含有するプラスミド pN AP S 1を導入したバチルス ·サブチリス DB 104、 Bacillus subtilis DB 104 ^/pNAPS lをl 0 igZmlのカナマイシンを含む LB培地 （トリプト ン 1 OgZリットル、 酵母エキス 5gZリットル、 N a C 1 5g/リットル、 pH 7. 2) 2 ml中、 37°Cで、 24時間培養した。 培養液は遠心分離して培養液上 清 （標品 1一 S ) と菌体とを得た。

得られた菌体は 100 1の 5 OmMトリス— HC 1、 pH 7. 5に懸濁し、 2 mgのリゾチーム （シグマ社製） を加えた後に、 37 °Cで 45分間消化した。 消化 後の試料をさらに 95°Cで 10分間加熱処理した後、 遠心分離して上清を集め、 無細胞抽出液 （標品 1— L) とした。

また、 上記のプラスミ ド p SPO l 24を含有する Bacillus subtilis DB 104/p S PO 124, 上記のプラスミ ド p NAP SACを含有する

Bacillus subtilis DB 104/p NAP S AC, あるいは p SP〇1 24厶 C を含有する acillus subtilis DB 104/p S P〇 124 ACより、 上記同様 の操作で培養液上清、 無細胞抽出液を調製した。 Bacillus subtilis DB 10 4/p S PO 124の培養液上清を 1 24— S、 無細胞抽出液を 124— Lと命 名した。 Bacillus subtilis DB 104Zp NAP S ACの培養液上清を厶 C— S、 無細胞抽出液を AC— Lと命名した。 Bacillus subtilis DB 104/p S PO 124 Δ〇の培養液上清を 124Δ〇— S、 無細胞抽出液を 124Δ〇一 Lと命名した。 これらの標品を用いて、 プロテアーゼ活性を測定し、 各標品中に 含まれるプロテアーゼ濃度を調べた。

(2) プロテアーゼ生産能の比較

プロテアーゼ p FUSの活性測定は S u c -A 1 a -A 1 a— P r o— Ph e -p-NA (シグマ社製） を基質とし、 酵素による加水分解反応によって生成す る p—二トロア二リンを分光学的に測定する事により行なった。 すなわち、 酵素 活性を測定しようとする酵素標品を適度に希釈し、 その試料溶液 50 /X 1に ImM Su e—A 1 a -A l a—P r o— Ph e— p— NA溶液 （10 OraMリン酸緩衝 液、 pH7. 0) 50 1を加え、 95°Cで 30分間反応させた。 氷冷して反応 を停止した後、 405nmにおける吸光度を測定し、 p—二トロア二リンの生成量 を求めた。 酵素 1単位は、 95 °Cにおいて 1分間に 1 μ moleの p—二トロアニリ ンを生成する酵素量とした。 さらに、 得られた酵素活性をもとに培養液上清およ ぴ菌体内に発現された酵素タンパク量を、 プロテアーゼ PFUSの蛋白質重量当 たりの比活性を 9. 5単位/ mgとして算出した。

実施例 3— (1) で調製した各酵素標品のプロテアーゼ活性を測定し、 その測 定結果から算出した各形質転換体培養液 1 リットルあたりのプロテアーゼ PFU S生産量を表 1に示す。

Bacillus subtilis DB 104/p S PO 124では Bacillus subtilis DB 104/pNAP S 1と比較して菌体内のプロテアーゼ PFUS生産量が 3. 6 倍に増加した。 また、 Bacillus subtilis D B 104 / p N A P S厶 Cでは培 養液上清で 2. 4倍、 菌体内で 2. 2倍のプロテアーゼ PFUS生産量の増加が 見られた。 さらに、 Bacillus subtilis DB 104/p SPO 1 24厶じでも培 養液上清で 2倍、 菌体内で 2. 4倍にプロテアーゼ PFUS生産量が増加してい た。 、 さらに、 菌体当たりの生産量も増加した。

培養液上清、 菌体内のプロテアーゼ PFUS生産量の合計値を Bacillus subtilis DB 104/p NAP S 1での値と比較すると、 Bacillus subtilis DB 104/p S P〇124で 2. 1倍、 Bacillus subtilis DB 104/pN AP S ACで 2. 1倍、 Bacillus subtilis DB 104/p S P〇 124 ACで 2. 2倍にそれぞれ増加した。 プロテアーゼ P F U Sの生産量 （培養液 1リットルあたり、 単位 mg) 形質転換体 （プラスミ ド） 培養液上清 菌体 培養液 +菌体 pNAP S 1 15. 1 12. 5 27. 6 p S PO 124 1 3. 1 45. 4 58. 5 p NAP S AC 35. 5 28. 1 63. 6 p S PO 124厶 C 30. 5 30. 1 60. 6

実施例 4

(1) 成熟型プロテアーゼ PFUSの精製酵素標品の調製

実施例 2で得られた本発明の超耐熱性プロテアーゼ遺伝子を導入されたバチル ス ·サブチリス DB 104、 Bacillus subtilis DB 104/p NAP S 1およ び Bacillus subtilis DB 104/p S PO 124 ACを、 それぞれ 10 ^g/ mlのカナマイシンを含む LB倍地 5mlを含む試験管に接種し、 37°Cで 7時間振 とう培養した。 10 μ g/mlのカナマイシンを含む TM倍地 （大豆粉 5 g/リット ル、 ポリペプトン 10g/リットル、 肉エキス 5 g/リットル、 酵母エキス 2 g/ リッ トノレ、 グルコース 10g/リットル、 F e S〇₄ · 7H₂0 1 Omg/リット ノレ、 Mn S0₄ · 4H₂0 1 Omg/リッ トル、 ZnS0₄ ' 7H₂0 1 mg/リ ツ トル、 pH 7. 0) 500mlを 5リットノレ容の三角フラスコに準備し、 上記培養 液を 5 ml接種して 30°Cで 3日間振とう培養した。 得られた培養液を超音波処理 後、 95 °Cで 30分間加熱処理し、 遠心分離後上清を回収した。 上清に 25%飽 和となるように硫酸アンモニゥムを加えた後、 遠心分離を行って得られる上清を、 25 %飽和の硫酸ァンモニゥムを含む 25 mMトリス—塩酸緩衝液 （ p H 7. 6) で平衡化したマクロプレップ メチル H I C (Macro-Prep Methyl H I C、 バイ ォラッド社製） カラムにアプライした。 同じ,緩衝液でゲルを洗浄後、 40%エタ ノールを含む 25 mMトリス—塩酸緩衝液 （pH7. 6) を用いたステップワイズ 溶出により、 カラムに吸着したプロテアーゼ PFUSを溶出させた。 こうして得 られたプロテアーゼ P FUSを含む画分を 20%ァセトニトリルを含む 0. 0 5%トリフルォロ酢酸で平衡化した NAP— 25カラム （フアルマシアネ ± ) を 用いたゲルろ過に供し、 プロテアーゼ PFUSを変性させるとともに脱塩を行レ、、 精製プロテアーゼ P FUS標品を得た。 なお、 Bacillus subtilis DB 104/ pNAP S 1より得られた標品を NAP S— 1、 また Bacillus subtilis DB 1 04/p S PO 1 24ACより得られた標品を SPO— 124ACとそれぞれ命 名した。

0. 1 % S D S— 10 %ポリアクリルアミ ドゲルを用いて上記の両精製酵素標 品の電気泳動を行い、 クーマシー ·ブリリアントブルー R— 250で染色をおこ なうと、 精製酵素標品 NAP S— 1、 S PO- 1 24 Δ〇はどちらも単一のバン ドを示し、 推定分子量はともに約 45kDaであった。

( 2 ) 成熟型のプ口テア一ゼ PFUSの N末端ァミノ酸配列分析

G1000Aプロテインシーケンサー （ヒューレット 'パッカード ¾t ) を用いた自 動エドマン法により精製酵素標品 NAPS— 1、 S PO- 124 ACの N末端ァ ミノ酸配列分析を行った。 これらの 2種の精製酵素標品の N末端ァミノ酸配列は、 ともに配列表の配列番号 22に示したものであった。 該配列は配列表の配列番号 1 5に示されたプロテアーゼ PFUSのアミノ酸配列の 133番目から 144番 目の配列に一致しており、 NAPS— 1、 S PO— 124厶 Cのどちらもこの部 分以降のポリべプチドから成る酵素であることが示された。

(3) 成熟型のプロテア一ゼ P FUSの質量分析

AP I 300四重極三連質量分析装置 （パーキン—エルマ一 ·サイエックス社 製） を用いて精製酵素標品 NAPS— 1、 S PO— 124ACの質量分析を行つ た。 NAPS— 1の分子量は 43, 744Daと推定されたことより、 Bacillus subtilis DB 104/pNAP S 1の生産する成熟型のプロテア一ゼ P F U S は配列表の配列番号 15に示されたプロテアーゼ PFUSのアミノ酸配列の 1 33 番目の Alaから 552番目の Thrまでのポリペプチドからなる酵素であることが示 された。 また、 S P〇一 1 24厶 Cの分子量は 42， 906Daと推定されたことより、 Bacillus subtilis DB 104/p SPOl 24 Δ Cの生産する成熟型のプロテ ァーゼ P F U Sは配列表の配列番号 1 5に示されたプロテアーゼ P F U Sのアミ ノ酸配列の 133番目の Alaから 544番目の Serまでのポリペプチド、 すなわち 配列表の配列番号 2に示されたァミノ酸配列からなる酵素であることが示された。

配列表

出願人氏名 ：寶酒造株式会社

発明の名称：超耐熱性プロテアーゼ発現系

整理番号： 6 6 0 7 8 2

出願番号：

出願日 ：

優先権番号：平成 9年特許願第 1 5 1 9 6 9号

優先日 ：平成 9年 6月 1 0日

配列の数： 2 9

配列番号： 1

配列の長さ ： 4 1 2

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala

5 10 15

Thr Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie

20 25 30

Gly lie lie Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin

35 40 45

Gly Lys Val lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr

50 55 60

Pro Tyr Asp Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala

65 70 75

Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala

80 85 90 Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly

95 100 105

Ser Gly Ser lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val

110 115 120

Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu

125 130 135

Gly Ser Ser Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala eu Ser Gin Ala

140 145 150

Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala

155 160 165

Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr lie Gly Ser Pro Ala Ala

170 175 180

Ala Ser Lys Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val

185 190 195 lie Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu

200 205 210

Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg

215 220 225

Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gin Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr

230 235 240

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly lie

245 250 255

Ala Ala Leu Leu Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys

260 265 270

Val Lys Thr Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp

275 280 285

Glu lie Ala Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr

290 295 300 Lys Ala lie Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly

305 310 315

Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser

320 325 330

Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn

335 340 345

Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val

350 355 360

Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr

365 370 375

Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr lie Lys Val Val Ser Tyr

380 385 390

Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser

395 400 405

し eu Ser Gin Pro Gly Ser Ser

410 配列番号： 2

配列の長さ ： 1 2 3 6

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

起源： ピロコッカス 'フリォサス

株名 ： D S M 3 6 3 8

配列：

GCAGAATTAG AAGGACTGGA TGAGTCTGCA GCTCAAGTTA TGGCAACTTA CGTTTGGAAC 60 TTGGGATATG ATGGTTCTGG AATCACAATA GGAATAATTG ACACTGGAAT TGACGCTTCT 120 CATCCAGATC TCCAAGGAAA AGTAATTGGG TGGGTAGATT TTGTCAATGG TAGGAGTTAT 180

CCATACGATG ACCATGGACA TGGAACTCAT GTAGCTTCAA TAGCAGCTGG TACTGGAGCA 240

GCAAGTAATG GCAAGTACAA GGGAATGGCT CCAGGAGCTA AGCTGGCGGG AATTAAGGTT 300

CTAGGTGCCG ATGGTTCTGG AAGCATATCT ACTATAATTA AGGGAGTTGA GTGGGCCGTT 360

GATAACAAAG ATAAGTACGG AATTAAGGTC ATTAATCTTT CTCTTGGTTC AAGCCAGAGC 420

TCAGATGGTA CTGACGCTCT AAGTCAGGCT GTTAATGCAG CGTGGGATGC TGGATTAGTT 480

GTTGTGGTTG CCGCTGGAAA CAGTGGACCT AACAAGTATA CAATCGGTTC TCCAGCAGCT 540

GCAAGCAAAG TTATTACAGT TGGAGCCGTT GACAAGTATG ATGTTATAAC AAGCTTCTCA 600

AGCAGAGGGC CAACTGCAGA CGGCAGGCTT AAGCCTGAGG TTGTTGCTCC AGGAAACTGG 660

ATAATTGCTG CCAGAGCAAG TGGAACTAGC ATGGGTCAAC CMTTAATGA CTATTACACA 720

GCAGCTCCTG GGACATCAAT GGCAACTCCT CACGTAGCTG GTATTGCAGC CCTCTTGCTC 780

CAAGCACACC CGAGCTGGAC TCCAGACAAA GTAAAAACAG CCCTCATAGA AACTGCTGAT 840

ATCGTAAAGC CAGATGAAAT AGCCGATATA GCCTACGGTG CAGGTAGGGT TAATGCATAC 900

AAGGCTATAA ACTACGATAA CTATGCAAAG CTAGTGTTCA CTGGATATGT TGCCAACAAA 960

GGCAGCCAAA CTCACCAGTT CGTTATTAGC GGAGCTTCGT TCGTAACTGC CACATTATAC 1020

TGGGACAATG CCAATAGCGA CCTTGATCTT TACCTCTACG ATCCCAATGG AAACCAGGTT 1080

GACTACTCTT ACACCGCCTA CTATGGATTC GAAAAGGTTG GTTATTACAA CCCAACTGAT 1140

GGAACATGGA CAATTAAGGT TGTAAGCTAC AGCGGAAGTG CAAACTATCA AGTAGATGTG 1200

GTAAGTGATG GTTCCCTTTC ACAGCCTGGA AGTTCA 1236 配列番号： 3

配列の長さ ： 2 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Arg Ser Lys Lys Leu Tm lie Ser Leu Leu Phe Ala Leu Thr 5 10 15

Leu lie Phe Thr Met Ala Phe Ser Asn Met Ser Ala Gin Ala

20 25 配列番号： 4

配列の長さ ： 5 2 2

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー 直鎖状

配列の種類 ペプチド

配列の特徴 4 2 8番目の Xaaは Glyか Val

配列：

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala

5 10 15

Thr Tyr Val Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie

20 25 30

Gly lie lie Asp Thr Gly He Asp Ala Ser His Pro Asp Leu Gin

35 40 45

Gly Lys Val lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr

50 55 60

Pro Tyr Asp Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala

65 70 75

Ala Gly Thr Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala

80 85 90

Pro Gly Ala Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly

95 100 105

Ser Gly Ser lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val

110 115 120 Asp Asn Lys Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu

125 130 135

Gly Ser Ser Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala

140 145 150

Val Asn Ala Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala

155 160 165

Gly Asn Ser Gly Pro Asn Lys Tyr Thr lie Gly Ser Pro Ala Ala

170 175 180

Ala Ser Lys Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val

185 190 195 lie Thr Ser Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu

200 205 210

Lys Pro Glu Val Val Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg

215 220 225

Ala Ser Gly Thr Ser Met Gly Gin Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr

230 235 240

Ala Ala Pro Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly lie

245 250 255

Ala Ala Leu Leu Leu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp Lys

260 265 270

Val Lys Thr Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp

275 280 285

Glu lie Ala Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr

290 295 300

Lys Ala lie Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly

305 310 315

Tyr Val Ala Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser

320 325 330 Gly Ala Ser Phe Val Thr Ala Thr Leu Tyr Trp Asp Asn Ala Asn

335 340 345

Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Gin Val

350 355 360

Asp Tyr Ser Tyr Thr Ala Tyr Tyr Gly Phe Glu Lys Val Gly Tyr

365 370 375

Tyr Asn Pro Thr Asp Gly Thr Trp Thr lie Lys Val Val Ser Tyr

380 385 390

Ser Gly Ser Ala Asn Tyr Gin Val Asp Val Val Ser Asp Gly Ser

395 400 405

Leu Ser Gin Pro Gly Ser Ser Pro Ser Pro Gin Pro Glu Pro Thr

410 415 420

Val Asp Ala Lys Thr Phe Gin Xaa Ser Asp His Tyr Tyr Tyr Asp

425 430 435

Arg Ser Asp Thr Phe Thr Met Thr Val Asn Ser Gly Ala Thr Lys

440 445 450 lie Thr Gly Asp Leu Val Phe Asp Thr Ser Tyr His Asp Leu Asp

455 460 465

Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gin Lys Leu Val Asp Arg Ser Glu

470 475 480

Ser Pro Asn Ser Tyr Glu His Val Glu Tyr Leu Thr Pro Ala Pro

485 490 495

Gly Thr Trp Tyr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Tyr Thr Tyr Gly Trp

500 505 510

Ala Tyr Tyr Glu Leu Thr Ala Lys Val Tyr Tyr Gly

515 520 配列番号： 5 配列の長さ ： 4 7 6 5

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

起源： ピロコッカス 'フリォサス

株名 ： D S M 3 6 3 8

配列：

TTTAAATTAT AAGATATAAT CACTCCGAGT GATGAGTAAG ATACATCATT ACAGTCCCAA 60 AATGTTTATA ATTGGAACGC AGTGAATATA CAAAATGAAT ATAACCTCGG AGGTGACTGT 120 AGAATGAATA AGAAGGGACT TACTGTGCTA TTTATAGCGA TAATGCTCCT TTCAGTAGTT 180

CCAGTGCACT TTGTGTCCGC AGAAACACCA CCGGTTAGTT CAGAAAATTC AACAACTTCT 240

ATACTCCCTA ACCAACAAGT TGTGACAAAA GAAGTTTCAC AAGCGGCGCT TAATGCTATA 300

ATGAAAGGAC AACCCAACAT GGTTCTTATA ATCAAGACTA AGGAAGGCAA ACTTGAAGAG 360

GCAAAAACCG AGCTTGAAAA GCTAGGTGCA GAGATTCTTG ACGAAAATAG AGTTCTTAAC 420

ATGTTGCTAG TTAAGATTAA GCCTGAGAAA GTTAAAGAGC TCAACTATAT CTCATCTCTT 480

GAAAAAGCCT GGCTTAACAG AGAAGTTAAG CTTTCCCCTC CAATTGTCGA AAAGGACGTC 540

AAGACTAAGG AGCCCTCCCT AGAACCAAAA ATGTATAACA GCACCTGGGT AATTAATGCT 600

CTCCAGTTCA TCCAGGAATT TGGATATGAT GGTAGTGGTG TTGTTGTTGC AGTACTTGAC 660

ACGGGAGTTG ATCCGAACCA TCCTTTCTTG AGCATAACTC CAGATGGACG CAGGAAAATT 720

ATAGAATGGA AGGATTTTAC AGACGAGGGA TTCGTGGATA CATCATTCAG CTTTAGCAAG 780

GTTGTAAATG GGACTCTTAT AATTAACACA ACATTCCAAG TGGCCTCAGG TCTCACGCTG 840

AATGAATCGA CAGGACTTAT GGAATACGTT GTTAAGACTG TTTACGTGAG CAATGTGACC 900

ATTGGAAATA TCACTTCTGC TAATGGCATC TATCACTTCG GCCTGCTCCC AGAAAGATAC 960

TTCGACTTAA ACTTCGATGG TGATCAAGAG GACTTCTATC CTGTCHATT AGTTAACTCC 1020

ACTGGCAATG GTTATGACAT TGCATATGTG GATACTGACC TTGACTACGA CTTCACCGAC 1080

GAAGTTCCAC TTGGCCAGTA CAACGTTACT TATGATGTTG CTGTTTTTAG CTACTACTAC 1140

GGTCCTCTCA ACTACGTGCT TGCAGAAATA GATCCTAACG GAGAATATGC AGTATTTGGG 1200 S9一 9Z69/8S6 OM 01w0 vovl s1l §vlsvlvoool V1§011v V031

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o CO oo oo 73 CD CO CM

09

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0 S 0卜

09Z

0882 CTAATCCCCA TTGGCCTTGG AACCTACAAT GCGAGCGTTG AAAGCGTTGG TGATGGAGAG 2940

TTCTTCATAA AGGGCATTGA AGTTCCTGAA GGCACCGCAG AGTTGAAGAT TAGGATAGGC 3000

AACCCAAGTG TTCCGAATTC AGATCTAGAC TTGTACCTTT ATGACAGTAA AGGCAATTTA 3060

GTGGCCTTAG ATGGAAACCC AACAGCAGAA GAAGAGGTTG TAGTTGAGTA TCCTAAGCCT 3120

GGAGTTTATT CAATAGTAGT ACATGGTTAC AGCGTCAGGG ACGAAAATGG TAATCCAACG 3180

ACAACCACCT TTGACTTAGT TGTTCAAATG ACCCTTGATA ATGGAAACAT AAAGCTTGAC 3240

AAAGACTCGA TTATTCTTGG AAGCAATGAA AGCGTAGTTG TAACTGCAM CATAACAATT 3300

GATAGAGATC ATCCTACAGG AGTATACTCT GGTATCATAG AGATTAGAGA TAATGAGGTC 3360

TACCAGGATA CAAATACTTC AATTGCGAAA ATACCCATAA CTTTGGTAAT TGACAAGGCG 3420

GACTTTGCCG TTGGTCTCAC ACCAGCAGAG GGAGTACTTG GAGAGGCTAG AAATTACACT 3480

CTAATTGTAA AGCATGCCCT AACACTAGAG CCTGTGCCAA ATGCTACAGT GATTATAGGA 3540

AACTACACCT ACCTCACAGA CGAAAACGGT ACAGTGACAT TCACGTATGC TCCAACTAAG 3600

TTAGGCAGTG ATGAAATCAC AGTCATAGTT AAGAAAGAGA ACTTCAACAC ATTAGAGAAG 3660

ACCTTCCAAA TCACAGTATC AGAGCCTGAA ATAACTGAAG AGGACATAAA TGAGCCCAAG 3720

CTTGCAATGT CATCACCAGA AGCAAATGCT ACCATAGTAT CAGTTGAGAT GGAGAGTGAG 3780

GGTGGCGTTA AAAAGACAGT GACAGTGGAA ATAACTATAA ACGGAACCGC TAATGAGACT 3840

GCAACAATAG TGGTTCCTGT TCCTAAGAAG GCCGAAAACA TCGAGGTAAG TGGAGACCAC 3900

GTAATTTCCT ATAGTATAGA GGAAGGAGAG TACGCCAAGT ACGTTATAAT TACAGTGAAG 3960

TTTGCATCAC CTGTAACAGT AACTGTTACT TACACTATCT ATGCTGGCCC AAGAGTCTCA 4020

ATCTTGACAC TTAACTTCCT TGGCTACTCA TGGTACAGAC TATATTCACA GAAGTTTGAC 4080

GAATTGTACC AAAAGGCCCT TGAATTGGGA GTGGACAACG AGACATTAGC THAGCCCTC 4140

AGCTACCATG AAAAAGCCAA AGAGTACTAC GAAAAGGCCC TTGAGCTTAG CGAGGGTAAC 4200

ATAATCCAAT ACCTTGGAGA CATAAGACTA TTACCTCCAT TAAGACAGGC ATACATCAAT 4260

GAAATGAAGG CAGTTAAGAT ACTGGAAAAG GCCATAGAAG AATTAGAGGG TGAAGAGTAA 4320

TCTCCAATTT TTCCCACTTT TTCTTTTATA ACATTCCAAG CCTTTTCTTA GCTTCTTCGC 4380

TCATTCTATC AGGAGTCCAT GGAGGATCAA AGGTAAGTTC AACCTCCACA TCTCTTACTC 4440

CTGGGATTTC GAGTACTTTC TCCTCTACAG CTCTAAGAAG CCAGAGAGTT AAAGGACACC 4500

CAGGAGTTGT CATTGTCATC TTTATATATA CCGTTTTGTC AGGATTAATC THAGCTCAT 4560 AAATTAATCC AAGGTTTACA ACATCCATCC CAATTTCTGG GTCGATAACC TCCTTTAGCT 4620 TTTCCAGAAT CATTTCTTCA GTAATTTCAA GGTTCTCATC TTTGGTTTCT CTCACAAACC 4680 CAATTTCAAC CTGCCTGATA CCTTCTAACT CCCTAAGCTT GTTATATATC TCCAAAAGAG 4740

TGGCATCATC AATTTTCTCT TTAAA 4765 配列番号： 6

配列の長さ ： 1 3 9 8

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Asn Lys Lys Gly Leu Thr Val Leu Phe lie Ala lie Met Leu

5 10 15

Leu Ser Val Val Pro Val His Phe Val Ser Ala Glu Thr Pro Pro

20 25 30

Val Ser Ser Glu Asn Ser Thr Thr Ser lie Leu Pro Asn Gin Gin

35 40 45

Val Val Thr Lys Glu Val Ser Gin Ala Ala Leu Asn Ala lie Met

50 55 60

Lys Gly Gin Pro Asn Met Val Leu lie lie Lys Thr Lys Glu Gly

65 70 75

Lys Leu Glu Glu Ala Lys Thr Glu Leu Glu Lys Leu Gly Ala Glu

80 85 90

He Leu Asp Glu Asn Arg Val Leu Asn Met Leu Leu Val Lys lie

95 100 105

Lys Pro Glu Lys Val Lys Glu Leu Asn Tyr lie Ser Ser Leu Glu

110 115 120 9 οεε ε ο^ε

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335 340 345

Leu Ala Glu lie Asp Pro Asn Gly Glu Tyr Ala Val Phe Gly Trp

350 355 360

Asp Gly His Gly His Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Gly

365 370 375

Tyr Asp Ser Asn Asn Asp Ala Trp Asp Trp Leu Ser Met Tyr Ser

380 385 390

Gly Glu Trp Glu Val Phe Ser Arg Leu Tyr Gly Trp Asp Tyr Thr

395 400 405

Asn Val Thr Thr Asp Thr Val Gin Gly Val Ala Pro Gly Ala Gin

410 415 420 lie Met Ala lie Arg Val Leu Arg Ser Asp Gly Arg Gly Ser Met

425 430 435

Trp Asp lie He Glu Gly Met Thr Tyr Ala Ala Thr His Gly Ala

440 445 450

Asp Val lie Ser Met Ser Leu Gly Gly Asn Ala Pro Tyr Leu Asp

455 460 465

Gly Thr Asp Pro Glu Ser Val Ala Val Asp Glu Leu Thr Glu Lys

470 475 480

Tyr Gly Val Val Phe Val lie Ala Ala Gly Asn Glu Gly Pro Gly

485 490 495 lie Asn lie Val Gly Ser Pro Gly Val Ala Thr Lys Ala lie Thr

500 505 510

Val Gly Ala Ala Ala Val Pro lie Asn Val Gly Val Tyr Val Ser

515 520 525

Gin Ala Leu Gly Tyr Pro Asp Tyr Tyr Gly Phe Tyr Tyr Phe Pro

530 535 540 Ala Tyr Thr Asn Val Arg lie Ala Phe Phe Ser Ser Arg Gly Pro

545 550 555

Arg lie Asp Gly Glu lie Lys Pro Asn Val Val Ala Pro Gly Tyr

560 565 570

Gly lie Tyr Ser Ser Leu Pro Met Trp lie Gly Gly Ala Asp Phe

575 580 585

Met Ser Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ser Gly Val Val

590 595 600

Ala Leu Leu lie Ser Gly Ala Lys Ala Glu Gly lie Tyr Tyr Asn

605 610 615

Pro Asp lie lie Lys Lys Val Leu Glu Ser Gly Ala Thr Trp Leu

620 625 630

Glu Gly Asp Pro Tyr Thr Gly Gin Lys Tyr Thr Glu Leu Asp Gin

635 640 645

Gly His Gly Leu Val Asn Val Thr Lys Ser Trp Glu lie Leu Lys

650 655 660

Ala lie Asn Gly Thr Thr Leu Pro lie Val Asp His Trp Ala Asp

665 670 675

Lys Ser Tyr Ser Asp Phe Ala Glu Tyr Leu Gly Val Asp Val lie

680 685 690

Arg Gly Leu Tyr Ala Arg Asn Ser lie Pro Asp lie Val Glu Trp

695 700 705

His lie Lys Tyr Val Gly Asp Thr Glu Tyr Arg Thr Phe Glu lie

710 715 720

Tyr Ala Thr Glu Pro Trp lie Lys Pro Phe Val Ser Gly Ser Val

725 730 735 lie Leu Glu Asn Asn Thr Glu Phe Val Leu Arg Val Lys Tyr Asp

740 745 750 Val Glu Gly Leu Glu Pro Gly Leu Tyr Val Gly Arg lie lie lie 755 760 765

Asp Asp Pro Thr Thr Pro Val lie Glu Asp Glu lie Leu Asn Thr

770 775 780 lie Val lie Pro Glu Lys Phe Thr Pro Glu Asn Asn Tyr Thr Leu

785 790 795

Thr Trp Tyr Asp lie Asn Gly Pro Glu Met Val Thr His His Phe

800 805 810

Phe Thr Val Pro Glu Gly Val Asp Val Leu Tyr Ala Met Thr Thr

815 820 825

Tyr Trp Asp Tyr Gly Leu Tyr Arg Pro Asp Gly Met Phe Val Phe

830 835 840

Pro Tyr Gin Leu Asp Tyr Leu Pro Ala Ala Val Ser Asn Pro Met

845 850 855

Pro Gly Asn Trp Glu Leu Val Trp Thr Gly Phe Asn Phe Ala Pro

860 865 870

Leu Tyr Glu Ser Gly Phe Leu Val Arg lie Tyr Gly Val Glu lie

875 880 885

Thr Pro Ser Val Trp Tyr lie Asn Arg Thr Tyr し eu Asp Thr Asn

890 895 900

Thr Glu Phe Ser lie Glu Phe Asn lie Thr Asn lie Tyr Ala Pro

905 910 915 lie Asn Ala Thr Leu lie Pro lie Gly Leu Gly Thr Tyr Asn Ala

920 925 930

Ser Val Glu Ser Val Gly Asp Gly Glu Phe Phe lie Lys Gly lie

935 940 945

Glu Val Pro Glu Gly Thr Ala Glu Leu Lys lie Arg lie Gly Asn

950 955 960 Pro Ser Val Pro Asn Ser Asp Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Ser

965 970 975

Lys Gly Asn Leu Val Ala Leu Asp Gly Asn Pro Thr Ala Glu Glu

980 985 990

Glu Val Val Val Glu Tyr Pro Lys Pro Gly Val Tyr Ser lie Val

995 1000 1005

Val His Gly Tyr Ser Val Arg Asp Glu Asn Gly Asn Pro Thr Thr

1010 1015 1020

Thr Thr Phe Asp Leu Val Val Gin Met Thr Leu Asp Asn Gly Asn

1025 1030 1035 lie Lys Leu Asp Lys Asp Ser lie lie Leu Gly Ser Asn Glu Ser

1040 1045 1050

Val Val Val Thr Ala Asn lie Thr lie Asp Arg Asp His Pro Thr

1055 1060 1065

Gly Val Tyr Ser Gly lie lie Glu lie Arg Asp Asn Glu Val Tyr

1070 1075 1080

Gin Asp Thr Asn Thr Ser lie Ala Lys lie Pro lie Thr Leu Val

1085 1090 1095 lie Asp Lys Ala Asp Phe Ala Val Gly Leu Thr Pro Ala Glu Gly

1100 1105 1110

Val Leu Gly Glu Ala Arg Asn Tyr Thr Leu lie Val Lys His Ala

1115 1120 1125

Leu Thr Leu Glu Pro Val Pro Asn Ala Thr Val lie lie Gly Asn

1130 1135 1140

Tyr Thr Tyr Leu Thr Asp Glu Asn Gly Thr Val Thr Phe Thr Tyr

1145 1150 1155

Ala Pro Thr Lys Leu Gly Ser Asp Glu lie Thr Val lie Val Lys

1160 1165 1170 Lys Glu Asn Phe Asn Thr Leu Glu Lys Thr Phe Gin lie Thr Val

1175 1180 1185

Ser Glu Pro Glu lie Thr Glu Glu Asp lie Asn Glu Pro Lys Leu

1190 1195 1200

Ala Met Ser Ser Pro Glu Ala Asn Ala Thr lie Val Ser Val Glu

1205 1210 1215

Met Glu Ser Glu Gly Gly Val Lys Lys Thr Val Thr Val Glu lie

1220 1225 1230

Thr lie Asn Gly Thr Ala Asn Glu Thr Ala Thr lie Val Val Pro

1235 1240 1245

Val Pro Lys Lys Ala Glu Asn lie Glu Val Ser Gly Asp His Val

1250 1255 1260 lie Ser Tyr Ser lie Glu Glu Gly Glu Tyr Ala Lys Tyr Val lie

1265 1270 1275 lie Thr Val Lys Phe Ala Ser Pro Val Thr Val Thr Val Thr Tyr

1280 1285 1290

Thr lie Tyr Ala Gly Pro Arg Val Ser lie Leu Thr Leu Asn Phe

1295 1300 1305

Leu Gly Tyr Ser Trp Tyr Arg Leu Tyr Ser Gin Lys Phe Asp Glu

1310 1315 1320

Leu Tyr Gin Lys Ala Leu Glu Leu Gly Val Asp Asn Glu Thr Leu

1325 1330 1335

Ala Leu Ala Leu Ser Tyr His Glu Lys Ala Lys Glu Tyr Tyr Glu

1340 1345 1350

Lys Ala Leu Glu Leu Ser Glu Gly Asn lie lie Gin Tyr Leu Gly

1355 1360 1365

Asp lie Arg Leu Leu Pro Pro Leu Arg Gin Ala Tyr lie Asn Glu

1370 1375 1380 Met Lys Ala Val Lys lie Leu Glu Lys Ala lie Glu Glu Leu Glu 1385 1390 1395

Gly Glu Glu 配列番号： 7

配列の長さ ： 3 5

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

GGWWSDRRTG TTRRHGTHGC DGTDMTYGAC ACBGG 35 配列番号： 8

配列の長さ ： 3 2

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

KSTCACGGAA CTCACGTDGC BGGHACDGTT GC 32 配列番号： 9

配列の長さ ： 3 3

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA) 配列：

ASCMGCAACH GTKCCVGCHA CGTGAGTTCC GTG 33 配列番号： 1 0

配列の長さ ： 3 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

CHCCGSYVAC RTGBGGAGWD GCCATBGAVG TDCC 34 配列番号： 1 1

配列の長さ ： 1 9 7 7

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

起源：サーモコッカス ·セラー

株名 ： D S M 2 4 7 6

配列：

ATGAAGAGGT TAGGTGCTGT GGTGCTGGCA CTGGTGCTCG TGGGTCTTCT GGCCGGAACG 60 GCCCTTGCGG CACCCGTAAA ACCGGTTGTC AGGAACAACG CGGTTCAGCA GAAGAACTAC 120 GGACTGCTGA CCCCGGGACT GTTCAAGAAA GTCCAGAGGA TGAACTGGAA CCAGGAAGTG 180 GACACCGTCA TAATGTTCGG GAGCTACGGA GACAGGGACA GGGCGGTTAA GGTACTGAGG 240 CTCATGGGCG CCCAGGTCAA GTACTCCTAC AAGATAATCC CTGCTGTCGC GGTTAAAATA 300 AAGGCCAGGG ACCTTCTGCT GATCGCGGGC ATGATAGACA CGGGTTACTT CGGTAACACA 360 AGGGTCTCGG GCATAAAGTT CATACAGGAG GATTACAAGG TTCAGGTTGA CGACGCCACT 420 Z I ： 暴

Z 6T 0003V13 V1310D103D 00VV3I30V3 DV13V00D00 DID003VI33 V30V3V1330

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S9PZ0/S6dr/lDd 9Z69S/86 OAV 配列の長さ ： 6 5 9

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met し ys Arg Leu Gly Ala Val Val Leu Ala Leu Val Leu Val Gly

5 10 15

Leu Leu Ala Gly Thr Ala Leu Ala Ala Pro Val Lys Pro Val Val

20 25 30

Arg Asn Asn Ala Val Gin ij丄 n Lys Asn Tyr Gly Leu Leu Thr Pro

35 40 45

Gly Leu Phe Lys Lys Val Gin Arg Met Asn Trp Asn Gin Glu Val

50 55 60

Asp Thr Val lie Met Phe Gly Ser Tyr Gly Asp Arg Asp Arg Ala

65 70 75

Val Lys Val Leu Arg Leu Met Gly Ala Gin Val Lys Tyr Ser Tyr

80 85 90

Lys lie He Pro Ala Val Ala Val Lys lie Lys Ala Arg Asp Leu

95 100 105

Leu Leu lie Ala Gly Met lie Asp Thr Gly Tyr Phe Gly Asn Thr

110 115 120

Arg Val Ser Gly lie Lys Phe He Gin Glu Asp Tyr Lys Val Gin

125 130 135

Val Asp Asp Ala Thr Ser Val Ser Gin lie Gly Ala Asp Thr Val

140 145 150

Trp Asn Ser Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly Val Val Val Ala lie

155 160 165 Val Asp Thr Gly lie Asp Ala Asn His Pro Asp Leu Lys Gly Lys

170 175 180

Val lie Gly Trp Tyr Asp Ala Val Asn Gly Arg Ser Thr Pro Tyr

185 190 195

Asp Asp Gin Gly His Gly Thr His Val Ala Gly lie Val Ala Gly

200 205 210

Thr Gly Ser Val Asn Ser Gin Tyr lie Gly Val Ala Pro Gly Ala

215 220 225

Lys Leu Val Gly Val Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser

230 235 240

Val Ser Thr lie lie Ala Gly Val Asp Trp Val Val Gin Asn Lys

245 250 255

Asp Lys Tyr Gly lie Arg Val lie Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser

260 265 270

Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ser Leu Ser Gin Ala Val Asn Asn

275 280 285

Ala Trp Asp Ala Gly lie Val Val Cys Val Ala Ala Gly Asn Ser

290 295 300

Gly Pro Asn Thr Tyr Thr Val Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys

305 310 315

Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Ser Asn Asp Asn lie Ala Ser

320 325 330

Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu

335 340 345

Val Val Ala Pro Gly Val Asp lie lie Ala Pro Arg Ala Ser Gly

350 355 360

Thr Ser Met Gly Thr Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr Lys Ala Ser

365 370 375 Z9

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590 595 600

Leu Asp Leu Tyr Leu Tyr Asp Pro Asn Gly Asn Leu Val Asp Arg

605 610 615

Ser Thr Ser Ser Asn Ser Tyr Glu His Val biu Tyr Ala Asn Pro

620 625 630

Ala Pro Gly Thr Trp Thr Phe Leu Val Tyr Ala Tyr Ser Thr Tyr

635 640 645

Gly Trp Ala Asp Tyr Gin Leu し ys Ala Val Val Tyr Tyr Gly

650 655 配列番号： 1 3

配列の長さ ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

AGAGGGATCC ATGAAGGGGC TGAAAGCT 28 配列番号： 1 4

配列の長さ ： 2 8

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

AGAGGCATGC GCTCTAGACT CTGGGAGAGT 28 配列番号： 1 5

配列の長さ ： 1 9 6 2

配列の型：核酸

鎖の数：二本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類： Genomic DNA

起源： ピロコッカス ·フリオサス

株名 ： D S M 3 6 3 8

配列：

ATGAAGGGGC TGAAAGCTCT CATATTAGTG ATTTTAGTTC TAGGTTTGGT AGTAGGGAGC 60 GTAGCGGCAG CTCCAGAGAA GAAAGTTGAA CAAGTAAGAA ATGTTGAGAA GAACTATGGT 120 CTGCTAACGC CAGGACTGTT CAGAAAAATT CAAAAATTGA ATCCTAACGA GGAAATCAGC 180

ACAGTAATTG TATTTGAAAA CCATAGGGAA AAAGAAATTG CAGTAAGAGT TCTTGAGTTA 240

ATGGGTGCAA AAGTTAGGTA TGTGTACCAT ATTATACCCG CAATAGCTGC CGATCTTAAG 300

GTTAGAGACT TACTAGTCAT CTCAGGTTTA ACAGGGGGTA AAGCTAAGCT TTCAGGTGTT 360

AGGTTTATCC AGGAAGACTA CAAAGTTACA GTTTCAGCAG AATTAGAAGG ACTGGATGAG 420

TCTGCAGCTC AAGTTATGGC AACTTACGTT TGGAACTTGG GATATGATGG TTCTGGAATC 480

ACAATAGGAA TAATTGACAC TGGAATTGAC GCTTCTCATC CAGATCTCCA AGGAAAAGTA 540

ATTGGGTGGG TAGATTTTGT CAATGGTAGG AGTTATCCAT ACGATGACCA TGGACATGGA 600

ACTCATGTAG CTTCAATAGC AGCTGGTACT GGAGCAGCAA GTAATGGCAA GTACAAGGGA 660

ATGGCTCCAG GAGCTAAGCT GGCGGGAATT AAGGTTCTAG GTGCCGATGG TTCTGGAAGC 720

ATATCTACTA TAATTMGGG AGTTGAGTGG GCCGTTGATA ACAAAGATAA GTACGGAATT 780

AAGGTCATTA ATCTTTCTCT TGGTTCAAGC CAGAGCTCAG ATGGTACTGA CGCTCTAAGT 840

CAGGCTGTTA ATGCAGCGTG GGATGCTGGA TTAGTTGTTG TGGTTGCCGC TGGAAACAGT 900

GGACCTAACA AGTATACAAT CGGTTCTCCA GCAGCTGCAA GCAAAGTTAT TACAGTTGGA 960

GCCGTTGACA AGTATGATGT TATAACAAGC TTCTCAAGCA GAGGGCCAAC TGCAGACGGC 1020

AGGCTTAAGC CTGAGGTTGT TGCTCCAGGA AACTGGATAA TTGCTGCCAG AGCAAGTGGA 1080 ACTAGCATGG GTCAACCAAT TAATGACTAT TACACAGCAG CTCCTGGGAC ATCAATGGCA 1140

ACTCCTCACG TAGCTGGTAT TGCAGCCCTC TTGCTCCAAG CACACCCGAG CTGGACTCCA 1200

GACAAAGTAA AAACAGCCCT CATAGAAACT GCTGATATCG TAAAGCCAGA TGAAATAGCC 1260

GATATAGCCT ACGGTGCAGG TAGGGTTAAT GCATACAAGG CTATAAACTA CGATAACTAT 1320

GCAAAGCTAG TGTTCACTGG ATATGTTGCC AACAAAGGCA GCCAAACTCA CCAGTTCGTT 1380

ATTAGCGGAG CTTCGTTCGT AACTGCCACA TTATACTGGG ACAATGCCAA TAGCGACCTT 1440

GATCTTTACC TCTACGATCC CAATGGAAAC CAGGTTGACT ACTCTTACAC CGCCTACTAT 1500

GGATTCGAAA AGGTTGGTTA TTACAACCCA ACTGATGGAA CATGGACAAT TAAGGTTGTA 1560

AGCTACAGCG GAAGTGCAAA CTATCAAGTA GATGTGGTAA GTGATGGTTC CCTTTCACAG 1620

CCTGGAAGTT CACCATCTCC ACAACCAGAA CCAACAGTAG ACGCAAAGAC GTTCCAAGGA 1680

TCCGATCACT ACTACTATGA CAGGAGCGAC ACCTTTACAA TGACCGTTAA CTCTGGGGCT 1740

ACAAAGATTA CTGGAGACCT AGTGTTTGAC ACAAGCTACC ATGATCTTGA CCTTTACCTC 1800

TACGATCCTA ACCAGAAGCT TGTAGATAGA TCGGAGAGTC CCAACAGCTA CGAACACGTA 1860

GAATACTTAA CCCCCGCCCC AGGAACCTGG TACTTCCTAG TATATGCCTA CTACACTTAC 1920

GGTTGGGCTT ACTACGAGCT GACGGCTAAA GTTTATTATG GC 1962 配列番号： 1 6

配列の長さ ： 6 5 4

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Met Lys Gly Leu Lys Ala Leu lie Leu Val lie Leu Val Leu uly

5 10 15

Leu Val Val Gly Ser Val Ala Ala Ala Pro Glu Lys Lys Val Glu

20 25 30

Gin Val Arg Asn Val Glu Lys Asn Tyr Gly leu Leu Thr Pro Gly 35 40 45

Leu Phe Arg Lys lie Gin Lys Leu Asn Pro Asn Glu Glu lie Ser

50 55 60

Thr Val lie Val Phe Glu Asn His Arg Glu Lys Glu lie Ala Val

65 70 75

Arg Val Leu Glu Leu Met Gly Ala Lys Val Arg Tyr Val Tyr His

80 85 90 lie He Pro Ala lie Ala Ala Asp Leu Lys Val Arg Asp Leu Leu

95 100 105

Val lie Ser Gly Leu Thr Gly Gly Lys Ala Lys Leu Ser Gly Val

110 115 120

Arg Phe lie Gin Glu Asp Tyr Lys Val Thr Val Ser Ala Glu Leu

125 130 135

Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin Val Met Ala Thr Tyr Val

140 145 150

Trp Asn Leu Gly Tyr Asp Gly Ser Gly lie Thr lie Gly lie lie

155 160 165

Asp Thr Gly lie Asp Ala Ser His Pro Asp leu Gin Gly Lys Val

170 175 180 lie Gly Trp Val Asp Phe Val Asn Gly Arg Ser Tyr Pro Tyr Asp

185 190 195

Asp His Gly His Gly Thr His Val Ala Ser lie Ala Ala Gly Thr

200 205 210

Gly Ala Ala Ser Asn Gly Lys Tyr Lys Gly Met Ala Pro Gly Ala

215 220 225

Lys Leu Ala Gly lie Lys Val Leu Gly Ala Asp Gly Ser Gly Ser

230 235 240 lie Ser Thr lie lie Lys Gly Val Glu Trp Ala Val Asp Asn Lys 245 250 255

Asp Lys Tyr Gly lie Lys Val lie Asn Leu Ser Leu Gly Ser Ser

260 265 270

Gin Ser Ser Asp Gly Thr Asp Ala Leu Ser Gin Ala Val Asn Ala

275 280 285

Ala Trp Asp Ala Gly Leu Val Val Val Val Ala Ala Gly Asn Ser

290 295 300

Gly Pro Asn Lys Tyr Thr He Gly Ser Pro Ala Ala Ala Ser Lys

305 310 315

Val lie Thr Val Gly Ala Val Asp Lys Tyr Asp Val lie Thr Ser

320 325 330

Phe Ser Ser Arg Gly Pro Thr Ala Asp Gly Arg Leu Lys Pro Glu

335 340 345

Val Val Ala Pro Gly Asn Trp lie lie Ala Ala Arg Ala Ser Gly

350 355 360

Thr Ser Met Gly Gin Pro lie Asn Asp Tyr Tyr Thr Ala Ala Pro

365 370 375

Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly lie Ala Ala Leu

380 385 390 leu し eu Gin Ala His Pro Ser Trp Thr Pro Asp し ys Val Lys Thr

395 400 405

Ala Leu lie Glu Thr Ala Asp lie Val Lys Pro Asp Glu lie Ala

410 415 420

Asp lie Ala Tyr Gly Ala Gly Arg Val Asn Ala Tyr Lys Ala lie

425 430 435

Asn Tyr Asp Asn Tyr Ala Lys Leu Val Phe Thr Gly Tyr Val Ala

440 445 450

Asn Lys Gly Ser Gin Thr His Gin Phe Val lie Ser Gly Ala Ser 89

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99^ 09 SS

S9frrO/86df/XDd 9Z69S/86 O/W 配列番号： 1 7

配列の長さ ： 2 5

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

TCTGAATTCG TTCTTTTCTG TATGG 25 配列番号： 1 8

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

TGTACTGCTG GATCCGGCAG 20 配列番号： 1 9

配列の長さ ： 2 5

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

AGAGGCATGC GTATCCATCA GATTTTTGAG 30 配列番号： 2 0 配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

AGTGAACGGA TACTTGGAAC 20 配列番号： 2 1

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

GTTCCAAGTA TCCGTTCACT 20 配列番号： 2 2

配列の長さ ： 1 2

配列の型：アミノ酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：ぺプチド

配列：

Ala Glu Leu Glu Gly Leu Asp Glu Ser Ala Ala Gin

5 10 配列番号： 2 3 配列の長さ ： 2 4

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

TCATGGATCC ACCCTCTCCT TTTA 24 配列番号： 2 4

配列の長さ ： 2 6

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

GTCTGCGCAG GCTGCCGGAN NNNNNATGAA GGGGCTGAAA GCTCTC 26 配列番号： 2 5

配列の長さ ： 2 9

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

GAGAGCTTTC AGCCCCTTCA TNNNNNNTCC GGCAGCCTGC GCAGACATG 29

配列番号： 2 6

配列の長さ ： 2 7 配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

AGAGGGGGAT CCGTGAGAAG CAAAAAA 27 配列番号： 2 7

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

GATGACTAGT AAGTCTCTAA 20 配列番号： 2 8

配列の長さ ： 2 0

配列の型：核酸

鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

AAGCCTGAGG TTGTTGCTCC 20 配列番号： 2 9

配列の長さ ： 2 9

配列の型：核酸 鎖の数：一本鎖

トポロジー：直鎖状

配列の種類：他の核酸 （合成 DNA)

配列：

GGGCATGCTC ATGAACTTCC AGGCTGTGA 29

Claims

請 求 の 範 囲

1. 配列表の配列番号 4に示されるアミノ酸配列の C末端より 1以上のァ ミノ酸が欠失したアミノ酸配列からなり、 力つ耐熱性プロテアーゼ活性を有する プロテアーゼ。

2. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列からなる請求項 1記載の プロテアーゼ。

3. 配列表の配列番号 1に示されるアミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入もしくは付カ卩されたアミノ酸配列からなり、 かつ 耐熱性プ口テアーゼ活性を有するプロテアーゼ。

4. 配列表の配列番号 4に示されるアミノ酸配列の C末端より 1以上のァ ミノ酸が欠失したァミノ酸配列からなり、 力つ耐熱性プロテアーゼ活性を有する タンパク質をコードする遺伝子。

5. 配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列をコ一ドする請求項 4記 載のプロテアーゼ遺伝子。

6. 配列表の配列番号 2に示される塩基配列からなる請求項 5記載のプロ テア一ゼ遺伝子。

7. 配列表の配列番号 1に示されるァミノ酸配列において 1もしくは数個 のアミノ酸が欠失、 置換、 挿入もしくは付カ卩されたアミノ酸配列からなり、 かつ 耐熱性プロテアーゼ活性を有するタンパクをコードするプロテアーゼ遺伝子。

8. 請求項 6記載のプロテアーゼ遺伝子とストリンジヱントな条件におい てハイブリダイズし、 かつ耐熱性プロテアーゼ活性を有するタンパクをコードす るプロテアーゼ遺伝子。

9. 式 I ：

S I G-A1 a-G l y-G l y-As n-PRO [I] [式中、 S I Gはサブチリシン由来のシグナルペプチドのアミノ酸配列を、 PR oは発現させようとするタンパクのアミノ酸配列をそれぞれ示す]

で表されるアミノ酸配列をコードする遺伝子。

10. S I Gが配列表の配列番号 3に示されるアミノ酸配列である請求項 9記載の遺伝子。

1 1. PROが超好熱菌由来の耐熱性プロテア一ゼのアミノ酸配列である 請求項 9記載の遺伝子。

12. PROがピロコッカス ' フリオサス （Pyrococcus furiosus)由来の プロテア一ゼのァミノ酸配列である請求項 1 1記載の遺伝子。

13. PROが請求項 1あるいは請求項 2に記載のプロテア一ゼのァミノ 酸配列を含有するものである請求項 1 2記載の遺伝子。

14. p S P〇 1 24、 p S P〇 124厶 Cから選択されるプラスミ ドに 含有されることを特徴とする請求項 1 3記載の遺伝子。

1 5. PROが請求項 2記載のプロテアーゼのアミノ酸配列を含むもので ある請求項 9記載の遺伝子。

16. 請求項 9〜 1 5いずれか 1項記載の遺伝子を導入したバチルス属 (Bacillus) 細菌を培養し、 該培養物から目的とするタンパクを採取する工程か らなることを特徴とするタンパクの製造方法。

17. バチルス属細菌がバチルス 'サブチリス （Bacillus subtil is) で ある請求項 16記載のタンパクの製造方法。

18. 請求項 9〜1 5いずれか 1項記載の遺伝子がプラスミ ドベクターに よつてバチルス属細菌に導入されている請求項 16記載のタンパクの製造方法。

19. p SP〇 124、 p S PO 124厶 Cから選択されるプラスミ ドが バチルス属細菌に導入されている請求項 18記載のタンパクの製造方法。

20. Bacillus subtilis DB 104/p SPO124厶 C F E RM P-l 6227を培養し、 該培養物から目的とするタンパクを採取する工程から なることを特徴とする請求項 19記載のタンパクの製造方法。

21. 請求項 9〜 15レ、ずれか 1項記載の遺伝子が挿入されているプラス ドへク々^ ~

22. p SP0124、 p SPOl 24ACから選択される請求項 21記 載のプラスミ ドベクター。