DD277467A1 - Verfahren zur herstellung von extrazellulaeren enzymen, insbesondere von neutraler protease - Google Patents

Abstract

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung von extrazellulaeren Enzymen, insbesondere von neutraler Protease. Sie bezieht sich auf ein Verfahren, bei dem durch chromosomale Integration hochexprimierter Gene in einem Rezipientenstamm die Gendosis erhoeht wird und die dabei gebildeten Transformanten fuer die Fermentation verwendet werden koennen. Dazu werden rekombinante Plasmide mit dem Gen eines Enzyms in einen Rezipientenstamm transformiert, der das extrachromosomale, als Gendonor fungierende Plasmid segregativ instabil vererbt. Danach werden stabile Klone isoliert, die nur chromosomal integrierte Gene enthalten. Die Integration erfolgt einfach oder mehrfach durch Rekombination mit solchen Plasmiden, die das Gen gekoppelt mit homologen DNS-Fragmenten des Rezipientenstammes enthalten. Anstelle einer Antibiotika-Resistenz werden fuer die Selektion "food grade"-Merkmale verwendet. Fig. 1

Description

Hierzu 5 Seiten Zeichnungen

Anwendungsgebiet der Erfindung

Die Erfindung betrifft ein Verfahren zur Hersteilung von extrazellulären Enzymen, insbesondere von neutraler Protease, durch stabile Integration von hochexprimierten Genen dieser Enzyme in das Chromosom eines leistungsfähigen Rezipientenstammes von einem Mikroorganismus, vor allem eines bakteriellen Rezipientenstammes, zur Erhöhung der natürlich erreichbaren Gendosis und zur Verwendung der dabei gebildeten Transformanten für die Fermentation der Enzyme.

Charakteristik des bekannten Standes der Technik

Es ist bekannt, bakterielle Überproduktionsstämme für die Herstellung von Enzymen/1/; /2/ mittels gentechnischer Methoden/3/; /41; /5/; /6/ zu zuechten, was gezielte Änderungen des genetischen Materials ermöglicht und zu einer rationellen Züchtung führt; dabei können qualitativ veränderte Enzyme durch „enzyme engineering" hergestellt oder kann die Enzymproduktion rationeller gestaltet werden.

Um die Enzymproduktion zu steigern, wird ein hoch9xprimiertes Enzym-Gen durch In-vitro-Rekombination kloniert und emplifiziert und in einem geeigneten Rezipientenstamm zur Expression gebracht, so daß die angestrebte Überproduktion des Enzyms vor allem durch Gendosis-Etfekt erzielt wird. Wesentliche Voraussetzungen dafür sind eine hohe Expression des rekombinanten Enzym-Gens und eine hinreichende genetische Stabilität des für die Produktion bestimmten rekombinanten Bakterienstammes, die in komplexer Weise durch verschiedene endogene und exogene Faktoren bestimmt werden/7/; IBI; /9/. Hohe Anforderungen an die Stabilität eines solchen rekombinanten Überproduktionsstammes ergeben sich aus inhibierenden oder toxischen Wirkungen einer einseitig stark erhöhten Bildung von Gen-Produkten durch Störung der Balance des zellulären Metabolismus, die selektiv gegen den Überproduktionsstamm wirken können/10/.

Es ist branchenüblich, freie, autonom replizierende Plasmide zur Gen-Amplifikation in Überproduktionsstämmen anzuwenden. Die unzureichende segregative Stabilität dieser Plasmide hat sich bei der Fermentation aber allzu häufig als störend erwiesen, so daß eine Steigerung der Enzymproduktion nur selten erreicht werden konnte, wie es beispielsweise für beta-Glukanase/11 / und alpha-Amylase/12/ von Bacillus amyloliquefaciens nachgewiesen worden ist.

In diesen Fällen wurde eine hohe Stabilität der Plasmide ohne Antibiotika-Selektionsdruck sogar in Rezipientenstämmen von Bacillus amylolifquefaciens erreicht, in denen die chromosomale Homologie mit dem jeweiligen rekombinanten Enzym-Gen eigentlich eine strukturelle Destabilisierung der rekombinanten Plasmide durch generelle Rekombination erwarten läßt/13/; /14/. Dabei ist die Benutzung von Bacillus amyloliquefaciens durchaus von Vorteil, wiel die Bakterienstämme ihre homologen Produkt-Gene meist stärker exprimieren/15/ und außerdem Bacillus amyloliquefaciens wegen seiner natürlicherweise hohen genetischen Potenz zur Bildung von extrazellulären Enyzmen /16/; /17/ eine besonders hohe Expression rekombinanter Enzym-Gene zuläßt. Eine vergleichbare Expression kann derzeit mit Rezipientenstämmen von Bacillus subtilis 168, die bisher zumeist für gentechnische Manipulationen bei Bacillus verwendet werden, offenkundig nicht erwartet werden. Kann man auf den Selektionsdruck zur segregativen Stabilisierung von rekombinanten Plasmiden verzichten, so ist eine wesentliche Voraussetzung für die Fermentation erfüllt/18/.

Darüber hinaus ist os jodoch bei rekombinanten Überproduktionsstämmen für die Fermentation mehr und mehr erwünscht, nicht nur auf die Anwendung von Antibiotika, sondern auch auf den Einsatz von Antibiotika-Resistenz-Genen bis Selektionsmerkmale zu verzichten, um ihrer epidemiologischen Verbreitung vorzubeugen. Als geeigneter Ersatz werden stattdessen epidemiologisch unbedenkliche sogenannte „food grade"-Selektionsmerkmale ins Auge gefaßt/18/; /19/; ihre Anwendung unter Fermentations-Bedingungen steht derzeit noch aus.

Mehr Erfolg ist durch chromosomale Integration und Amplifikation der Enzym-Gene zu erwarten, weil sie dann als Bestandteil des bakteriollen Chromosoms stabil repliziert werden/9/. Für das hochexprimierte Gen der alpha-Amylase von Bacillus amylollqüefaciens ist das Verfahren mit positivem Ergebnis angewandt worden/20/. Einer hohen Ausbeute steht dabei aber gegenüber, daß die alpha-Amylase zeitlich verzögert gebildet wird; die oben beschriebenen Mängel hinsichtlich der Verwendung von Bacillus subtilis und von Antibiotika-Resistenzen sind ohnehin nicht beseitigt. Ferner kann eine hinreichende genetische Stabilität der Integrationsstämme bisher nicht nachgewiesen werden.

Für die industielle Herstellung von neutraler Protease sind Überproduktionsstämme, die alle dargelegten Anforderungen gleichzeitig erfüllen, bisher nicht bekennt geworden. So verwenden auch für neutrale Protease entwickelte Verfahren/21/; /22/, bei denen ein hochexprimiertes Gen für neutrale Protease auf einem Multikopien-Plasmid kloniert worden ist, Antibiotika-Resistenzen als Selektionsmerkmale, und die dabei benutzten Vektorplasmide lassen darauf schließen, daß Antibiotika unverzichtbar sind, um eine ausreichende Plasmidstabilität zu erzielen.

Ziel der Erfindung

Die Erfindung hat das Ziel, leistungsfähige Produktionsstämme für eine erhebliche Steigerung bei der Bildung extrazellulärer Enzyme, vor allem neutraler Protease zu entwickeln.

Darlegung des Wesens der Erfindung

Demzufolge hat sich die Erfindung die Aufgabe gestellt, ausgehend von den allseits bekannten Vorteilen der Gentechnik, die Nachteile des bekannten Standes der Technik zu beseitigen und einen Produktionsstamm durch gezielte gentechnische Manipulation herzustellen, der die Vorteile der schrittweisen Konstruktion eines gentechnisch erzeugten Überproduktionsstammes mit der beabsichtigten Verbesserung der Wirtschaftlichkeit der Enzym-Produktion und einer Verringerung des epidemiologischen Risikos bei seinem Einsatz in der Industrie verbindet.

Erfindungsgemäß wird die Aufgabe dadurch gelöst, daß rekombinante Plasmide mit dem Gen eines solchen Enzyms in einen Rezipientenstamm transformiert werden, der das extrachromosomale, als Gendonor fungierende Plasmid segregativ instabil vererbt, daß danach stabile Klone isoliert werden, die nur noch chromosomal integrierte Gene des Enzyms enthalten, wobei diese Integration singular oder auch mehrfach an verschiedenen Stellen des bakteriellen Chromosoms durch Rekombination nach schrittweiser Transformation mit solchen rekombinanten Plasmiden erfolgt, welche das Gen in Kopplung mit homologen DNS-Fragmenten des Rezipientenstammes enthalten, wobei diese DNS-Fragmente die Rekombination in entsprechend unterschiedliche homologe Orte des Chromosoms vermitteln und eine plasmidale, zur Selektion verwendete Antibiotika-Resistenz inaktiviert wird oder „food grade"-Merkmale für die Selektion verwendet werden, und daß der Rezipientenstamm für andere hochexprimierte extrazelluläre Enzyme vollständig oder weitgehend inaktiviert wird. Es ist vorteilhaft, wenn als Rezipientenstamm ein Stamm von Bacillus amyloliquefaciens verwendet und ein Gen von Bacillus, vor allem ein solches für neutrale Protease von Bacillus amyloliquefaciens, chromosomal integriert wird. Das Verfahren ist ferner dadurch gekennzeichnet, daß ein rekombinantes Plasmid pSB 176 und/oder pSB 183/23/ als Gendonor verwendet wird und die von einem solchen Plasmid kodierte Erythromyzin-Resistenz zur Selektion der Transformanten ausgenützt wird. Es ist besonders günstig, wenn das Plasmid pSB 176 in einen solchen erythromyzin-sensiblen Rezipientenstamm transformiert wird, daß die gebildeten Transformanten bei Langzeitkultivierung ohne Selektionsdruck eine hohe segregative Instabilität aufweisen, wenn ein Rezipientenstamm BE71/24/ verwendet wird, der segregativ instabile Transformanten BE71 (pSB 176) ergibt, und daß eine Transformante isoliert wird, die Erythromyzin-Resistenz mit hoher Ausbeute von neutraler Protease verbindet und diese Merkmale stabil vcrarbt, wobei chromosomale Integration von Plasmid-DNS bei Verlust des extrachromosomalen Plasmids als Ursache für Stabilität und erhöhte Bildung von neutraler Protease nachgewiesen wird. Es ist günstig, wenn die genannte Transformante einer mutagenen Behandlung unterzogen und dabei eine erste Mutante so gebildet wird, daß beta-Glukanase nicht mehr produziert wird, daß diese Mutante einer mutagenen Behandlung unterzogen und dabei eine zweite Mutante GSB164 so gebildet wird, daß alpha-Amylase stark reduziert und neutrale Protease mit erhöhter Ausbeute produziert wird, daß die zweite Mutante GSB164 einer weiteren mutagenen Behandlung unterzogen und dabei eine erythromyzin-sensible dritte Mutante gebildet wird, die als Rezipientenstamm für eine erneute, zweite chromosomale Integration des Gens für neutrale Protease und für die Fermentation verwendet wird, und daß schließlich eine stabile Transformante GSB182 bei Anwendung der dritten Mutante und des Plasmids pSB 183 isoliert wird, bei der eine zusätzliche chromosomale Integration des Gens für neutrale Protease und eine erhöhte Produktion von neutraler Protease nachgewiesen wird. Die chromosomale Integration kann vorteilhafterweise mehrmals co wiederholt werden, daß die plasmidale Erythromyzin-Resistenz der Transformanten schrittweise mutativ inaktiviert wird; die erythromyzin-jensiblen Mutanten werden für die Fermentation verwendet. Stattdessen ist es aber auch möglich, daß Thymidin-Prototrophie und Trimothoprim-Resistenz als Selektionsmerkmale bei der schrittweisen chromosomalen Integration des Gens für neutrale Protease genutzt werden. Endlich ist es auch denkbar, daß anstelle des Gens für neutrale Protease ein Gen für ein anderes Enzym chromosomal integriert und stark exprimiert wird und dabei der Rezipientenstamm ebenfalls für andere, nicht erwünschte hochexprimierte extrazelluläre Enzyme vollständig oder weitgehend inaktiviert und die plasmidale Antibiotika-Resistenz eliminiert wird.

Durch die Erfindung ist ein Verfahren entstanden, das die Nachteile des Standes der Technik überraschend einfach beseitigt. Es ist ein hoher Grad der Stabilität der Produktionsstämme erreichbar. Durch die wiederholte schrittweise chromosomale Integration des Gens für neutrale Protease wird die Gendosis und die Bildung der Protease allmählich und kontrollierbar erhöht und es können Produktionsstämme mit einem solchen Amplif iiierungsgrad des Gens für neutrale Protease ausgewählt werden, die in Abhängigkeit von der genetischen Potenz des Rezipientenstammos und den Fermentationsbedingungen bei hoher Bildung von neutralor Protease noch hinreichend stabiles Wachstum und genetische Stabilität zeigen. Die schrittweise mutative Inaktivierung der zur Selektion genutzten plasmidalen Erythromycin-Resistenz macht es möglich, daß Produktionsstämme ohne zusätzliche plasmidale Antibiotika-Resistenz bereitgestellt werden können und der Gefahr ihrer epidemiologischen Verbreitung vorgebeugt wird. Wegen der Nutzung der häufig vorkommenden ? egregativen Instabilität von freien, rekombinierten Plasmiden

für die Isolierung von Transformanten mit chromosomal integriertem Produkt-Gen ist es möglich, auf die aufwendige Isolierung eines Wirts-Vektor-Systems mit Defekt in der autonomen Replikation des Integrationsvektors zu verzichten. Durch die Erzeugung und Nutzung von neuartigen Integrationsvektoren läßt sich die Einführung von homologen DNS-Fragmenten - als Voraussetzung für die generelle Rekombination bei der ersten chromosomalen Integration - durch Insertionsinaktivierung nachweisen, und es wird durch eine enge Kopplung des inserierten DNS-Fragmentes mit dem Produkt-Gen eine hohe Häufigkeit ihrer gekoppelten chromosomalen Integration ermöglicht. Günstig ist die Nutzung von chromosomal integrierter Plasmid-DNS des Integrationsvektors als homologe DNS zu generellen Rekombination für nachfolgende chromosomale Integration des Produkt-Gens, bei denen derselbe oder ein stark homologer Integrationsvektor schrittweise für mehrere chromosomale Integration angewendet wird. Die Verwendung von Bacillus amyloliquefaciens als Rezipient mit bereits natürlicherweise hoher genetischer Potenz zur Bildung von extrazellulären Enzymen ermöglicht im.Vergleich zu anderen Arten von Bacillus eine extrem hohe Bildung eines arteigenen Enzyms und toleriert eine mutative Eliminierung oder starke Reduzierung in der Bildung von anderen extrazellulären Enzymen, so daß der Produktionsstamm in der Gesamt-Protein-Synthese zugunsten der Produktion des gewünschten Enzyms und seiner Stabilität entlastet wird und Bacillus amyloliquefaciens zugleich für die Gewinnung eines von anderen extrazellulären Enzymen freien Enzympräparates verwendet werden kann.

Dabei bietet die Nutzung einos bereits industriell genutzten Stammes von Bacillus amyloliquefaciens als Rezipientenstamm den Vorteil, daß er bereits an physiologische und technische Bedingungen des „scale up" bei großtechnischen Fermentationen adaptiert ist.

Werden anstelle von Antibiotika-Resistenzon nutritive „food grade"-Merkmale verwendet, so hat die Benutzung eines thy-Gens/25/ den besonderen Vorteil, daß sowohl ein aktives als auch ein inaktives Gen einen selektiven Phänotyp (Thymidin-Prototrophie bzw. Trimethoprim-Resistenz) kodiert und dadurch - im Vergleich mit anderen Genen - eine viel effektivere Selektion bei der schrittweisen chromosomalen Integration ermöglicht wird.

Endlich ist hervorzuheben, daß das erfindungsgemäße Verfahren ohne weiteres auch für andere hochexprimierte Gene, vor allem für solche für arteigene Gen-Produkte, genutzt werden kann, die bei massenhafter, einseitig erhöhter Produktion eine inhibierende Wirkung und damit einen selektiven Druck gegen hochproduzierende Transformanten zugunsten von niedrigproduzierenden Derivaten ausüben.

Ausführungsbeispiel

Die Erfindung wird nachstehend an Hand der Zeichnung an einem Ausführungsbeispiel näher erläutert. Es zeigen

Fig. 1: die Restriktionskarte für ein als Gendonor verwendetes Plasmid pSB 176, wobei das chromosomale BstEII-lnsert zur Insertionsaktivierung der Cm-Resistenz und ihr Insertionsort durch das externe BstEII-Fragment bzw. einen senkrechten Pfeil markiert sind,

Fig. 2: analog zu Fig. 1 die Restriktionskarte für ein als Gondonor verwendetes Plasmid pSB 183,

Fig.3: den Nachweis extrazellulärer Enzyme im Kulturüberstand durch SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophotese für verschiedene Stämme bei Probenahme nach 36 Stunden und Kultivierung in PM-Fermentermedium,

Fig.4: die Bildung von neutraler Protease durch Integrationsstämme GSB164 und GSB182 mit einfach beziehungsweise zweifach integriertem Gen für neutrale Protease im Vergleich zu dem bereits industriell genutzten, gentechnisch nicht manipulierten Rezipientenstamm BE71, einen Gendonorstamm ATCC23844 und einen Stamm Bacillus subtilis IA20 (pSB 176) mit freiem Plasmid pSB 176, und

Fig.5: die „Soulhern"-Hybridisierung zum Nachweis der chromosomalen Integration des Gens für neutrale Protease.

In der Zeichnung werden folgende Abkürzungen verwendet:

In Fig. 1 und 2: All = Asull; Bl = Bell; BGII = BgIII; BSII = BstEII; El = EcoRI; EV = EcoRV; Hill = Hindill; Pl = Pvul;PII = Pvull;SI = Sphl;MLS = Resistenz gegen Makrolid-, Lincomyzin- und Streptogramin-Antibiotika, (unter anderem gegen Erythromyzin); C, H, D, H', C und B'

bezeichneten Hindlll-Fragmente eines Vektorplasmids pDB 101. lr.Fig.3: 1 = ATCC23844;2 = IA20;3 = IA20(pSB176);4 = BE71;5 = GSB164;6 = GSB182;

A = alpha-Amylase; B = neutrale Protease; C = alkalische Protease. In Fig. 5: A = Chromosomale DNS und Kontroll-DNS nach Restriktase-Spaltung und nach

ge!elektrophoretischerTrennunginO,8-%-Agarose; B = Autoradiogramm nach Hybridisierung mit Bclllnsert mit dem Gen für neutrale Protease aus dem Plasmid pSB 92; 1 = BE71,Bcll;2 = GSB164, Bell; 3 = GSB182, Bell; 4 = pSB92,Bcll;5 = pSB 176, BstEII; 6 = pSB183, BstEII.

1. Erste chromosomale Integration

In einem anderen Vorschlag der Anmelderin/23/ werden hybride rekombinante Plasmide pSB 176 (Fig. 1) und pSB 183 (Fig.2) erwähnt, die ein hochexprimiertes Gen für neutrale Protease von Bacillus amyloliquofaciens - nachfolgend kurz nprA-Gen genannt - enthalten und durch eine hohe Kopienzahl sowie hohe Plasmid-Stabilität in verschiedenen Bacillus-Rozlpiontenstämmen und weitgehende DNS-Homologie zueinander charakterisiert sind. Ein industriell genutzter Rezipientenstamm von Bacillus amyloliquefaciens BE 71/24/ ist zwar durch die rekombinanten Plasmide transformierbar, unterscheidet sich jedoch von anderen Rezipientenstämmen durch eine hohe segregative Plasmid-Instabilität. Diese Instabilität äußert sich bei Plasmid-Transformanten BE71 (pSB 176) in binar Plasmid-Segregation >90% während nur 7 Generationen Wachstum in PM-Fermantermedium ohne Selektionsdruck.

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Überraschenderweise wird nach solcher Kultivierung von Transformanten BE71 (pSB 176) ein Stamm-Derivat mit der Bezeichnung GSB154 isoliert, das sowohl Erythromyzin-Resistenz - nachfolgend kurz mit Em^R bezeichnet - als auch eine um 75% erhöhte Bildung von neutraler Protease (Fig.4) stabil vererbt. Zugleich läßt sich kein freies Plasmid mehr nachweisen, auch wenn die Plasmid-lsolierung/26/ in unterschiedlicher Weise variiert wird.

Unter Berücksichtigung der Bedingungen zur Isolierung der Transformante GSB154 kann geschlußfolgert werden, daß das Plasmid pSB 176 oder Teile davon mit dem nprA-Gen und der plasmidalen Em³ in dem Rezipientenstamm BE71 chromosomal integriert worden sind durch

- die hohe Plasmid-Segrcga'.ion aus den Transformanten des Rezipientenstammes BE71, so daß Plasmide oder Teile davon durch chromosomale Integration stabil etabliert werden können,

- die spezifische Erhöhung der Bildung von neutraler Protease um 75%, korreliort mit der Em,

- die Selektion als Derivat nach Passagierung ohne Selektionsdruck, so daß die selektive Anreicherung von spontanen Emresistenten Mutanten unwahrscheinlich ist,

- die homologe chromosomale DNS des Gendonorstammes ATCC23844/16/ in der BstEII-Spaltstelle des Plasmids pSB 176 und in enger Kopplung zum nprA-Gen, die zur Initiation von genereller Rekombination führen kann, und

- die häufige Bildung vom Em-resistenten, plasmidfreien Derivaten von Transformanten des Rezipientenstammes BE71. Die Transformante GSB 154 übertrifft alle bisher/27/ isolierten Plasmid-Transformanten in der Bildung von neutraler Protease und auch in ihren Wachstums-Eigenschaften (kurze Verzögerungsphasen) bei der Kultivierung im PM-Fermentermedium. Bei der Transformante GSB154 wird die chromosomale Integration des Plasmids pSB 176 im Rezipientenstamm BE 71 durch „Southern"-Hybridisierjng (siehe 3.) bestätigt.

2. Eliminierung oder Reduzierung der Bildung anderer hochexprimlerter extrazellulärer Enzyme

Von einer wiederholten chromosomalen Integration des nprA-Gens gemäß 3. werden die Bildung von unerwünschten oder in hoher Konzentration nicht notwendigen extrazellulären Enzyme mutativ eliminiert bzw. reduziert; dadurch wird der Rezipientenstamm BE71 in seiner Gesamt-Protein-Synthese entlastet und die Herstellung eines reinen Protease-Präparates ermöglicht.

2.1. Mutative Eliminierung der Bildung von beta-Glukanase

Nach fachüblicher EMS-Behandlung (1 /8 M EMS; 10 bis 30% Überleben) der Transformante GSB154 wird eine Mutante GSB157 (hgl 14) isoliert, die auf NBY-Agar mit Zusatz von 1 % Lichenin als Enzymsubstrat nach Färbung mit Kongo ot (0,05% gelöst in destilliertem Wasser) keine Abbau-Aktivität zeigt. Gelelektrophoretisch (SDS-Polyacrylamid, 11 %)/27/ ist für diese Mutante auch kein verändertes, inaktives Enzymprotein nachweisbar, so daß demzufolge der Glukanasedefekt auf die Eliminierung der Enzymbildung zurückzuführen ist. In anderen Eigenschaften, besonders in der Bildung von neutraler Protease, ist die Mutante GSB157 gegenüber der Transformante GSB154 unverändert.

2.2. Mutative Reduzierung der Bildung von alpha-Amylase

Nach EMS-Behandlung (2.1.) und Plattierung auf NBY-Agar mit 1 % Maisan als Enzymsubstrat werden von der Mutante GSB157 acht Submutanten isoliert, deren Amylase-Aktivität unterschiedlich auf 10,1,0,1 oder 0,01 % des Ausgangs-Niveaus reduziert ist. Gelelektrophoretisch wird fürdiese Mutanten eine entsprechend schwächere Proteinbande nachgewiesen, so daß die reduzierte Amylase-Aktivität auf reduzierte Enzymbildung zurückgeführt werden kann. Die Reduzierung der Bildung der alpha-Amylase selbst auf 0,01 % - wirkt sich unter Labor-Bedingungen auch im PM-Fermentermedium nicht negativ auf die Bildung von neutraler Protease aus.

Für die weitere Bearbeitung wird eine Mutante GSB164 (amy 14) mit Reduzierung auf 4% Amylase-Bildung (Fig. 3) ausgewählt; sie bildet etwa 10% mehr neutrale Protease (Fig. 4) als der Ausgangsstamm.

3. Zweite chromosomale Integration

Als Ausgangsstamm wird dia Transformante GSB164 verwendet, bei der zunächst als Voraussetzung für die Selektion die plasmidale, chromosomal integrierte Em' mutativ inaktiviert wird. Dazu werden nach EMS-Behandlung (2.1.) und mittels Replikattechnik Em-sensible Mutanten isoliert und eine repräsentative Mutante GSB177 mit unverändert hoher Bildung von neutraler Protease für die weitere Bearbeitung ausgewählt.

Das Plasmid pSB 183 wird in die Mutante GSB177 transformiert, und mehrere, unabhängig isolierte Transformanten GSB177 (pSB 183) werden dann über 15 bis 30 Generationen in PM-Fermentermedium ohne Em-Selektionsdruck kultiviert. Dabei segregiert das Plasmid pSB 183 aus allen Transformanton mit vergleichbar hoher Rate wie das Plasmid pSB 1176 (siehe 1.), und zugleich wird eine hohe Rate der Stabilisierung mit Bezug auf die Em' beobachtet: schon bei Vereinzelungen nach Isolierung der Plasmid-Transformanten von Selektionsplatten treten bis 30% stabile Em-resistente Derivatre auf, in denen kein freies Plasmid mehr nachweisbar ist. Da die Mutante GSB177 keine erhöhte Häufigkeit (> 10~⁹) spontaner Em-Mutanten aufweist, kann diese hohe Häufigkeit stabiler Em'-Derivate von Transformanten GSB177 (pSB 183) nur durch chromosomale Plasmid-Integration erklärt werden.

Unter den stabilen Em'-Derivaten der Transformanten GSB177 (pSB 183) wird auf Grund eines größeren Verdauungshofes auf NBY-Milch-Platten die Transformante GSB182 ausgelesen, bei der gegenüber dem ursprünglichen Rezipientenstamm GSB177 eine um 30% erhöhte Bildung von neutraler Protease - Fig. 4 - nachgewiesen werden kann. Ebenso wie bei der Transformante GSB154 (siehe 1.) werden sowohl Em' als auch die erhöhte Bildung von neutraler Protease stabil vererbt, so daß auf eine gekoppelte chromosomale Integration beider Merkmale geschlossen werden kann.

4. Nachwels der chromosomalen Integration

Bei den Transformanten GSB164 und GSB182 wird diese chromosomale Integration des nprA-Gens mittels „Southern"-Hybridisierungsverfahren/3/ nachgewiesen. Mit unterschiedlichen Restriktasen gespaltene chromosomale DNS des Rezipientenstammes BE71 und der Transformanten GBS164 und GBS182 weiden mit unterschiedlich ρ. spaltenen radioaktiven Proben (Markierung mit ^32p-alpha-ATP/28/) der rekombinanten Plasmide pSB 176und pSB 183 hybridisiert, und aus dem Auftreten und dem Muster der Hybridisierungsbanden kann auf den Erfolg bzw. auf die Art der chromosomalen Integration der Plasmid-DNS geschlossen werden. Es werden Restriktasen für die Spaltung der chromosomalen DNS ausgewählt, die das nachzuweisende chromosomal integrierte DNS-Fragment nicht oder an möglichst wenigen Stellen spalten, so daß nur wenige

Hybridisierungsbanden erscheinen. Als radioaktive Proben werden vor allem selche isolierten DNS-Fragmente der Plasmide pSB92/23/, pSB 176 und pSB 183 markiert, die das nprA-Gen in einem möglichst kleinen DNS-Fragment enthalten (Bcll-Fragment als chromoi.omales Insert aus dem Plasmid pSB92 oder bei der chromosomalen Integration (BstEII-lnsert aus den Plasmiden pSB 176 oder pSB 183) und bei der Selektion von Derivaten mit chromosomal integriertem nprA-Gen (Hindlll-D-Fragment mit dem Em'-Gen aus den Plasmiden pSB176 oder pSB 183) wirksam sind. Aus den Hybridisierungsvarianten nach Tabelle 1 (Seite 17) erhält man folgende Ergebnisse:

- bei den Varianten A₁B, C und E werden im Vergleich zu dem Rezipientenstamm BE 71 für die Transformante GSB164 je eine zusätzliche Hybridisierungsbande und für die Transformante GSB182 je zwei zusätzliche Hybridisierungsbanden erhalten (Fig. 5), so daß für die Transformanten GSB164 bzw. GSB154 eine chromosomale Integration und für die Transformante GSB182 zwei chromosomale Integrationen des nprA-Gens nachgewiesen werden;

- bei den Varianten B und C wird in der Transformante GSB182 die zusätzliche Hybridisierungsbande aus der ersten chromosomalen Integration durch die zweite chromosomale Integration verändert, so daß demnach die zweite Integration in der Nachbarschaft der ersten erfolgt ist;

- bei den Varianten B und D führen die chromosomalen BstEII-lnserts aus den Plasmiden pSB 176 und pSB 183 zu identischen Hybridisierungsmustern, und beide DNS-Fragmente hybridisieren auch miteinander, so daß auf ihre Identität geschlossen wird;

- bei der Variante E sind in der Transformante GSB164 alle Hindlll-Fragmente des Plasmids pS3176 nachweisbar, so daß dieses Plasmid ohne feststellbare Größenänderung integriert worden ist. Die integrierte Plasmid-DNS des Plasmid pSB 176 kann eine nachfolgende Integration von anderen Plasmiden durch generelle Rekombination vermittele, sofern DNS-Homologie, wie bei dem Plasmid pSB 183, zum erstintegrierten Plasmid besteht.

Weitere Einzelheiten des Verfahrens sind in dem bereits genannten v/eiieren Vorschlag der Anmelderin/23/ ausführlich erörtert; auf eine wiederholte Darstellung wird verzichtet.

Tabelle 1

Chromosomale DNS aus Radioaktive

Variante BE71,GSB164,GSB182, Probe

jeweils gespalten mit

A	Bell	Isoliertes, chromosomales Bell- Insert mit nprA-Gen aus pSB92
B	Bell	Isoliertes, chromosomales BstEII- lnsert aus pSB 176 und pSB 183
C	Bell	Isoliertes Hindlll-D-Fragment mit Em'-Gen aus pSB 176 oder ' pSB183
D	BstEII	Isoliertes, chromosomales BstEII Insert aus pSB 176 und pSB 183

E Hindlil pSB176,HindlllundpSB183,

Hindill

Literatur

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/21/ EP-Paientanmeldung 133756.

/22/ EP-Patentanmoldung 149241.

/23/ DD-Potontonmoldung der Anmelderin (gleichzeitig mit dieser Anmeldung hinterlegt).

/24/ Hersteller: VEB Prowiko Schönebeck DD.

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Claims (16)

1. ' Patentansprüche:

   ' j 1. Verfahren zur Herstellung von extrazellulären Enzymen, insbesondere von neutraler Protease,

   durch stabile Integration von hochexprimierten Genen dieser Enzyme in das LhromoGom eines

   leistungsfähigen Rezipientenstammes von einem Mikroorganismus, vor allem eines bakteriellen Rezipientenstammes, zur Erhöhung der natürlich erreichbaren Gendosis und zur Verwendung der : dabei gebildeten Transformanten für die Fermentation der Enzyme, dadurch gekennzeichnet, daß

   - rekombinante Plasmide mit dem Gen eines solchen Enzyms in einen Rezipientenstamm transformiert werden, der das extrachromosomale, als Gendonor fungierende Plasmid segregativ instabil vererbt,

   - danach stabile Klone isoliert werden, die nur noch chromosome.! integrierte Gene des F.nzyms enthalten, wobei diese Integration singular oder auch mehrfach aί verschiedenen Stellen des bakteriellen Chromosoms durch Rekombination nach schrittweiserTransformation mit solchen rekombinanten Plasmiden erfolgt, welche das Gen in Kopplung mit homologen DNS-Fragmenten des Rezipientenstammes enthalten, wobei diese DNS-Fragmente die Rekombination in entsprechend unterschiedliche homologe Orte des Chromosoms vermitteln und eine plasmidale, zur Selektion verwendete Antibiotika-Resistenz inaktiviert wird oder „food grade"-Merkmale für die Selektion verwendet werden, und

   - der Rezipientenstamm für andere hochexprimierte extrazelluläre Enzyme vollständig oder weitgehend inaktiviert wird.
2. 2. Verfahren wird nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß als Rezipentenstamm ein Stamm, von Bacillus amyloliquefaciens verwendet wird.
3. 3. Verfahren nach Anspruch 1 und 2, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gen von Bacillus chromosomal integriert wird.
4. 4. Verfahren nach Anspruch 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß ein Gen für neutrale Protease von Bacillus amyloliquefaciene chromosomal integriert wird.
5. 5. Verfahren nach Anspruch 1 bis 4, dadurch gekennzeichnet, daß

   - ein rekombinates Plasmid pSB 176 und/oder pSB 183 als Gendonor verwendet wird und

   - die von einem solchen Plasmid kodierte Erythromyzin-Resistenz zur Selektion der Transformanten ausgenutzt wird.
6. 6. Verfahren nach Anspruch 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß das Plasmid pSB 176 in einen solchen er/thromyzin-sensiblen Rezipientenstamm transformiert wird, daß die gebildeten Transformanten bei Langzeitkultivierung ohne Selektionsdruck eine hohe segregative Instabilität aufweisen.
7. 7. Verfahren nach Anspruch 1 bis 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Rezipientenstamm BE71 verwendet wird, der segregativ instabile Transformanten BE71 (pSB 176) ergibt.
8. 8. Verfahren nach Anspruch 1 bis 7, dadurch gekennzeichnet, daß eine Transformante isoliert wird, die Erythromyzin-Resistenz mit hoher Ausbeute von neutraler Protease verbindet und diese Merkmale stabil vererbt.
9. 9. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß chromosomale Integration von Plasmid-DNS bei Verlust des extrachromosomalen Plasmids als Ursache für Stabilität und erhöhte Bildung von neutraler Protease nachgewiesen wird.
10. 10. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Transformante einer mutagenen Behandlung unterzogen und dabei eine erste Mutante so gebildet wird, daß beta-Glukanase nicht mehr produziert wird.
11. 11. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8 und 10, dadurch gekennzeichnet, daß die erste Mutante einer mutagenen Behandlung unterzogen und dabei oine zweite Mutante GSB164 {hinterlegt unter der Registriernummer IMET11330 bei der Hinterlegungsstelle Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena) so gebildet wird, daß alpha-Amylase stark reduziert und neutrale Protease mit erhöhter Ausbeute proouziert wird.
12. 12. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8,10 und 11, dadurch gekennzeichnet, daß die zweite Mutante GSB164 einer weiteren mutagenen Behandlung unterzogen und dabei eine erythromyzin-sensible dritte Mutante gebildet wird, die als Rezipientenstamm für eine erneute, zweite chromosomale Integration des Gens für neutrale Protease und für die Fermentation verwendet wird.
13. 13. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8 und 10 bis 12, dadurch gekennzeichnet, daß eine stabile Transformante GSB182 (hinterlegt unter der Registriernummer IMET11331 bei der Hinterlegungsstelle Zentralinstitut für Mikrobiologie und experimentelle Therapie Jena) bei Anwendung der dritten Mutante und des Plasmids pSB 183 isoliert wird, bei der eine zusätzliche chromosomale Integration des Gens für neutrale Protease und eine erhöhte Produktion von neutraler Protease nachgewiesen wird.
14. 14. Verfahren nach Anspruch 1 bis 8 und 10 bis 13, dadurch gekennzeichnet, daß

    - die chromosomale Integration mehrfach wiederholt wird, daß die plasmidale Erythromyzin-Resistenz der Transformaten schrittweise mutativ inaktiviert wird und

    - die erythromyzin-sensiblen Mutanten für die Fermentation verwendet werden.
15. 15. Verfahren nach Anspruch 1 bis 14, dadurch gekennzeichnet, daß Thymidin-Prototrophie und Trimethoprim-Resistenz als Selektionsmerkmale bei der schrittweisen chromosomalen Integration des Gens für neutrale Protease genutzt werden.
16. 16. Verfahren nach Anspruch 1 bis 15, dadurch gekennzeichnet, daß anstelle des Gens für neutrale Protease ein Gen für ein anderes Enzym chromosomal integriert und stark exprimiert wird und dabei der Rezipientenstamm ebenfalls für andere, nicht erwünschte hochexperimentelle extralzelluläre Enzyme vollständig oder weitgehend inaktiviert und die plasmidale Antibiotika-Resistenz eliminiert wird.