FI112668B - Bacillus-promoottori, joka on peräisin Bacillus licheniformis x-amylaasipromoottorimuunnelmasta - Google Patents

Bacillus-promoottori, joka on peräisin Bacillus licheniformis x-amylaasipromoottorimuunnelmasta Download PDF

Info

Publication number
FI112668B
FI112668B FI942228A FI942228A FI112668B FI 112668 B FI112668 B FI 112668B FI 942228 A FI942228 A FI 942228A FI 942228 A FI942228 A FI 942228A FI 112668 B FI112668 B FI 112668B
Authority
FI
Finland
Prior art keywords
bacillus
promoter
sequence
eller
gene
Prior art date
Application number
FI942228A
Other languages
English (en)
Swedish (sv)
Other versions
FI942228A0 (fi
FI942228A (fi
Inventor
Steen Troels Joergensen
Boerge Krag Diderichsen
Original Assignee
Novozymes As
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Novozymes As filed Critical Novozymes As
Publication of FI942228A0 publication Critical patent/FI942228A0/fi
Publication of FI942228A publication Critical patent/FI942228A/fi
Application granted granted Critical
Publication of FI112668B publication Critical patent/FI112668B/fi

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/24—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2)
    • C12N9/2402—Hydrolases (3) acting on glycosyl compounds (3.2) hydrolysing O- and S- glycosyl compounds (3.2.1)
    • C12N9/2405—Glucanases
    • C12N9/2408—Glucanases acting on alpha -1,4-glucosidic bonds
    • C12N9/2411—Amylases
    • C12N9/2414—Alpha-amylase (3.2.1.1.)
    • C12N9/2417—Alpha-amylase (3.2.1.1.) from microbiological source
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C11—ANIMAL OR VEGETABLE OILS, FATS, FATTY SUBSTANCES OR WAXES; FATTY ACIDS THEREFROM; DETERGENTS; CANDLES
    • C11D—DETERGENT COMPOSITIONS; USE OF SINGLE SUBSTANCES AS DETERGENTS; SOAP OR SOAP-MAKING; RESIN SOAPS; RECOVERY OF GLYCEROL
    • C11D3/00—Other compounding ingredients of detergent compositions covered in group C11D1/00
    • C11D3/16—Organic compounds
    • C11D3/38—Products with no well-defined composition, e.g. natural products
    • C11D3/386—Preparations containing enzymes, e.g. protease or amylase
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora
    • C12N15/75—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora for Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/10—Transferases (2.)
    • C12N9/1048—Glycosyltransferases (2.4)
    • C12N9/1051—Hexosyltransferases (2.4.1)
    • C12N9/1074—Cyclomaltodextrin glucanotransferase (2.4.1.19)
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N9/00—Enzymes; Proenzymes; Compositions thereof; Processes for preparing, activating, inhibiting, separating or purifying enzymes
    • C12N9/14—Hydrolases (3)
    • C12N9/48—Hydrolases (3) acting on peptide bonds (3.4)
    • C12N9/50—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25)
    • C12N9/52—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea
    • C12N9/54—Proteinases, e.g. Endopeptidases (3.4.21-3.4.25) derived from bacteria or Archaea bacteria being Bacillus
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2319/00—Fusion polypeptide
    • C07K2319/01—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif
    • C07K2319/02—Fusion polypeptide containing a localisation/targetting motif containing a signal sequence

Landscapes

  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Oil, Petroleum & Natural Gas (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Chemical Kinetics & Catalysis (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Enzymes And Modification Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
  • Devices For Conveying Motion By Means Of Endless Flexible Members (AREA)

Description

112668
Bacillus-promoottori, joka on peräisin Bacillus lichenifor-mis x-amylaasipromoottorimuunnelmasta - Bacillus-promotor, som härstammar frän en Bacillus licheniformis x-amylaspromo-torvariant 5
Keksinnön ala Tämä keksintö koskee Bacillus licheniformis-promoottoria, DNA-konstruktiota, joka käsittää mainitun promoottorin, 10 isäntäsolua, joka on transformoitu mainitulla DNA-konstruk-tiolla, ja menetelmää proteiinin tuottamiseksi Bacilluksessa promoottorin avulla.
Keksinnön tausta 15 Erilaisia Bacillus licheniformis α-amylaasigeenin promootto-risekvenssejä on kuvattu aikaisemmin. Siten M. Sibakov ja I. Palva, Eur. J. Biochem. 145. 1984, s. 567-572, kuvaavat pro-moottorisekvenssin sisältävän Bacillus licheniformis a-amy-laasigeenin 5'-pään eristyksen ja määrityksen; T. Yuuki et 20 ai., J. Biochem. 98. 1985, s. 1147-1156, esittää Bacillus licheniformis α-amylaasigeenin täydellisen nukleotidisek-. venssin, mukaan lukien promoottorisekvenssin; ja B.M. Laoide et ai., J. Bacteriol. 171(5), 1989, s. 2435-2442, käsittelee kataboliittirepressiota Bacillus licheniformis a-amylaasi-: 25 geenillä alueelta geenin 5'-pään ympärillä ja esittävät '. ; tämän alueen sekvenssin.
Keksinnön yhteenveto
Keksinnön keksijät ovat yllättävällä tavalla keksineet, että 30 uusi promoottori, joka on homologinen aikaisemmin julkaistujen promoottorisekvenssien kanssa, aikaansaa proteiinin dramaattisesti kasvaneen saannon kun proteiinia koodittava geeni transkriboidaan promoottorista.
35 Niinpä tämä keksintö koskee Bacillus-promoottoria, joka käsittää
GCATGCGTCC TTCTTTGTGC TTGGAAGCAG AGCCCAATAT TATCCCGAAA
112668 2 CGATAAAACG GATGCTGAAG GAAGGAAACG AAGTCGGCAA CCATTCCTGG GACCCATCCG TTATTGACAA GGCTGTCAAA CGAAAAAGCG TATCAGGAGA TTAACGACAC GCAAGAAATG ATCGAAAAAA TCAGCGGACA CCTGCCTGTA CACTTGCGTC CTCCATACGG CGGGATCAAT GATTCCGTCC GCTCGCTTTC 5 CAATCTGAAG GTTTCATTGT GGGATGTTGA TCCGGAAGAT TGGAAGTACA AAAATAAGCA AAAGATTGTC AATCATGTCA TGAGCCATGC GGGAGACGGA AAAATCGTCT TAATGCACGA TATTTATGCA ACGTTCGCAG ATGCTGCTGA AGAGATTATT AAAAAGCTGA AAGCAAAAGG CTATCAATTG GTAACTGTAT CTCAGCTTGA AGAAGTGAAG AAGCAGAGAG GCTATTGAAT AAATGAGTAG 10 AAAGCGCCAT ATCGGCGCTT TTCTTTTGGA AGAAAATATA GGGAAAATGG TAINT TTGTTAA AAATTCGGAA TATTTATACA ATATCATN2N3N4 nWnVcATTG AAAGGGGAGG AGAATC (SEKVENSSI ID.NRO 1) jossa kukin NJ - N9 on A, T, C tai G, N‘ on C tai T, ja N2 on 15 A tai G edellyttäen, että N2 - Ns eivät yhdessä muodosta sekvenssiä ATGTTTCA tai GTGTTTCA, tai mainitun tässä määritellyn sekvenssin funktionaalinen homologi, jolla on ainakin 70-%:inen sekvenssi-identtisyys 20 edellä esitetyn sekvenssin kanssa, joka sekvenssi, verrattavissa olosuhteissa, edistää tehokkaammin transkiptiota . geenillä, jota se edeltää, kuin edellä esitetty promoottori- sekvenssi, jossa N1 on C tai T ja N2-N9 muodostavat yhdessä j sekvenssin ATGTTACA.
i 25 Ί Aikaisemmin julkaistuissa sekvensseissä N! on joko T (katso T. Yuuki et ai., yllä) tai C (B.M. Laoide et ai., yllä), kun '>/ I taas N2 - N9 on joko ATGTTTCA (T. Yuuki et ai., yllä, ja B.M.
Laoide et ai., yllä) tai GTGTTTCA (katso M. Sibakov, yllä). 30 Useissa julkaisuissa käsitellään Bacillus-geenien, mukaan lukien B. licheniformis α-amylaasigeenin kataboliit-tirepressiota. Siten julkaisuissa B.M. Laoide et ai, yllä, ja B.M. Laoide ja D.J. McConnell, J. Bacteriol. 171. 1989, s. 2443-2450, kartoitetaan cis-sekvenssit, jotka ovat vält-35 tämättömät amyL:n kataboliittirepression välitykselle B. subtiliksessa 108 emäsparin alueelle alavirtaan promoottorista ja ylävirtaan signaalisekvenssin katkaisukohdasta. He tunnistavat tällä alueella invertoidun toistosekvenssin, 112668 3 TGTTTCAC-20 bp-ATGAAACA, mutta mainitsevat, että deleetio tämän sekvenssin vasemmanpuoleiseen osaan joko poisti tai muutti ekspressiota kataboliittirepressioon vaikuttamatta.
He tunnistavat joukossa B. subtiliksen kataboliittirepres-5 soituja geenejä sekvenssejä, jotka ovat homologisia amyLrn vasemmanpuoleisen osan invertoidulle toistolle (5'-A/T T G T N A/T-3') transkription aloituskohtien ympärillä.
Y. Miwa ja Y. Fujita, Nucl. Acids Res. 18. s. 7049-7053, 10 rajoittavat B. subtilis cnt-operonin kataboliittirepressioon liittyvät cis-sekvenssit 11 emäsparin alueelle. Tämän 11 emäsparin alueella on 8 emäsparin sekvenssi, ATTGAAAG, jota kirjoittajat väittävät konsensussekvenssiksi, joka osallistuu kataboliittirepressioon Bacillus-suvussa, koska se ha-15 valttiin muissa kataboliittirepressoituvissa Bacillus-gee-neissä. Kiinnostavalla tavalla edellä esitetty B. licheni-formis α-amylaasigeenissä konsensussekvenssi seuraa välittömästi vasemmanpuoleista osaa Laoide et ai:in tunnistamasta invertoidusta toistosekvenssistä.
20
M.J. Weickert ja G.H. Chambliss, Proc. Natl. Acad. Sei. USA
, 87, s. 6238-6242, kuvaavat kataboliittirepressio-operaatto- risekvenssin paikkasuunnattua mutageneesiä B. subtiliksessa • amyE-geenistä. He huomioivat, että amylaasin liikatuotantoon » : 25 ja kataboliittirepressioon vaikuttivat molempiin mutaatiot : samalla alueella, ja toisinaan sama mutaatio. He keksivät, _ ’ että B. subtilis a-amylaasikataboliittirepressio-operaatto- : : rilla on merkittävä homologia muissa Bacillus-amylaasigeenin säätelyalueilla olevien sekvenssien ja muiden kataboliitti-30 repressoitujen geenien kanssa. Heidän tunnistama konsensus-sekvenssi sijaitsee asemasta +70 asemaan +64 suhteessa B. lieheniformis α-amylaasin transkription aloituskohtaan.
Ainakin yksi ryhmä on sitä mieltä, että sekvenssi N2 - N9 35 (keksinnön nomenklatuurin mukaan) muodostaa välttämättömän osan cis-sekvenssistä, jota vaaditaan kataboliittirepressioon, kun taas toinen ryhmä viittaa välittömästi viereiseen sekvenssiin. On mainitsemisen arvoista, että N2 - N9 muodos- 112668 4 tavat osan invertoidusta toistosekvenssistä. Näiden sekvenssien modifioinnit voisivat hyvin vaikuttaa amyL-promootto-rista saatuihin transkriptiotasoihin. Ei kuitenkaan voida jättää laskuista, että substituutiot muissa osissa promoot-5 torisekvenssiä kuten N^ssä voivat myös vaikuttaa promoottorista saatuihin transkriptiotasoihin.
Tässä yhteydessä käsite "funktionaalinen homologi" on tarkoitettu merkitsemään promoottorisekvenssiä, jolla on aina-10 kin 70-%:inen sekvenssi-identtisyys edellä esitetyn sekvenssin kanssa, joka sekvenssi, verrattavissa olosuhteissa, edistää tehokkaammin transkriptiota geenillä, jota se edeltää, kuin promoottori, jonka on kuvannut T. Yuuki et ai., yllä, tai B. Laoide et ai., yllä. Transkriptiotehokkuus 15 voidaan määrittää esimerkiksi mittaamalla suoraan mRNA-tran-skription määrä promoottorista, esimerkiksi "Northern blotting" -tekniikalla tai alukkeenjatkolla (primer extension), tai epäsuorasti mittaamalla promoottorista ekspressöidyn geenituotteen määrän. Käsitteeseen on tarkoitettu luettavak-20 si mukaan edellä esitetyn promoottorisekvenssin johdannaiset, kuten yhden tai usean nukleotidin insertio sekvenssiin, yhden tai usean nukleotidin lisääminen jompaan kumpaan sek-*] venssin päähän ja yhden tai usean nukleotidin deleetio sek- ! venssin jommassa kummassa päässä tai sisällä, edellyttäen, 25 etteivät sellaiset modifikaatiot heikennä sekvenssin pro-*, : moottorifunktiota. Edellä esitetyn sekvenssin fragmentit luetaan mukaan tähän funktionaalisen homologin määritelmään.
Keksinnön yksityiskohtainen kuvaus 30 Keksinnön mukainen promoottori voidaan johtaa sopivan Bacillus licheniformis-kannan genomista hybridisoimalla käyttäen oligonukleotidikoettimia, jotka perustuvat promoottorisek-venssiin, joka tunnetaan julkaisusta T. Yuuki et ai., yllä, tai B. Laoide et ai., yllä, standarditekniikoilla (katso 35 Sambrook et ai., Molecular Cloning: A Laboratory Manual,
Cold Spring Harbor, NY, 1989). Tunnettua promoottorisekvenssiä voi olla modifioitu yhteen tai useaan kohtaan paik-kasuunnatulla mutageneesillä hyvin tunnetuilla menettelyta 112668 5 voilla. Promoottorisekvenssi voi myös olla valmistettu synteettisesti vakiintuneilla standardimenetelmillä, esimerkiksi fosfoamidiittimenetelmällä, joka kuvataan julkaisussa S.L. Beaucage ja M.H. Caruthers, Tetrahedron Letters 22, 5 1981, s. 1859-1869, tai menetelmällä, joka kuvataan jul kaisussa Matthes et ai., EMBO J. 3, 1984, s. 801-805.
Esimerkkejä keksinnön mukaisista edullisista promoottoreista ovat ne, joissa N1 on C tai T; tai joissa N' on A, G tai C; 10 erityisesti ne, joissa N1 on C ja N7 on A. Siten N2 - N9 muodostavat edullisesti yhdessä sekvenssin ATGTTACA, kun taas N1 on edullisesti C.
Eräällä esimerkillä edellä esitetyn promoottorisekvenssin 15 sopivasta fragmentista on seuraava DNA-sekvenssi
CTATCAATTG GTAACTGTAT CTCAGCTTGA AGAAGTGAAG AAGCAGAGAG GCTATTGAAT AAATGAGTAG AAAGCGCCAT ATCGGCGCTT TTCTTTTGGA AGAAAATATA GGGAAAATGG TAN'TTGTTAA AAATTCGGAA TATTTATACA
2 0 atatcatn2n3n4 n5n6n7n8n9cattg aaaggggagg agaatc (SEKVENSSI ID.NRO 2) » jossa N1 - N9 ovat edellä esitetyt.
; 25 Eräässä edullisessa suoritusmuodossa keksinnön mukainen 6 promoottori on peräisin B. licheniformis-geenistä, ja eri tyisesti se on Bacillus licheniformis cx-amylaasipromoottorin muunnelma.
30 Eräässä toisessa näkökannassa keksintö koskee DNA-konstruk-tiota, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia, jota DNA-sekvenssiä edeltää edellä kuvattu promoottorisekvenssi. Kiinnostuksen kohteena oleva proteiini voi edullisesti olla entsyymi, esimer-35 kiksi α-amylaasi, syklodekstriiniglykosyylitransferääsi tai proteaasi. DNA-konstruktio voi edullisesti käsittää myös sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä varmistamaan kyseessä olevan proteiinin erittymisen kasvatusväliaineeseen 112668 6 DNA-konstruktiolla transformoitua solua kasvatettaessa.
Keksinnön mukaisesti, DNA-konstruktio voi olla läsnä autonomisesti replikoituneessa ekspressiovektorissa. Lisäksi vek-5 tori käsittää DNA-sekvenssin, joka mahdollistaa vektorin replikoitumisen isäntäsolussa. Esimerkkejä tällaisista sekvensseistä ovat replikaatioalut plasmideista pUC19 (C. Ya-nisch-Perron et ai., Gene 33, 1985, s. 103-119), pACYC177 (A.C.Y. Chang ja S.N. Cohen, J. Bacteriol. 134, 1978, s.
10 1141-1156), pUBllO (Gryczan et ai. 1978) tai pIJ702 (E. Katz et ai., J. Gen. Microbiol. 129, 1983, s. 2703-2714). Vektori voi myös käsittää valittavan markkerin, esimerkiksi geenin, jonka tuote antaa antibioottiresistenssin kuten ampisillii-ni-, kloramfenikoli- tai tetrasykliiniresistenssin, tai dal-15 geenit B. subtiliksesta tai B. licheniformis’ista (B. Dide-richsen, 1986). Menettelytavat kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia koodittavan DNA-sekvenssin liittämiseksi, promoottori ja replikaatioalku ovat ammattimisten hyvin tuntemia (katso esimerkiksi Sambrook et ai., Molecular Cloning: A 20 Laboratory Manual, Cold Spring Harbor, NY, 1989).
Vaihtoehtoisesti DNA-konstruktio voi olla läsnä isäntäsolun * kromosomissa. Tämä on usein etu, koska DNA-konstruktio pysyy : todennäköisemmin isäntäsolussa. DNA-konstruktion integrointi j 25 isäntäkromosomiin voidaan suorittaa tavanomaisilla menetel- ; millä, esimerkiksi homologisella rekombinaatiolla. Olisi ;* huomattava, että promoottorisekvenssi, kiinnostuksen kohtee na olevaa proteiinia koodittava DNA-sekvenssi ja mahdollisesti signaalisekvenssi voidaan tuoda isäntäsoluun erikseen. 30
Isäntäsolu voi sopivasti olla Bacillus-kanta, erityisesti Bacillus licheniformis-, Bacillus lentus-, Bacillus brevis-, Bacillus stearothermophilus-, Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus coagulans-, Bacillus thu-35 ringiensis- tai Bacillus subtilis-kanta.
Edelleen eräässä näkökannassa keksintö koskee menetelmää proteiinin tuottamiseksi Bacilluksissa, jossa menetelmässä 112668 7
Bacillus-isäntäsolua, joka on transformoitu keksinnön mukaisella DNA-konstruktiolla tai vektorilla, kasvatetaa olosuhteissa, jotka sallivat mainitun proteiinin tuotannon, ja otetaan tulokseksi saatu proteiini talteen viljelmästä.
5
Solujen kasvatukseen käytetty väliaine voi olla mitä hyvänsä tavanomaista väliainetta, joka soveltuu bakteerien kasvatukseen. Ekspressöidyn geenin tuote otetaan edullisesti talteen viljelmästä. Tuotteen talteenotto voidaan tehdä tavanomai-10 silla menettelytavoilla, joissa solut erotetaan väliaineesta sentrifugoimalla tai suodattamalla, saostetaan supernatantin tai filtraatin proteiinikomponentit suolan, esimerkiksi ammoniumsulfaatin avulla, minkä jälkeen seuraavat, mikäli välttämätöntä, erilaiset kromatografiset menettelytavat, 15 esimerkiksi ioninvaihtokromatografia, affiniteettikromato-grafia tai vastaava.
Keksintöä kuvataan edelleen seuraavassa esimerkissä viitaten oheisiin piirroksiin, joissa käytetään seuraavia lyhenteitä: 20 "pBR322" ilmaisee pBR322:sta johdetun DNA:n; "+ori pUBllO" ilmaisee pUBllO:n plus-replikaatioalun; "rep" ilmaisee pUB110:n rep-geenin; : "cat" ilmaisee pC194:n kloramfenikoliresistenssigeenin; 2 5 "cgtA" ilmaisee Thermoanaerobacter CGTaasi-geenin; : "PamyM" ilmaisee B. sterothermophiluksen maltogeenisen amy- • laasigeenin promoottorin (Diderichsen ja Christiansen, . 1988); "bla" ilmaisee pBR322:n ampisilliiniresistenssigeenin; 30 "pKK23 3-2" ilmaisee pKK2 3 3-2:sta johdetun DNA:n; "PamyL" ilmaisee B. licheniformis'in α-amylaasigeenin promoottorin; . "PamyQ" ilmaisee B. amyloliquefaciens'in a-amylaasigeenin ; promoottorin; 35 "amyL-cgtA" ilmaisee fuusiogeenin, joka käsittää B. licheni-formis'in α-amylaasigeenin signaalipeptidiä koodattavan osan ja Thermoanaerobacter CGTaasi-geenin osan, joka koodittaa kypsää entsyymiä; 112668 8 "erm" ilmaisee pEl94:n erytromysiiniresistenssigeenin; "ori pEl94" ilmaisee pE194:n plus-replikaatioalun, ja alueen, joka sisältää rep-geenin; ja "'amyL" ilmaisee DNA-fragmentin, joka ulottuu B. lichenifor-5 mis a-amylaasigeenin 3'-pään yli.
Kuvio 1 on plasmidin pNV601 restriktiokartta; kuvio 2 on plasmidin pPL1878 restriktiokartta; kuvio 3 on plasmidin pPLl419 restriktiokartta; 10 kuvio 4 on plasmidin pPLl489 restriktiokartta; kuvio 5 on plasmidin pPLl540 restriktiokartta; kuvio 6 on plasmidin pDN3000 restriktiokartta; kuvio 7 on plasmidin pPL1759 restriktiokartta; kuvio 8 on plasmidin pPLl892 restriktiokartta; 15 kuvio 9 on plasmidin pPLl796 restriktiokartta; kuvio 10 on plasmidin pBB37 restriktiokartta; kuvio 11 on plasmidin pPL1385 restriktiokartta; kuvio 12 on plasmidin pPLl893 restriktiokartta; kuvio 13 on plasmidin pSJllll restriktiokartta; 20 kuvio 14 on plasmidin pDN3060 restriktiokartta; kuvio 15 on plasmidin pSJl277 restriktiokartta; ! * kuvio 16 on plasmidin pSJ994 restriktiokartta; ; kuvio 17 on plasmidin pSJl283 restriktiokartta; * kuvio 18 on plasmidin pSJ1342 restriktiokartta; • * '· 25 kuvio 19 on plasmidin pSJ1359 restriktiokartta; kuvio 20 on plasmidin pPLl483 restriktiokartta; kuvio 21 on plasmidin pPLl487 restriktiokartta; kuvio 22 on plasmidin pSJ932 restriktiokartta; kuvio 23 on plasmidin pSJ948 restriktiokartta; 30 kuvio 24 on plasmidin pSJ980 restriktiokartta; kuvio 25 on plasmidin pSJl391 restriktiokartta; >· kuvio 26 on kaavamainen esitys kromosomaalisen a-amy-.. laasigeenin ja plasmidin pSJl391 sisältämän amyL-cgtA-fuu-* ’· siogeenin välisen vaihdon homologisella rekombinaatiolla; : 35 kuvio 27 on kaavamainen esitys cgtArn kypsien osien 5'-päi-;·.· den välisestä in vivo-rekombinaatiosta; ja ‘ ] kuvio 28 on plasmidin pSJl755 restriktiokartta.
112668 9
Keksintöä kuvataan edelleen seuraavilla esimerkeillä, joita ei ole millään lailla tarkoitettu rajoittamaan keksinnön vaadittua suoja-alaa.
5 Esimerkki
Yleiset menetelmät
Plasmidien konstruointiin käytetyt kokeelliset tekniikat olivat yhdistelmä-DNA-teknologian alan standarditekniikoita, katso T. Maniatis et ai., Molecular Cloning: A Laboratory 10 Manual, Cold Spring Harbor, New York, 1982.
Restriktioendonukleaasit ostettiin yhtiöistä New England Biolabs ja Boehringer Mannheim, ja niitä käytettiin valmistajan suosittelemalla tavalla. T4 DNA-ligaasi ostettiin 15 yhtiöstä New England Biolabs ja käytettiin valmistajan suosittelemalla tavalla.
Vektori-DNA:n valmistus kaikista kannoista suoritettiin menetelmällä, jonka on kuvannut Kieser, 1984.
20 , . E. colin transformointi: * · • · ;‘ E. coli-solut tehtiin kompetenteiksi ja transformoitiin • ‘ tavalla, jonka ovat kuvanneet Mandel ja Higa, 1970.
« · •'. 25 B. subtilis'in transformointi:
Kompetentit solut valmistettiin ja transformoitiin tavalla, « · ;'1 jonka on kuvannut Yasbin et ai., 1975.
B. licheniformis'in transformointi: 30 Plasmidit tuotiin B. licheniformis'iin polyetyleeniglykoli-välitteisellä protoplastitransformaatiolla tavalla, jonka on i ‘‘li kuvannut Akamatzu, 1984.
j ’« Joko E. colin, B. subtilis'in tai B. licheniformis'in CGTaa-35 siä tuottavat koloniat tunnistettiin siirrostamalla trans-formantteja LB-agarlevyille, joita oli täydennetty 1 %:lla liukoista tärkkelystä. Kun oli inkuboitu yön yli joko 37 112668 10 °C:ssa tai 30 °C:ssa levyt värjättiin jodihöyryllä CGTaasin tärkkelykseen kohdistuvan vaikutuksen tuottamien hydrolyy-sivyöhykkeiden osoittamiseksi.
5 Väliaineet BPX: Perunatärkkelys 100 g/1
Ohrajauhot 50 g/1 BAN 5000 SKB 0,1 g/1
Natriumkaseinaatti 10 g/1 10 Soijajauho 20 g/1
Na2HP04, 12 H20 9 g/1
Pluronic 0,1 g/1 LB-agar: Bacto-tryptoni 10 g/1 15 Bacto-hiivauute 5 g/1
NaCl 10 g/1
Bacto-agar 15 g/1 Säädetty NaOH:lla pH-arvoon 7,5 20 1. Thermoanaerobacter sp. CGTaasi-geenin kloonaus Bacillus ,·,· subtilis'iin i * I * E. coli-plasmidin pNV601 (kuvio 1) konstruointi, joka plas-I midi sisältää Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627 CGTaasi- t t ' geenin, jota kutsutaan jatkossa cgtA:ksi, kuvataan kansain- * 25 välisessä PCT-patenttijulkaisussa WO 89/03421. B. subtilis- i » . ί plasmid pPL1878 (kuvio 2), joka sisältää cgtA-geenm, kuva-*,· taan kansainvälisessä PCT-patenttijulkaisussa W0 91/09129.
Se konstruoitiin seuraavalla tavalla: 30 pNV601 sulatettiin osaksi Sau3A:lla, liitettiin sitten uu-; delleen ja transformoitiin E. coli SCSl:een (pakastettuja ,;* kompetentteja soluja, jotka ostettiin yhtiöstä Stratagene,
Ja Jolla, Kalifornia), valiten ampisilliiniresistenssin (200 ; ‘ pg/ml) suhteen. Yksi CGTaasi-positiivinen kolonia oli ,35 PL1419, joka sisältää pPLl419:n (kuvio 3). Plasmidi pPLl419 t t sulatettiin Sau3A:lla osaksi, ja fragmentit liitettiin BglII:lla sulatettuun pPLl489:ään (kuvio 4). Yksi CGTaasi- 112668 11 positiivinen, ampisilliiniresistentti (200 pg/ml) E. coli SCSl-transformantti sisälsi pPLl540:n (kuvio 5). pPL1489 johdettiin pKK233-2-plasmidista (ostettu yhtiöstä Pharmacia LKB Biotechnology) insertoimalla pKK233-2:een synteettisen 5 DNA-linkkerin PstI- ja Hindlll-kohtien väliin. Tämä linkkeri oli PstI-HindIII-fragmentti pDN3000:sta (kuvio 6; WO 91/09129, Diderichsen et ai., 1990). pPLl540 sulatettiin HaeII:lla ja Sphl:llä, ja 2,4 kiloemäksen fragmentti, joka sisälsi cgtA-geenin, insertoitiin Haell + SphI-sulatettuun 10 pDN1380-plasmidiin (Diderichsen ja Christiansen, 1988).
CGTaasi-positiivinen, kloramfenikoliresistentti (6 pg/ml) B. subtilis DNl885-transformantti (Diderichsen et ai., 1990) sisälsi pPLl878:n.
15 2. a-amylaasi/CGTaasi-fuusiogeenin konstruointi
Bacillus licheniformis'in a-amylaasigeenin, amyL, konstruointi, josta saadaan tulokseksi plasmidi pDNl981, kuvataan julkaisussa Jorgensen et ai., 1990.
20 Plasmidissa pPL1759 (kuvio 7) pDNl981:n Pstl/Hindlll-frag-mentti on korvattu Pstl/Hindlll-monilinkkerifragmentilla : : : pDN3000:sta (kuvio 6). Siinä on säilynyt amyL-promoottori ja suurin osa signaalipeptidiä koodittavasta sekvenssistä.
.·. :25 Plasmidi pPLl892 (kuvio 8) konstruoitiin insertoimalla : pPLl878:sta leikatun cgtA-geenin 2,4 kiloemäksen Sall/Notl- ’!!! fragmentissa Sali + Notl-sulatettuun pPL1759:ään, ja trans formoimalla DNl885:n kanamysiiniresistentiksi (10 pg/ml).
30 Plasmidi pPLl796 (kuvio 9) konstruoitiin insertoimalla 0,5 kiloemäksen SacI/EcoRV-fragmentin pBB37:stä (kuvio 10; Jor-gensen, P. et ai., 1991) Sacl + Smal-sulatettuun pPL1385:een : : (kuvio 11; Diderichsen et ai., 1990), ja transformoimalla DN1885:n kloramfenikoliresistentiksi (6 μg/ml).
;..:>5
Plasmidi pPL1893 (kuvio 12) konstruoitiin insertoimalla • *·' pPLl87 8:sta leikatun CGTaasi-geenin 2,4 kiloemäksen Bam- 112668 12 HI/Notl-fragmentissa BamHI + Notl-sulatettuun pPL1796:een, ja transformoimalla DNl885:n kloramfenikoliresistentiksi (6 ^g/ml).
5 In vivo-yhdistelmä-DNA-tekniikkaa (Jorgensen et al., 1990), jolla kaksi DNA-sekvenssiä, jotka sisälsivät saman plasmidin ja joissa on yhteinen homologinen alue, voidaan sulattaa yhteen homologisten alueiden välisellä rekombinaatiolla in vivo (katso kuviota 27), käytettiin konstruoimaan amyL- ja 10 cgtA-geenien välisen fuusion, jossa cgtA-signaalipeptidiä koodittava sekvenssi oli korvattu tarkasti amyL-geenin sig-naalipeptidiä koodattavalla sekvenssillä.
Tätä varten syntetisoitiin seuraava oligonukleotidilinkkeri 15 ja liitettiin Sali-sulatettuun pUCl9:ään (Yanish-Perron et ai., 1985), jolloin saatiin pSJllll (kuvio 13) transformoimalla E. coli SJ2:n (Diderichsen et ai., 1990) ja valitsemalla ampisilliiniresistenssin (200 μg/ml) suhteen: 20 amyL-signaalipeptidiä
koodittavan alueen 3'-pää : V: Sali Bell PstI
5' - TCGACTGATCACTTGCTGCCTCATTCTGCAGCAGCGGCG-: 3' - GAC T AGTGAAC G AC GGAGT AAGAC GTCGTCGCCGC- 25 . kypsää cgtA-proteiinia koodittavan *!*! alueen 5'-pää
Xbal Sali
30 GCACCGGATACTTCAGTTTCTCTAGAG
CGTGGCCTATGAAGTCAAAGAGATCTCAGCT 5' (SEKVENSSI ID.NRO 3) : : pC194:stä (Horinouchi ja Weisblum, 1982) johdettu kloram- fenikoliresistenssigeeni, cat, leikattiin pDN3060:stä (kuvio ‘,,,35 14; WO 91/09129) 1,1-ke BamHI/BglII-fragmenttina ja inser- *;·. toitiin BclI-sulatettuun pSJllll reen, jolloin saatiin j ‘: pSJ1277 (kuvio 15) transformoitaessa E. coli SJ 6:n (Dide- 13
1 λ o r. ί: o i \ L (j U O
richsen et ai., 1990) ja valitsemalla ampisilliini- (200 μς/ιηΐ) ja kloramfenikoliresistenssin (6 pg/ml) suhteen.
pSJ994 (kuvio 16) konstruoitiin liittämällä 0,6-ke Notl/-5 Ncol-fragmentin pPLl893:sta 5,4-ke Notl/NcoI-fragmenttiin pPLl892:sta, ja transformoimalla B. subtilis DN1885:een, valikoiden kanamysiiniresistenssin (10 pg/ml) suhteen.
pSJ1283 (kuvio 17) konstruoitiin liittämällä 1,1-ke Sall-10 fragmentin pSJl277:stä Sali-sulatettuun pSJ994:ään, ja transformoimalla DN1885:een, valikoiden kanamysiini- (10 pg/ml) ja kloramfenikoliresistenssin (6 pg/ml) suhteen.
pSJ1342 (kuvio 18) konstruoitiin poistamalla 1,1-ke Pstl-15 fragmentin pSJ1283:sta ja transformoimalla DNl885:een, valikoiden kanamysiiniresistenssin (10 pg/ml) suhteen.
pSJl359 (kuvio 19) konstruoitiin tosiasiallisella in vivo-rekombinaatiolla pSJl342:sta. CGTaasi-geenin kypsän osan 20 alun ja pSJl342:ssa Pstlin ja Sallin välissä olevan synteettisen oligonukleotidin osan välillä on homologiaa. Jos plas-midissa tapahtuu näiden kahden homologisen alueen välillä ; rekombinaatiotapahtuma, ainutlaatuiset Xbal-, Sali- ja Bam- ; HI-kohdat tuhoutuvat.
pSJ1342-erä, joka valmistettiin DN1885-siäntäkannasta, sula-tettiin läpikotaisin BamHIillä, Xbalillä ja Sällillä, ja ' sulatettu plasmidi transformoitiin suoraan (ts. liittämättä) kompetentteihin DN1885-soluihin, valiten kanamysiiniresis-30 tenssin (10 pq/ml) suhteen. Tämä menettelytapa enrikastaa voimakkaasti rekombinaatioplasmidien suhteen, koska linea-risoidut plasmidimonomeerit eivät voi transformoida kompe-tenttejä B. subtilis-soluja (Mottes et ai., 1979). Rekombi-,’ naatioplasmidit eivät katkeaisi restriktioentsyymeillä, ja •^35 siten esiintyvät siten monomeeristen ja oligomeeristen muo-"·' tojen seoksena, joka kykenee hyvin transformoimaan kompe- tenttejä B. subtilis-solu ja. Yksi näin saatu transf ormantti 11 o ^ o I I L. 0 0 u 14 sisälsi pSJ1359:n. Tämä plasmidi sisältää pUBllO:n replikaa-tioalun (Lacey ja Chopra, 1974, Gryczan et al., 1978, McKenzie et al., 1986), pUBllO Rep-proteiinigeenin, kanamysiini-resistenssigeenin ja B. licheniformis α-amylaasi (amyL)-pro-5 moottorin ja signaalipeptidiä koodittavan alueen fuusioituna täydellisesti DNA:hän, joka koodittaa Thermoanaerobacter sp. ATCC 53627:stä olevan CGTaasin kypsää osaa.
3. Kromosomaalisen integraatiovektorin konstruointi 10 1,4-ke BamHI-fragmentti, joka sisälsi pUBHO-kanamysiinire- sistenssigeenin ((kan), leikattiin plasmidista pDN2904 (WO 91/09129), liitettiin Bglll-sulatettuun pDN3000:een (kuvio 6), transformoitiin E. coli SCSlieen valikoiden ampisillii-niresistenssin (100 pg/ml) suhteen, ja pPLl483 (kuvio 20) 15 otettiin talteen yhdestä tällaisesta transformantista.
Sitten tämä plasmidi yhdistettiin Bacillus-vektorin kanssa, lämpötilaherkkä replikaatiota varten, plasmidi pEl94 (Ho-rinouchi ja Weisblum, 1982b). pPLl483 sulatettiin Accltllä, 20 pEl94 sulatettiin Clal:llä, nämä kaksi linearisoitua plasmi-dia sekoitettiin, liitettiin, ja transformoitiin B. subtilis : : : DNl885:een valiten kanamysiiniresistenssin (10 pg/ml) suh- teen 30 °C:ssa. Yksi tällainen transformantti sisälsi : pPLl487:n (kuvio 21).
25 ; amyL-geenin 3'-terminaalinen fragmentti leikattiin plasmi- dista pDNl528 (Jorgensen, S. et al., 1991) 0,7-ke Sall/Hin-dlll-fragmenttina, liitettiin Sall+Hindlll-sulatettuun pUC19:ään, ja transformoitiin E. coli SJ2:een, valikoiden 30 ampisilliiniresistenssin (200 μg/ml) suhteen. Yksi tällainen transformantti sisälsi pSJ932:n (kuvio 22).
: : Plasmidi pSJ948 (kuvio 23) saatiin insertoimalla Bglll-link- ' kerin Hindll-sulatettuun pSJ932:een, valikoiden jälleen am-‘,,.35 pisilliiniresistenssin (200 pg/ml) suhteen SJ2:n transfor-moinnin jälkeen.
15 1 12668 pSJ980 (kuvio 24) konstruoitiin liittämällä pPLl487:n 5,1-ke HindIII-fragmentin Hindlll-sulatettuun pSJ948:aan, valikoiden kanamysiiniresistenssin (10 pg/ml) suhteen B. subtilis DN1885:ssa 30 °C:ssa.
5
Lopulta konstruoitiin pSJ1391 (kuvio 25) liittämällä pSJ1359:n 4,0-ke BglII-fragmentin pSJ980:n 5,6-ke Bglll-fragmenttiin, valikoiden kanamysiiniresistenssin (10 pg/ml) suhteen DN1885:ssä 30 °C:ssa. Tämä plasmidi sisältää vekto-10 rissa, joka on lämpötilaherkkä replikaation suhteen ja antaa resistenssin kanamysiiniä ja erytromysiiniä vastaan, promoottorin ja ylävirran alueen (noin 0,4 ke) B. licheniformis α-amylaasigeenistä (amyL), a-amylaasi/CGTaasi-fuusiogeeni (amyL-cgtA), ja sitten noin 0,7 ke oc-amylaasigeenin 3'-alu-15 eelta ('amyL).
4. Fuusiogeenin siirtäminen B. licheniformis'iin ja kromosomiin integrointi a-amylaasia tuottava B. licheniformis-kanta transformoitiin 20 pSJ1391:llä protoplastitransformointimenettelytavalla (Aka-matzu, 1984). Eristettiin yksi regeneroituva, kanamysiini-resistentti kolonia, ja sen havaittiin tuottavan sekä a-,·. · amylaasia että CGTaasia. Näiden kahden entsyymin tuotanto ,. voidaan erottaa helposti erottamalla ravistelupulloviljelmi- ^ 25 en viljelmäsupernatantissa olevat proteiinit BPX-väliainees- sa (WO 91/09129) isoelektrinen fokusointi-geeleillä (esimer-kiksi Pharmacia Phast-järjestelmää käyttäen), minkä jälkeen ‘ seuraa päällystys agaroosigeelillä, joka sisältää 1 % liu koista tärkkelystä ja värjättiin seuraavaksi jodihöyryllä.
30 CGTaasi-aktiivisuus havaittiin kohdassa pl 4,5, a-amylaasi-aktiivisuus kohdassa pl 8.
;'·* Kun tästä transformantista analysoitiin sen plasmidipitoi- .‘ ’ suus, ilmeni, että sisääntulevan plasmidin ja kromosomin 35 välillä oli tapahtunut rekombinaatiota: Kaksinkertainen rekombinaatio oli vaihtanut kromosomaalisen a-amylaasi ; * : (amyL)-geenin ja plasmidiperäisen amyL-cgtA-fuusiogeenin 112668 16 niin, että eristetty plasmidi sisälsi amyL-geenin (tällä plasmidilla transformoitu B. subtilis DN1885 tuotti a-amy-laasia), kun taas amyL-cgtA-fuusiogeeni nyt sisältyi kromosomiin (kuvio 26).
5
Lisäämällä TY-väliaineessa (W0 91/09129) ilman kanamysiiniä eristettiin kantoja, jotka olivat menettäneet plasmidinsa spontaanisti (SJ1599, SJ1603-1607).
10 Alkuperäinen B. licheniformis-transformantti alistettiin myös koeolosuhteille plasmidin kromosomaalisen integraation ja seuraavan katkaisun varmistamiseksi rekombinaatiotapahtu-mien edistämiseksi. Transformantti siirrostettiin LB-agaril-le (WO 91/09129), jossa oli 10 μg/ml kanamysiiniä 50 °C, 15 yksittäisiä kolonioita siirrostettiin uudelleen muutamia kertoja 50 °C:ssa, ja sitten kutakin kasvatettiin peräkkäin yön yli TY-viljelmissä 30 °C:ssa ilman kanamysiiniä plasmidin katkeamisen ja menetyksen sallimiseksi. KanaB-isolaatte-ja kustakin alkuperäisestä 50 °C:ssa olevasta koloniasta 20 inkuboitiin BPX-ravistelupulloissa, ja määritettiin joko a-amylaasin tai CGTaasin tuotanto analyysillä isoelektrinen • · fokusointi-geeleillä kuten edellä. Kaikki analysoidut plas-midittomat kannat tuottivat joko CGTaasia tai a-amylaasia. CGTaasia tuottavia isolaatteja ovat esimerkiksi SJ1561 - 62, .25 1580 - 83, 1586 - 91 ja 1595.
• * I ·
Yksi kanta nimeltään SJ1608 ilmeni tuottavan CGTaasia suuremmat määrät kuin muut.
30 Kantojen SJ1561, 1562, 1599, 1606 ja 1608 "Southern blot" -analyysi varmisti, että näissä kannoissa on kromosomaalinen ,amyL-geeni korvattu amyL-cgtA-geenillä.
s t »
Seuraavat tulokset saatiin kvantisoimalla CGTaasi-aktiivi-•35 suuden, joka tuotettiin inkuboitaessa BPX-ravistelupulloissa '6 päivän ajan 37 °C:ssa (tulokset useista kokeista; vaihtelu V kantojen kunkin ryhmän sisällä johtui pääasiassa eri ravis- 17
1 Λ r < < O
I Luuu telupulloerien käytöstä):
Kanta CGTaasi-aktiivisuus, mielivaltaisia yksiköitä 5 SJ1561-62, 1580-83, 1586-91, 1595, 1599, 1603-07 1 - 7,5 SJ1608 200 275 10 5. Promoottorianalyysi
Olemme tutkineet johtuiko suuri ero CGTaasin tuotannossa kannan SJ1608 ja muiden kantojen välillä, jotka sisälsivät amyL-cgtA-geenin, amyL-promoottorista, joka oli vastuussa CGTaasi-ekspressiosta.
15 B. licheniformis-isäntäkannan amyL-promoottorisekvenssi esitetään SEKVENSSI ID.NRO 4:ssä.
Promoottorialue muutamista CGTaasia tuottavista B. licheni-20 formis-kannoista monistettiin kromosomaalisesta DNA:sta PCR-tekniikalla (Saiki et ai., 1988), käyttäen alukkeina yhtä V.: oligonukleotidia, joka vastaa asemia 204 - 233 lukien ala- :/· virtaan amyL-promoottorin kautta, ja toista oligonukleoti- dia, joka vastaa sekvenssiä 5'-päähän DNA:sta, joka koodit-;\25 taa kypsää CGTaasia ja lukien ylävirtaan. Tämän toisen oli-gonukleotidin sekvenssi oli 5'-CCTGTTGGATTATTACTGGG-3' (SEK-‘v VENSSI ID.NRO 5).
Monistettu DNA-fragmentti kustakin kannasta leikattiin aga-30 roosigeelistä ja sekvensöitiin suoraan käyttäen sekvensöin-tialukkeina dideoksimenetelmässä (Sanger et ai., 1977) samo-.ja oligonukleotideja, joita käytettiin PCR-monistukseen.
Sekvenssianalyysin tulokset paljastavat, että toinen tai •35 molemmat kahdesta pistemutaatiosta promoottorialueella ovat V. vastuussa havaitusta suuresta CGTaasi-tuotannon erosta.
18 1 1 o /: £ o I iiuuu
Kannoilla SJ1599 ja 1603-06, joilla on kaikilla alhainen saanto, on SEKVENSSI ID.NRO 4:ssä esitetty promoottorisek-venssi. Suurituottoinen kanta SJ1608 sisältää kuitenkin SEKVENSSI ID.NRO 6:ssa esitetyn promoottorisekvenssin.
5
Erot ovat asemassa 553, jossa SJ1608 sisältää T:n sijasta C:n, ja asemassa 593, jossa SJ1608 sisältää T:n sijasta A:n.
pSJl359:ssä ja pSJl391:ssä läsnä olevan amyL-promoottorin 10 sekvenssi määritettiin käyttäen PCR-monistusta ja edellä kuvattua sekvensöintimenettelytapaa. Tämä osoitti, että molemmat plasmidit sisältävät SEKVENSSI ID.NRO l:ssä esitetyn promoottorisekvenssin, ts. SJl608:n promoottorisekvenssin kanssa identtisen promoottorisekvenssin.
15 6. Analyysi promoottorin vaikutuksesta B. licheniformis a-amylaasigeeni amyL:n ekspressioon pSJl755 (kuvio 28) konstruoitiin liittämällä 3,3-ke Bglll/-Hindlll-fragmentti pDNl981:stä (katso esimerkkiä 2) 4,9-ke 20 Bglll/Hindlll-fragmenttiin pSJl391:stä (kuvio 25), valikoiden kanamysiiniresistenssin (10 pg/ml) suhteen DNl885:ssä 30 °C:ssa. Tämä plasmidi sisältää koko amyL-geenin, jossa on ί '·, SEKVENSSI ID.NRO 6:ssa esitetty promoottorisekvenssi (pro-moottori, joka esiintyy suurituottoisessa CGTaasi-kannassa ,25 SJ1608) vektorissa, joka on lämpötilaherkkä replikaation . | suhteen ja antaa resistenssin kanamysiiniä ja erytromysiiniä * « * * kohtaan.
i » a-amylaasia tuottava B. licheniformis-kanta, josta SJ1608 30 oli johdettu, sisälsi kloramfenikoliresistenssigeenin inser-toituna alkalinen proteaasi-geeniin, rikkoen täten tämän ! geenin ja tehden kannan alkalinen proteaasi-negatiiviseksi. Johdannaiskanta, SJ1707, on identtinen SJl608:n kanssa paitsi, että kloramfenikoliresistenssigeeni korvattiin noin 150 *35 emäsparin deleetiolla, mikä myös tekee kannan alkalinen proteaasi-negatiiviseksi.
19 11 n < < o I I /LUU u>
Plasmidi pSJl755 lisättiin kantaan SJ1707 protoplastitrans-formoinnilla, ja amyL-cgtA-fuusiogeenin korvaaminen amyL-geenillä saavutettiin integroinnilla/katkaisulla esimerkissä 4 kuvatulla tavalla.
5 a-amylaasin saantoja transformoidusta kannasta SJ1707, jossa amyL-geeniä edeltää promoottorisekvenssi, joka esitetään SEKVENSSI ID.NRO 6:ssa, verrattiin saantoon kannasta, josta SJ1608 oli johdettu ja jossa amyL-geeniä edeltää promootto-10 risekvenssi, joka esitetään SEKVENSSI ID.NRO 4:ssa.
Tulokset, jotka saatiin BPX-ravistelupulloviljelmistä, joita inkuboitiin 6 päivän ajan 37 °C:ssa.
15 amylaasi, mielival-
Promoottorisekvenssi täisiä yksiköitä SEKVENSSI ID.NRO 4 1 SEKVENSSI ID.NRO 6 105 20 Näistä tuloksista käy selvästi ilmi, että α-amylaasin saanto kasvaa paljon käytettäessä promoottorisekvenssiä, joka esi-·.: tetään SEKVENSSI ID.NRO 6:ssa.
„ „ Ί λ r~ r f n 20 1 I ^.0 00
Viitteet
Akamatzu, T., Sekiguchi, J. (1984). An improved method of protoplast regeneration for Bacillus species and its application to protoplast fusion and transformation. Agric. Biol. 5 Chem., 48, 651-655.
Diderichsen, Christiansen, L. (1988). Cloning of a maltogenic alpha-amylase from a Bacillus stearothermophilus. FEMS Microbiology Letters, 56, 53-60.
10
Jorgensen, P. L., Hansen, C. K., Poulsen, G. B., Diderichsen, B. (1990). In vivo genetic engineering: homologous recombination as a tool for plasmid construction. Gene 96, 37-41.
15
Diderichsen, B. teoksessa: Bacillus Molecular Genetics and Biotechnology Applications, A.T. Ganesan ja J.A. Hoch, toimittajat, Academic Press, 1986, s. 35-46.
20 Diderichsen, B., Wedsted, U., Hedegaard, L., Jensen, B. R., Sjoholm, C. (1990). Cloning of aldB, which encodes a-aceto-lactate decarboxylase, an exoenzyme from Bacillus brevis.
.·. : Journal of Bacteriology, 172, 4315-4321.
25*. Jorgensen, P. L., Poulsen, G. B. , Diderichsen, B. (1991).
‘ Cloning of a chromosomal α-amylase gene from Bacillus stea-·'· rothermophilus. FEMS Microbiology Letters, 77, 271-276.
Jorgensen, S., Skov, K. W., Diderichsen, B. (1991). Cloning, 30 sequence, and expression of a lipase gene from Pseudomonas cepacia: Lipase production in heterologous hosts requires ·;· two Pseudomonas genes. Journal of Bacteriology, 173, 559-567.
35” Horinouchi, S., Weisblum, B. (1982a). Nucleotide sequence and functional map of pC194, a plasmid that specifies chlo-JV; ramphenicol resistance. J. Bacteriol., 150, 815-825.
I 11. u υ u 21
Horinouchi, S., Weisblum, B. (1982b). Nucleotide sequence and functional map of pE194, a plasmid that specifies inducible resistance to macrolide, lincosamide, and streptogra-min type B antibiotics. J. Bacteriol. 150, 804-814.
5
Kieser, T. (1984). Factors affecting the isolation of CCC DNA from Streptomyces lividans and Escherichia coli. Plasmid 12, 19-36.
10 Mandel, A., Higa, A. (1970). J. Mol. Biol. 53, 159-162.
Mottes, M., Grandi, G., Sgaramella, V., Canosi, U., Morelli, G., Trautner, T. A. (1979). Different specific activities af monomeric and oligomeric forms of plasmid DNA in transforma-15 tion of Bacillus subtilis and Escherichia coli. Mol. Gen. Genet., 174, 281-286.
Lacey, Chopra, I. (1974). Genetic studies of a multiresis-tant strain of Staphylococcus aureus. J. Med. Microbiol., 7, 20 285-297.
McKenzie, T. , Hoshino, T., Tanaka, T., Sueoka, N. (1986).
: The nucleotide sequence of pUBHO: Some salient features in .·. : relation to replication and its regulation. Plasmid 15, 93- 2.5'. 103.
*;·; Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. (1977). DNA sequen-'’ cing with chain-terminating inhibitors. Proc. Natl. Acad.
Sci. USA, 74, 5463-5467.
30
Saiki, R. K., Gelfand, D. H., Stoffel, S., Scharf, S. J., ;· Higuchi, R., Horn, G. T., Mullis, K. B. , Erlich, H. A.
(1988). Primer-directed enzymatic amplification of DNA with a thermostable DNA polymerase. Science 239, 487-491.
Gryczan, T., Contente, S., Dubnau, D. (1978). Characterization of Staphylococcus aureus plasmids introduced by trans- 35 112668 22 formation into Bacillus subtilis. J. Bacteriol., 134, 318-329.
Yanish-Perron, C., Vieira, J., Messing, J. (1985). Improved 5 M13 phage cloning vectors and host strains: nucleotide se quences of the M13 mpl8 and pUC19 vectors. Gene 33, 103-119.
Yasbin, R. E., Williams, G. A., Young, F. E. (1975). J. Bacteriol. 121, 296-304.
10 t 112668 23 SEKVENSSILUETTELO (1) YLEISTÄ TIETOA: (i) HAKIJA:
(A) NIMI: Novo Nordisk A/S
(B) KATU: Novo Alle (C) KAUPUNKI: Bagsvaerd (E) MAA: Tanska (F) POSTINUMERO (ZIP): 2880 (G) PUHELIN: +45 4444 8888 (H) TELEFAX: +45 4449 3256 (I) TELEX: 37304 (ii) KEKSINNÖN NIMITYS: A Bacillus Promoter (iii) SEKVENSSIEN LUKUMÄÄRÄ: 6 (iv) TIETOKONEELLA LUETTAVA MUOTO: (A) VÄLINEEN MUOTO: disketti (B) TIETOKONE: IBM PC-yhteensopiva
(C) KÄYTTÖJÄRJESTELMÄ: PC-DOS/MS-DOS
(D) OHJELMISTO: Patentin Release #1.0, Version #1.25 .·, : (epo) ’· ‘ (2) SEKVENSSIN ID.NRO 1 TIEDOT: ' (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 616 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen ·· (D) TOPOLOGIA: lineaarinen ./ * (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genomic) (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: ·'·’· (A) ORGANISMI: Bacillus licheniformis 24 11 ^ ^ fx 9 I kuuv/ (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 1: GCATCOSTCC TTCTITCIGC TIGGAAGCAG AGCCCAATAT TATCCOGAAA CGAIAAAACG 60 GÄTGCIGAAG GAAGGAAACG AAGTCGGCAA CCATTCCIGG GAQ2CATCOG TTATIGACAA 120 GGCICTCAAA CGAAAAAGCG TATCAGGAGA TEAAOGACAC GCAAGAAATC ATOGAAAAAA 180 TCAGCGGACA CCTCCCIUIA CACITGCGTC CTCCAIAOGG CGGGATCAAT GA1TCCGTCC 240 GCTOGCmC CAATCTCAAG GTITCA1TCT GGGAIGTIGA TCOGGAAGAT TGGAACTACA 300 AAAATAAGCA AAAGAITCTC AATCATCTCA TGAGCCÄIGC GGGAGAOGGA AAAATOGTCT 360 TAAIGCAOGA TAITTATCCA AOGTTOGCAG ATCCIGCTGA AGÄGATTATT AAAAAGCIGA 420 AAGCAAAAGG CIATCAATTC GTEAACICTAT CTCAGCTIGA AGAAGTDGAAG AAGCAGAGAG 480 GCIATTCAAT AAATCAGEAG AAAGOGCCAT ATOGGCGCTT TTCmTCGA AGAAAAIAIA 540 GGGAAAATGG TANTTGTIAA AAATTCGGAA TAITIAIACA AIATCAINNN NNNNNCATIG 600 AAAGGGGAGG AGAATC 616 (2) SEKVENSSIN ID.NRO TIEDOT 2: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: ,·, t (A) PITUUS: 186 emäsparia ·, ; (B) TYYPPI: nukleiinihappo ! ' (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Bacillus licheniformis 112668 25 (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 2: CIATCAAITC GEAAC7IGTAT CTCAGCTTCA AGAAGTCAAG AAGCAGAGAG GCIATIGAAT 60 AAATCAGTAG AAAGCGCCAT ATOOGOGCIT ITCTTi'iGGA AGAAAAIATA GGGAAAATCG 120 TANITCTIAA AAATTCGGAA ΊΑΓΠΆΙΑΟΑ AIATCA1NNN NNNNNCATIG AAAGGGGAGG 180 .
AGAATC 186 (2) SEKVENSSIN ID.NRO TIEDOT 3: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 66 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: synteettinen (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 3: t * ···; (2) SEKVENSSIN ID.NRO TIEDOT 4: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 616 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) 112668 26 (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISM.!: Bacillus licheniformis (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 4: GCATCCCTCC numGTGC TIGGAAGCAG AGCCCAATAT TATCCOGAAA OGATAAAACG 60 GATCCIGAAG GAAGGAAAOG AAGTOGGCAA CCÄ1TCCIGG GACCCATCOG TIATIGACAA 120 GGCIUICAAA OGÄAAAAGCG TATCAGGAGA 1TAACGACAC GCAAGAAAIG ATOGAAAAAA 180 TCAGCCGACA CCTSCCIGTA CACTIGOCTC CTCCAIAOGG OGGGATCAAT GÄ1TCCCTCC 240 GCIXZGCTITC CAATCIGAAG GITTCATIUT GGGATUTTGA TCOGGAAGAT TGGAAGTACA 300 AAAATAAGCA AAAGAITCTC AATCATCTCA TGAGCCATGC GGGAGAOGGA AAAATCCTCT 360 TAATGCAOSA TAT1TATCCA AOGTTOGCAG AIGCIGCIGA AGAGATTATT AAAAAGCIGA 420 AAGCAAAAGG CTATCAATIG GIAACIGIAT CTCAGCTIGA AGAAGTGAAG AAGCAGAGAG 480 GCIATTCAAT AAATCACTAG AAAGOGCCAT ATOGGOGCIT ITLTITiGGA AGAAAATAIA S40 GGGAAAATCG TAITIGITAA AAATTOGGAA TATTEATACA ATATCATATG TTTCACATIG 600 AAAGGGGAGG AGAATC 616 (2) SEKVENSSIN ID.NRO TIEDOT 5: 4 f Λ* (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: •t (A) PITUUS: 20 emäsparia I (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen t (D) TOPOLOGIA: lineaarinen
(ii) MOLEKYYLITYYPPI: cDNA
(vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: : (A) ORGANISMI: synteettinen (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 5: CCTGTTGGAT TATTACTGGG 20 „ 112668 (2) SEKVENSSIN ID.NRO 6 TIEDOT: (i) SEKVENSSIN TUNTOMERKIT: (A) PITUUS: 616 emäsparia (B) TYYPPI: nukleiinihappo (C) JUOSTEISUUS: yksijuosteinen (D) TOPOLOGIA: lineaarinen (ii) MOLEKYYLITYYPPI: DNA (genominen) (vi) ALKUPERÄINEN LÄHDE: (A) ORGANISMI: Bacillus licheniformis (xi) SEKVENSSIKUVAUS: SEKVENSSI ID.NRO 6: GCATGOUTCC TTCTITGIGC TIGGAAGCAG AGCCCAATAT TATCCCGAAA OGATAAAAOG 60 GATCCIGAAG GAAGGAAAOS AAGTCGGCAA CCATTCCIGG GACCCATCCG TTATIGACAA 120 GGCIGTCAAA CGAAAAAGCG TATCAGGAGA TTAAOGACAC GCAAGAAATG ATOGAAAAAA 180 TCAGOSGACA CCIGCCIGIA CACTIGOSTC CTCCAIACGG CGGGATCAAT GATTCOGTCC 240 GCTCGCTITC CAATCIGAAG GITICATIGr GGGÄTCTTCA TCCGGAAGAT TGGAAGTACA 300 AAAAIAAGCA AAAGATIGTC AATCA1GTCA TGAGCCAIGC GGGAGACGGA AAAATOGTCT 360 • : TAATCCAOGA TAITIATGCA AOGTIOGCAG AIGCIGCIGA AGAGATTAIT AAAAAGCIGA 420 AAGCAAAAGG CEATCAATTG CTAACIGEAT CTCAGCTIGA AGAAGIGAAG AAGCAGAGAG 480 GCIATIGAAT AAATGAGIAG AAAGOGCCAT ATOSGOGCIT TTL'i'lTIGGA AGAAAATATA 540 : : GGGAAAA1GG TAC.TIU1TAA AAAITCGGAA TATITAIACA ATATGATAIG TTACACATIG 600 AAAGGGGAGG AGAATC 616

Claims (7)

28 112668
1. Bacillus-promoottori, joka käsittää: GCATGCGTCC TTCTTTGTGC TTGGAAGCAG AGCCCAATAT TATCCCGAAA 5 CGATAAAACG GATGCTGAAG GAAGGAAACG AAGTCGGCAA CCATTCCTGG GACCCATCCG TTATTGACAA GGCTGTCAAA CGAAAAAGCG TATCAGGAGA TTAACGACAC GCAAGAAATG ATCGAAAAAA TCAGCGGACA CCTGCCTGTA CACTTGCGTC CTCCATACGG CGGGATCAAT GATTCCGTCC GCTCGCTTTC CAATCTGAAG GTTTCATTGT GGGATGTTGA TCCGGAAGAT TGGAAGTACA 10 AAAATAAGCA AAAGATTGTC AATCATGTCA TGAGCCATGC GGGAGACGGA AAAATCGTCT TAATGCACGA TATTTATGCA ACGTTCGCAG ATGCTGCTGA AGAGATTATT AAAAAGCTGA AAGCAAAAGG CTATCAATTG GTAACTGTAT CTCAGCTTGA AGAAGTGAAG AAGCAGAGAG GCTATTGAAT AAATGAGTAG AAAGCGCCAT ATCGGCGCTT TTCTTTTGGA AGAAAATATA GGGAAAATGG 15 tan'ttgttaa aaattcggaa tatttataca atatcatn2n3n4 N5N6N7N8N9CATTG AAAGGGGAGG AGAATC (SEKVENSSI ID.NRO 1) jossa kukin N3 - N9 on A, T, C tai G; N1 on C tai T, ja N2 on A tai G edellyttäen, että N2 - N9 eivät yhdessä muodosta 20 sekvenssiä ATGTTTCA tai GTGTTTCA, tai mainitun, tässä määritellyn sekvenssin funktionaalinen I homologi, jolla on ainakin 70-%:inen sekvenssi-identtisyys • edellä esitetyn sekvenssin kanssa, joka sekvenssi, verrat- 25 tavissa olosuhteissa, edistää tehokkaammin transkriptiota geenillä, jota se edeltää, kuin edellä esitetty promoottori-: sekvenssi, jossa N1 on C tai T ja N2-N9 muodostavat yhdessä sekvenssin ATGTTACA.
2. Bacillus-promotor, som innehäller: 15 CTATCAATTG GTAACTGTAT CTCAGCTTGA AGAAGTGAAG AAGCAGAGAG GCTATTGAAT AAATGAGTAG AAAGCGCCAT ATCGGCGCTT TTCTTTTGGA AGAAAATATA GGGAAAATGG TACTTGTTAA AAATTCGGAA TATTTATACA ATATCATN2N3N4 N1N2N3N8N9CATTG AAAGGGGAGG AGAATC 20 (SEKVENS ID.NR 2) , i vilken respektive N3 - N9 är A, T, C eller G och N2 är A ·' eller G förutsatt att N2 - N9 tillsammans inte bildar “> sekvensen ATGTTTCA eller GTGTTTCA. : 25
2. Bacillus-promoottori, joka käsittää: : CTATCAATTG GTAACTGTAT CTCAGCTTGA AGAAGTGAAG AAGCAGAGAG GCTATTGAAT AAATGAGTAG AAAGCGCCAT ATCGGCGCTT TTCTTTTGGA AGAAAATATA GGGAAAATGG TACTTGTTAA AAATTCGGAA TATTTATACA 3 5 ATATCATNVn' NsN6N7N8N9CATTG AAAGGGGAGG AGAATC (SEKVENSSI ID.NRO 2) 112668 jossa kukin Ν' - N9 on A, T, C tai G ja N2 on A tai G edellyttäen, että N2 - N9 eivät muodosta yhdessä sekvenssiä ATGTTTCA tai GTGTTTCA.
3. Promotor enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e-tecknadav att N3 är A, G eller C.
3. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen promoottori, tun nettu siitä, että N7 on A, G tai C.
4. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen promoottori, tunnettu siitä, että N7 on A. 10
5. Patenttivaatimuksen 1 tai 2 mukainen promoottori, tunnettu siitä, että N2 - N9 muodostavat yhdessä sekvenssin ATGTTACA.
6. Minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 1-5 mukainen promoottori, tunnettu siitä, että se on peräisin Bacillus licheniformis-geenistä ja erityisesti se on Bacillus licheniformis α-amylaasipromoottorin variantti.
7. DNA-konstruktio, joka käsittää DNA-sekvenssin, joka koodittaa kiinnostuksen kohteena olevaa proteiinia, jota 1 edeltää minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 1-6 mukainen promoottorisekvenssi. : 25 8. Patenttivaatimuksen 7 mukainen DNA-konstruktio, tun nettu siitä, että kiinnostuksen kohteena oleva proteii-: ni on entsyymi kuten α-amylaasi, syklodekstriiniglykosyyli- transferääsi tai proteaasi.
9. Patenttivaatimuksen 7 tai 8 mukainen DNA-konstruktio, tunnettu siitä, että se käsittää lisäksi DNA-sekvenssin, joka koodittaa signaalipeptidiä.
10. Patenttivaatimuksen 9 mukainen DNA-konstruktio, 35 tunnettu siitä, että signaalipeptidi on B. licheni-formis α-amylaasisignaalipeptidi. 112668
11. Yhdistelmä-DNA-ekspressiovektori, joka käsittää minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 5-10 mukaisen DNA-konst-ruktion.
12. Isäntäsolu, joka on transformoitu minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 7-10 mukaisella DNA-konstruktiolla tai patenttivaatimuksen 11 mukaisella vektorilla.
13. Patenttivaatimuksen 12 mukainen isäntäsolu, t u n -10 n e t t u siitä, että se on Bacillus-kanta, erityisesti Bacillus licheniformis-, Bacillus lentus-, Bacillus brevis-, Bacillus stearothermophilus-, Bacillus alkalophilus-, Bacillus amyloliquefaciens-, Bacillus coagulans-, Bacillus thu-ringiensis- tai Bacillus subtilis -kanta. 15
14. Menetelmä proteiinin tuottamiseksi Bacilluksissa, tunnettu siitä, että Bacillus-isäntäsolua, joka on transformoitu minkä hyvänsä patenttivaatimuksista 7-10 mukaisella DNA-konstruktiolla, tai patenttivaatimuksen 11 20 mukaisella vektorilla, kasvatetaan olosuhteissa, jotka sallivat mainitun proteiinin tuotannon, ja otetaan tulokseksi , , saatu proteiini talteen viljelmästä. ; 25 1. Bacillus-promotor, som innehäller: : GCATGCGTCC TTCTTTGTGC TTGGAAGCAG AGCCCAATAT TATCCCGAAA CGATAAAACG GATGCTGAAG GAAGGAAACG AAGTCGGCAA CCATTCCTGG GACCCATCCG TTATTGACAA GGCTGTCAAA CGAAAAAGCG TATCAGGAGA
30 TTAACGACAC GCAAGAAATG ATCGAAAAAA TCAGCGGACA CCTGCCTGTA CACTTGCGTC CTCCATACGG CGGGATCAAT GATTCCGTCC GCTCGCTTTC CAATCTGAAG GTTTCATTGT GGGATGTTGA TCCGGAAGAT TGGAAGTACA AAAATAAGCA AAAGATTGTC AATCATGTCA TGAGCCATGC GGGAGACGGA : AAAATCGTCT TAATGCACGA TATTTATGCA ACGTTCGCAG ATGCTGCTGA
35 AGAGATTATT AAAAAGCTGA AAGCAAAAGG CTATCAATTG GTAACTGTAT ; CTCAGCTTGA AGAAGTGAAG AAGCAGAGAG GCTATTGAAT AAATGAGTAG AAAGCGCCAT ATCGGCGCTT TTCTTTTGGA AGAAAATATA GGGAAAATGG TAN1TTGTTAA AAATTCGGAA TATTTATACA ATATCATN2N3N4 112668 n1n2n3nVcattg AAAGGGGAGG AGAATC (SEKVENS ID.NR 1) i vilken respektive N3 - N9 är A, T, C eller G, N1 är C eller T, och N2 är A eller G förutsatt att N2 - N9 tillsammans inte 5 bildar sekvensen ATGTTTCA eller GTGTTTCA, eller en funktionell homolog av nämnda, här definierade sekvens som har en minst 70-%:ig sekvensidentitet med ovan anförda sekvens som, vid jämförbara förhällanden, 10 effektivare främjar transkription med den gen som den föregär än den ovan anförda promotorsekvensen, där N1 är C eller T och N2-N9 tillsammans bildar sekvensen ATGTTACA.
4. Promotor enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e- :, 30 tecknadav att N3 är A. Promotor enligt patentkrav 1 eller 2, k ä n n e -tecknadav att N2 - N9 tillsammans bildar sekvensen
FI942228A 1991-11-14 1994-05-13 Bacillus-promoottori, joka on peräisin Bacillus licheniformis x-amylaasipromoottorimuunnelmasta FI112668B (fi)

Applications Claiming Priority (4)

Application Number Priority Date Filing Date Title
DK9100343 1991-11-14
DK9100343 1991-11-14
PCT/DK1992/000338 WO1993010249A1 (en) 1991-11-14 1992-11-13 A bacillus promoter derived from a variant of a bacillus licheniformis x-amylase promoter
DK9200338 1992-11-13

Publications (3)

Publication Number Publication Date
FI942228A0 FI942228A0 (fi) 1994-05-13
FI942228A FI942228A (fi) 1994-07-13
FI112668B true FI112668B (fi) 2003-12-31

Family

ID=8153698

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
FI942228A FI112668B (fi) 1991-11-14 1994-05-13 Bacillus-promoottori, joka on peräisin Bacillus licheniformis x-amylaasipromoottorimuunnelmasta

Country Status (11)

Country Link
US (1) US5698415A (fi)
EP (1) EP0667910B1 (fi)
JP (1) JP3529774B2 (fi)
AT (1) ATE248223T1 (fi)
AU (1) AU661070B2 (fi)
CA (1) CA2123496C (fi)
DE (1) DE69233178T2 (fi)
DK (1) DK0667910T3 (fi)
FI (1) FI112668B (fi)
IL (1) IL103750A0 (fi)
WO (1) WO1993010249A1 (fi)

Families Citing this family (39)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US5955310A (en) * 1998-02-26 1999-09-21 Novo Nordisk Biotech, Inc. Methods for producing a polypeptide in a bacillus cell
US6300115B1 (en) 1998-05-18 2001-10-09 Enzyme Bio-Systems Ltd. Pullulanase expression constructs containing α-amylase promoter and leader sequences
AU2003214034A1 (en) 2002-04-10 2003-11-17 Novozymes A/S Bacillus licheniformis mutant host cell
AU2003214036A1 (en) 2002-04-10 2003-10-27 Novozymes A/S Bacillus licheniformis mutant host cell
WO2004101759A2 (en) 2003-05-12 2004-11-25 Genencor International, Inc. Novel lipolytic enzyme lip2
EP1625202A4 (en) 2003-05-12 2010-10-20 Genencor Int NEW LIPOLYTIC ENZYME LIP1
US20060236414A1 (en) 2003-06-19 2006-10-19 Novozymes A/S Proteases and methods for producing them
CA2563173A1 (en) * 2004-03-31 2005-10-20 Novozymes Biopolymer A/S Methods for producing hyaluronic acid in a bacillus cell
WO2005123915A1 (en) 2004-06-21 2005-12-29 Novozymes A/S Stably maintained multiple copies of at least two orf in the same orientation
DK2104739T3 (da) 2006-12-21 2013-10-07 Novozymes Inc Modificerede messenger-RNA-stabiliseringssekvenser til ekspression af gener i bakterieceller
EP2132316B1 (en) 2007-03-23 2015-03-18 Danisco US Inc. Enhanced amylase production by n-terminal addition to mature amylase protein
US7618801B2 (en) 2007-10-30 2009-11-17 Danison US Inc. Streptomyces protease
EP2257629B1 (en) 2008-03-28 2016-03-16 Danisco US Inc. Method for amplifying locus in bacterial cell
WO2010082619A1 (ja) 2009-01-16 2010-07-22 大塚化学株式会社 高発現プロモーターおよびこれを用いた遺伝子産物製造法
US20110306139A1 (en) 2009-02-27 2011-12-15 Novozymes A/S Mutant Cells Suitable For Recombinant Polypeptide Production
AR076941A1 (es) 2009-06-11 2011-07-20 Danisco Us Inc Cepa de bacillus para una mayor produccion de proteina
WO2011000924A1 (en) 2009-07-03 2011-01-06 Abbott Products Gmbh Spray-dried amylase, pharmaceutical preparations comprising the same and use
CN102762723A (zh) 2009-12-21 2012-10-31 诺维信股份有限公司 用于在巯基-二硫键氧还酶缺陷的细菌突变体细胞中产生异源多肽的方法
EP2689015B1 (en) 2011-03-23 2015-01-07 Novozymes A/S Methods for producing secreted polypeptides
CN106754833B (zh) * 2017-01-16 2020-06-09 广东溢多利生物科技股份有限公司 在枯草芽孢杆菌中高效表达普鲁兰酶的方法及重组枯草芽孢杆菌
CN111511908A (zh) 2017-11-10 2020-08-07 诺维信公司 温度敏感性cas9蛋白
US20210017544A1 (en) 2017-12-22 2021-01-21 Novozymes A/S Counter-Selection by Inhibition of Conditionally Essential Genes
CN114127256A (zh) 2019-02-20 2022-03-01 巴斯夫欧洲公司 用确定成分培养基和微量元素补料的芽孢杆菌工业发酵工艺
EP3927837A1 (en) 2019-02-20 2021-12-29 Basf Se Industrial fermentation process for bacillus using defined medium and magnesium feed
US20220275354A1 (en) 2019-05-15 2022-09-01 Novozymes A/S TEMPERATURE-SENSITIVE RNA- Guided Endonuclease
CN114207125A (zh) 2019-06-25 2022-03-18 诺维信公司 通过抑制条件性必需基因进行反向选择
WO2022018268A1 (en) 2020-07-24 2022-01-27 Basf Se Alanine racemase double deletion and transcomplementation
MX2023001273A (es) 2020-07-28 2023-03-03 Basf Se Proceso de fermentacion industrial para bacillus mediante el uso de cambio de velocidad de alimentacion.
KR20230042368A (ko) 2020-07-28 2023-03-28 바스프 에스이 온도 이동을 이용한 바실러스의 산업적 발효 방법
CA3186931A1 (en) 2020-07-28 2022-02-03 Andreas Daub Industrial fermentation process for bacillus using partial harvest
EP4217366A1 (en) 2020-09-22 2023-08-02 Basf Se Method for recovering a protein from a fermentation broth comprising a high degree of lysed cells
US20240060110A1 (en) 2020-10-07 2024-02-22 Basf Se Bacillus cell with reduced lipase and/or esterase side activities
EP4263822A1 (en) 2020-12-15 2023-10-25 Novozymes A/S Mutated host cells with reduced cell motility
EP4359546A1 (en) 2021-06-24 2024-05-01 Basf Se Improved bacillus host cell with altered rema/remb protein
US20240318188A1 (en) 2021-06-24 2024-09-26 Basf Se Bacillus licheniformis host cell for production of a compound of interest with increased purity
US20240317820A1 (en) 2021-06-24 2024-09-26 Basf Se Improved bacillus production host
EP4453218A1 (en) 2021-12-20 2024-10-30 Basf Se Method for improved production of intracellular proteins in bacillus
WO2024028338A1 (en) 2022-08-02 2024-02-08 Basf Se Stabilized protein production process using bacillus host cells
WO2024146919A1 (en) 2023-01-05 2024-07-11 Basf Se Use of foldases to improve heterologous expression of secreted molecules

Family Cites Families (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
US4769327A (en) * 1985-03-29 1988-09-06 Biotechnica International, Inc. Secretion vector

Also Published As

Publication number Publication date
EP0667910A1 (en) 1995-08-23
CA2123496A1 (en) 1993-05-27
AU661070B2 (en) 1995-07-13
AU2943092A (en) 1993-06-15
WO1993010249A1 (en) 1993-05-27
EP0667910B1 (en) 2003-08-27
CA2123496C (en) 2004-02-03
DE69233178T2 (de) 2004-06-17
IL103750A0 (en) 1993-04-04
DK0667910T3 (da) 2003-12-01
JPH07504085A (ja) 1995-05-11
DE69233178D1 (de) 2003-10-02
JP3529774B2 (ja) 2004-05-24
ATE248223T1 (de) 2003-09-15
FI942228A0 (fi) 1994-05-13
US5698415A (en) 1997-12-16
FI942228A (fi) 1994-07-13

Similar Documents

Publication Publication Date Title
FI112668B (fi) Bacillus-promoottori, joka on peräisin Bacillus licheniformis x-amylaasipromoottorimuunnelmasta
Jørgensen et al. Cloning, sequence, and expression of a lipase gene from Pseudomonas cepacia: lipase production in heterologous hosts requires two Pseudomonas genes
JP3162707B2 (ja) 細菌ゲノムにおけるｄｎａの安定な組込み
EP1297170B1 (en) Method for stable chromosomal multi-copy integration of genes
YUUKT et al. Complete nucleotide sequence of a gene coding for heat-and pH-stable α-amylase of Bacillus licheniformis: comparison of the amino acid sequences of three bacterial liquefying α-amylases deduced from the DNA sequences
Shimotsu et al. Modulation of Bacillus subtilis levansucrase gene expression by sucrose and regulation of the steady-state mRNA level by sacU and sacQ genes
Rygus et al. Catabolite repression of the xyl operon in Bacillus megaterium
LT4000B (en) Expression module, transformed host cell, process for preparing serine protease, method of transformation, dna sequence, plasmid, oligonucleotide
JPH0829091B2 (ja) ハイブリッドｐｍａ配列の製造方法及び該方法に使用するベクター
US5958728A (en) Methods for producing polypeptides in mutants of bacillus cells
JPH08504585A (ja) Ｄｎａ増幅
EP0487541B1 (en) Dna encoding a lipase and a lipase modulator
Guerrero et al. Directed mutagenesis of a regulatory palindromic sequence upstream from the Brevibacterium lactofermentum tryptophan operon
Oskam et al. The large Bacillus plasmid pTB19 contains two integrated rolling-circle plasmids carrying mobilization functions
US6100063A (en) Procaryotic cell comprising at least two copies of a gene
Iordanescu Specificity of the interactions between the Rep proteins and the origins of replication of Staphylococcus aureus plasmids pT181 and pC221
WO1993010248A1 (en) A PROCESS FOR EXPRESSING GENES IN $i(BACILLUS LICHENIFORMIS)
EP1062318B1 (en) A prokaryotic cell comprising two copies of a gene transcribed in different directions
Kitamoto et al. Cloning and sequencing of the gene encoding cyclodextrin glucanotransferase from Bacillus sp. KC201
US5264350A (en) DNA sequence performing a function which is expressed in an over-production of extracellular proteins by various strains of bacillus, and vectors containing this sequence
JP2000078981A (ja) Ｄｎａ断片
JPH0695940B2 (ja) 枯草菌およびその形成方法
FR2629097A1 (fr) Sequence d&#39;adn comprenant la partie fonctionnelle du locus sacu de b. subtilis, vecteurs contenant la sequence correspondante, et leur utilisation dans des procedes de production de proteines
FR2632320A2 (fr) Sequence d&#39;adn comprenant la partie fonctionnelle du locus sacu de b. subtilis, vecteurs contenant la sequence correspondante, et leur utilisation dans des procedes de production de proteines
FR2650292A1 (fr) Procede de production de proteine a partir de souches de bacillus subtilis et procede de preparation desdites souches

Legal Events

Date Code Title Description
MA Patent expired