CN101952439A

CN101952439A - 无抗生素状态下产生多肽的表达系统

Info

Publication number: CN101952439A
Application number: CN2008800147494A
Authority: CN
Inventors: 斯爱琳·卡多特; 啼娜·普劳斯; 璐斯·史维尔德福哲; 布如诺·文因特
Original assignee: AB Enzymes GmbH
Current assignee: AB Enzymes GmbH
Priority date: 2007-05-04
Filing date: 2008-03-12
Publication date: 2011-01-19
Also published as: ATE509109T1; WO2008135113A4; WO2008135113A8; EP2145006B1; DE102007021001A1; CA2686263A1; BRPI0811501A2; MX2009011934A; US8465946B2; ZA200907647B; DK2145006T3; BRPI0811501B1; US20100248306A1; EP2145006A1; WO2008135113A1; AU2008249045A1; AU2008249045B2; CA2686263C

Abstract

本发明涉及一种用于产生一种或一种以上靶多肽的表达系统，其包含宿主细胞，在所述宿主细胞的基因组中，编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主细胞经包含编码所述靶多肽和3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列的染色体外元件转化，由此所述宿主细胞基因组与所述染色体外元件都不携带抗生素抗性基因。

Description

无抗生素状态下产生多肽的表达系统

技术领域

本发明涉及一种微生物表达系统，其在使用染色体外DNA的基础上产生多肽，由此不必使用用于宿主细胞选择的抗生素标记基因(由所述基因得到的蛋白质使细胞具有抗生素抗性，所述基因也称为抗生素抗性基因、抗性基因、抗生素标记或抗生素选择标记)，而是使用编码3-磷酸甘油脱氢酶(也称为NAD(P)H依赖性二羟丙酮磷酸还原酶、NAD(P)H依赖性3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶(NADP)、3-磷酸甘油合酶、生物合成的3-磷酸甘油脱氢酶、L-3-磷酸甘油：NAD(P)氧化还原酶)的DNA序列，因此所需多肽(例如木聚糖酶)的产生无需添加抗生素。所述表达系统中不存在抗生素抗性基因。本发明还涉及一种编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的DNA序列，以及一种具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽。

背景技术

现今，所需的大量多肽和酶主要是通过微生物发酵而获得。由此使用两种微生物：i)天然产生相关蛋白质的微生物；和ii)经基因修饰的微生物。现有技术中早已了解修饰微生物所需的遗传学方法。其基本原理在于：将编码相关蛋白质的基因插入宿主细胞中，并由所述宿主细胞进行转录，翻译，可能的翻译后修饰，并且任选由个别膜分泌到周质或相邻培养基中。随后可从个别细胞或培养上清液中分离出相关多肽。

在用于产生多肽的技术方法中，首先研究用于所述产生的微生物合成和任选分泌蛋白质的天然能力。在发酵过程中具有成本效益的系统显示出高产物形成率并且保证将产生的多肽能够进行正确折叠、修饰等，因此主要选择所述系统作为产生多肽的系统。确定用于此目的的微生物有真核来源的微生物，例如丝状真菌(曲霉菌(Aspergilla)、木霉菌(Trichoderma)、青霉菌(Penicillium))和酵母(例如酵母菌(Saccharomyces)、汉逊酵母(Hansenula)、毕赤酵母(Pichia))，或使用原核生物，例如大肠杆菌(E.coli)、芽孢杆菌(bacilli)、乳杆菌(lactobacilli)、葡萄球菌(staphylococci)、链霉菌(streptomycetes)或假单胞菌(pseudomonades)。

生物技术方法的收益性无疑取决于所获得的多肽的产率。这一产率不仅是由所用的表达系统决定，而且还由所用的制造方法、尤其发酵参数和培养基决定。通过优化表达系统和发酵方法，可明显增加潜力和可获得的产率。

经基因修饰的微生物含有新的遗传信息，这些信息被整合到基因组中(通常见于丝状真菌或酵母)或是整合到例如质粒等染色体外元件(通常用于原核生物或酵母)上。新的遗传信息被整合到宿主基因组中的第一构筑体也极为稳定，没有选择压力。对于原核生物，这种方法的缺点在于：转化后，仅一个基因拷贝存在于宿主中，而且整合同一基因的其它拷贝以便经由基因剂量效应增加产物形成率的方法相当复杂。这种方法的解决方案可见于EP 0 284 126 B1，所述方案通过单独提供外源基因拷贝，经由对宿主细胞至关重要的内源染色体DNA将所述拷贝整合到所述细胞的基因组中，解决了基因的稳定多次整合的问题。专利申请案DD 277467 A1提供一种产生细胞外酶的方法，所述方法是建立在稳定、有利地将编码相关多肽的基因多次整合到细菌染色体中的基础上。所述整合是通过在同源范围内重组而进行。利用质粒将红霉素(erythromycine)基因插入细胞中，并在成功整合的情况下使其失活，由此所述质粒上所含的红霉素基因可用作成功整合事件的对照。

申请案WO 96/23073 A1公开一种基于转座将相关基因的数个拷贝整合到细菌染色体中的系统，其特征在于：所述载体的标记基因在整合期间或之后缺失，因此，所得菌株无标记基因。根据这一文献，只有在构筑个别细菌菌株的过程中才需要标记。

申请案WO 01/90393 A1公开一种增加整合到细菌染色体中的某些基因的拷贝数的系统。

如果使用染色体外DNA产生经基因修饰的微生物，那么应将相关基因转移到自主复制元件(例如质粒)中，并使其以游离基因形式保持在宿主有机体中。经由每一细胞通常较多的质粒拷贝所引起的基因剂量效应会有利地影响由相关基因编码的多肽的产率。不利之处在于，应在完整的培养时间内保持选择压力，以便使染色体外元件在细胞中保持稳定。在将抗生素添加到培养基中时，一般会出现这种情形。由于使微生物对抗生素产生抗性的基因是位于染色体外元件上，故只有具有这类元件的细胞才可能生长。通过将相关基因定位于同样会使宿主对一种或一种以上抗生素产生抗性的质粒上，来使细胞中保持所述基因的多个拷贝。使用抗生素作为选择压力，可以避免由于分离或结构不稳定性而引起的质粒丢失(Bron和Luxen，1985，plasmid 14，235-244)。以这种方式，还可在细胞中稳定保持较大质粒，并且所述细胞仍保持产生所需多肽的能力。一般说来，染色体外DNA很容易丢失，尤其是所述有机体的未知DNA更容易丢失。对于天然含有质粒的细菌，应用选择压力通常也是合理的，这是因为天然存在的染色体外元件通常只以低拷贝数存在；但是，工业上的高生产率却需要高拷贝数。然而，所述高拷贝数通常只能通过选择压力来保持。

近年来，使用抗生素抗性作为选择标记越来越无法令人满意。首先，使用抗生素相当昂贵，尤其当所述抗性是基于降解抗生素的酶时更是如此，以致必须在整个培养期间供应抗生素。其次，其在世界范围内的使用还延伸到其它的工程改造和医学领域，这使得抗性基因散布到其它也具致病性的菌株上，从而可能会对疾病控制带来不利后果。

现有技术中也已开发出无抗生素选择的系统。举例来说，Herrero等人(1990，J.Bacteriol.172，6557-6567)发表的文章中描述作为选择标记的除草剂和重金属抗性。然而，与反对使用抗生素的顾虑相同，也反对使用这些化合物。

另一种用于使质粒在细胞中保持稳定的方法为营养缺陷型菌株(auxotrophic strain)的游离基因补充(episomal complementation)。在这种情况下，生产菌株的基因组中编码基本代谢功能的基因被去除或失活。因此，营养缺陷型宿主菌株只能在另外再产生代谢功能的情况下生长。如果所述菌株能够接受所需代谢产物，或可使在宿主基因组上失活并且编码基本功能的基因成为可用的游离基因，那么例如可将此代谢物添加到培养基中。有利的是，这种情形发生在也携带产生多肽的相关基因的质粒上。专利EP 0 284 126B1列出用作营养缺陷型选择标记的代谢基因leu、his、trp等，尤其来自氨基酸合成路径的基因。

实际上，由于特别是在工业发酵培养基中，几乎所有的必需物质(例如氨基酸和维生素)都是足量可用的，而且个别细胞可通过从培养基中吸收某一代谢物来平衡其所缺乏的合成这一代谢物的能力，故到目前为止，很难使用所述营养缺陷型作为选择标记。

工业上使用的发酵培养基通常含有为其它过程(通常是发酵过程)的废产物的组分，例如乙醇生产中的谷物残留物(蒸馏塔余下的谷物)、淀粉生产中的玉米残留物(玉米浆粉或玉米浆液)或淀粉生产中的马铃薯残留物(马铃薯浆(potato slump))。这些组分不仅能用作碳源(C)或氮源(N)，而且还通常因其回收过程涉及微生物发酵而富含例如维生素或氨基酸。因此，工业上使用的发酵培养基相当复杂。因而，即使是使用营养缺陷型菌株，也很难甚至是不可能在这些培养基中保持选择压力。

迄今为止，唯一的例外为针对芽孢杆菌和革兰氏阳性(gram-positive)微生物所需的必要胸苷和D-丙氨酸的营养缺陷型，所述胸苷和D-丙氨酸只以微量存在，或者根本不存在于工业发酵培养基中，因此须由微生物自身产生。因此，申请案EP 0 251 579 A1提供使用缺乏对于核苷酸代谢至关重要的胸苷酸合酶基因的菌株作为宿主菌株的解决方案。相应地，可借助于载体获得用于此功能的基因(来自大肠杆菌K12的thyA)，从而消除基因缺陷。专利EP 0 185 512 B1使用dal缺陷型宿主菌株，通过将dal基因(D，L-丙氨酸消旋酶)插入质粒中来解决所述问题。

申请案WO 2004/078953描述另一种解决这一问题的方法。其公开，分泌过程中所涉及的必要因子适于选择。产生蛋白质转位所涉及的蛋白质的基因提供选择的基础，所述蛋白质为个别基因的必要因子，例如对于芽孢杆菌，蛋白质SecA、SecY、SecE、b-SRP、FtsY或PrsA。这意味着所述因子的缺乏是致死性的，因此允许重组微生物的类似于抗生素的选择。

总而言之，必须说明的是，尽管有数年来通过生物技术方法产生多肽的经验，但迄今为止，尚未提供可能使用相关基因的多个拷贝进行生产，而无需通过昂贵或影响生态的物质(例如抗生素)进行选择的实用系统。归因于工业上所用培养基的复杂性(WO2004/078953)，或由于所述系统仍含有抗生素抗性基因，迄今为止，通过营养缺陷型标记进行选择的不同方法也都只得到相当贫乏的结果。

因为由纯组分(纯碳源和氮源以及维生素、氨基酸和矿物质)构成的合成培养基的成本较高，所以不可能使用所述培养基来产生工业上使用的多肽，例如食品工业、饲料工业或洗涤剂工业中的酶。

发明内容

因此，本发明的目的是提供一种用于产生多肽的表达系统，其中不存在利用昂贵和/或有污染和/或不健康的物质进行选择。具体说来，不必通过抗生素抗性进行选择。本发明的表达系统易于应用，且普遍适用于任何靶多肽的表达。此外，本发明的表达系统适于在任何宿主细胞中建立。而且，本发明的表达系统还允许在工业上常用或具有成本效益的培养基中进行选择。

所述目的是通过一种用于产生一种或一种以上靶多肽的表达系统来实现，所述表达系统包含宿主细胞，在所述宿主细胞的基因组中，编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主细胞经包含编码所述靶多肽和3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列的染色体外元件转化，由此所述宿主细胞基因组与染色体外元件都不携带抗生素抗性基因。

意外地发现，染色体外元件上所提供的3-磷酸甘油脱氢酶基因可用于个别营养缺陷型宿主细胞中，从而用于相应宿主细胞的选择。携带3-磷酸甘油脱氢酶基因的染色体外元件也携带将产生相关多肽的基因。

因此，3-磷酸甘油脱氢酶基因用作使染色体外元件在营养缺陷型宿主细胞中稳定的选择标记。所述染色体外元件包含编码靶多肽和3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列，它的稳定是建立在变为营养缺陷型的宿主细胞的游离基因补充的基础上。在宿主菌株的基因组中，编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列或个别基因失活。这一基因编码酶3-磷酸甘油脱氢酶(也称为NAD(P)H依赖性二羟丙酮磷酸还原酶、3-磷酸甘油合酶、生物合成的3-磷酸甘油脱氢酶；Morbidoni等人，1995，J.Bacteriol.177(2)，5899-5909；EC编号1.1.1.8、1.1.1.94，在本文中还称为NAD(P)H依赖性3-磷酸甘油脱氢酶、3-磷酸甘油脱氢酶(NADP)、L-3-磷酸甘油：NAD(P)氧化还原酶)。3-磷酸甘油脱氢酶在NAD(P)H的键联下，催化二羟丙酮磷酸转化成顺-3-磷酸甘油。顺-3-磷酸甘油本身为细胞磷脂合成的起始物质，且因此为细胞膜合成的主要代谢物。视有机体而定，NAD(P)H依赖性3-磷酸甘油脱氢酶基因还被称为gpsA(也称为gol、gly、glyc)、gpd(gpd 1/2/3/A/A1/A2/h)或dar1。一般说来，它是在生理条件下催化合成3-磷酸甘油的酶，并且通常使用NAD(P)H作为辅因子。使用不同辅因子(例如FAD)的相应酶也是可以想到的。视宿主菌株而定，编码3-磷酸甘油脱氢酶的相应基因或3-磷酸甘油脱氢酶基因失活。

通过使宿主菌株的基因组中缺失3-磷酸甘油脱氢酶基因，使所述菌株变成3-磷酸甘油(G3P)营养缺陷型，但如果在培养基中作相应补充(补充G3P或甘油)，或提供相应的游离基因，那么所述菌株仍可能生长。通过将3-磷酸甘油脱氢酶基因插入也携带相关多肽的DNA序列的质粒中，使所述质粒在营养缺陷型宿主细胞中保持稳定。同时，消除通常存在于质粒上的抗生素抗性基因。此外，也消除任选存在于宿主细胞基因组中的抗生素抗性基因。抗生素抗性基因的消除是以本来已知的方式进行，例如对于基因组，利用同源重组(参看下文)；或对于质粒，借助于适当限制酶进行切除，随后接合。

本发明表达系统的宿主细胞的基因组中缺失编码3-磷酸甘油脱氢酶的相应DNA序列。所述缺失可为完全或部分缺失。在任一种情况下，缺失的存在都必须使3-磷酸甘油脱氢酶基因失活。宿主菌株中所述基因的失活例如是通过利用失活或(部分)缺失的基因拷贝进行同源重组而发生。由于这一重组事件，所述基因的染色体拷贝变得不可操作。此外，优选系统的特征在于：染色体上发生3-磷酸甘油脱氢酶基因失活，以致优选在完全丧失个别染色体基因座中所含的基因或基因片段时，避免失活的染色体基因拷贝与消除失活的互补载体(curing complementation vector)上的同源区稍后重组。宿主基因组中互补载体的重组和整合(由此将以游离形式提供具有基本功能的细胞)将再次消除失活，并因此抵消使质粒在细胞中保持稳定的选择压力。由此，欲表达的实际上相关的基因可通过随后的细胞分裂而丢失，或仅存在于染色体上的一个或数个拷贝中。通过失活步骤期间的广泛或完全缺失可防止这种情形，这在理论上还可能涉及位于上游或下游的DNA片段。因此，须考虑到，gpsA基因上游或下游的区域可能在宿主菌株中具有对所述宿主极为重要的功能。

为了避免染色体外元件所提供的3-磷酸甘油脱氢酶基因与任选存在的染色体基因之间发生同源重组，有必要通过个别点突变，以及广泛或完全地去除宿主基因组上的3-磷酸甘油脱氢酶基因来使所述基因失活。举例来说，利用仅包含所述基因的失活部分或甚至更佳地仅包含所述基因的侧接区而非所述基因本身的缺失载体(deletion vector)，通过同源重组从宿主基因组中消除所述基因，以致宿主基因组上所述基因的拷贝经缺失载体上存在的截短的拷贝置换，或完全缺失。重要的是，由此没有抗生素标记基因留下。为了从宿主中完全消除所述基因，有必要在宿主基因组的上游和下游分离出侧接所述基因的区域，并将这些无3-磷酸甘油脱氢酶基因本身的侧接区插入缺失载体中。随后，使侧接3-磷酸甘油脱氢酶基因的各序列之间发生同源重组，由此将3-磷酸甘油脱氢酶基因从基因组中完全去除。

根据本发明，利用携带3-磷酸甘油脱氢酶基因以及编码相关多肽的DNA序列的染色体外元件，使细胞再次获得宿主染色体上缺失或失活的3-磷酸甘油脱氢酶基因。不仅个别宿主细胞中缺失的相同基因，而且编码NAD(P)H依赖性3-磷酸甘油脱氢酶的相应基因都可再次为宿主细胞所用。

因此，本发明还涉及一种宿主细胞基因组(其中编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列缺失)的互补载体，其包含编码靶多肽的DNA序列，和包含编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列的表达盒，由此所述载体不含抗生素抗性基因。因此，所述载体消除编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA的失活(“互补载体”)，即，其在染色体外提供编码3-磷酸甘油脱氢酶的活性基因拷贝。术语“载体”和“质粒”基本上可以互换使用。其它染色体外元件(例如噬菌体、噬菌粒(pagmide)或转座子)也可用作载体。

在宿主细胞中保持多个拷贝的质粒优选作为载体。如果质粒为成簇建立(例如，每个细胞10到30个质粒)、优选具有多个拷贝(每个细胞超过30个质粒)的质粒，那么这种情形将是特别有益的。存在的质粒拷贝越多，因基因剂量效应而产生的所需蛋白质产物的产率就越高。

根据本发明，互补载体不含任何抗生素抗性基因。此外，互补载体不仅含有用于产生多肽的相关序列，而且还含有具有3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达盒。

由此，优选使用编码3-磷酸甘油脱氢酶并且内源性存在于宿主细胞中的缺失序列。然而，如果其它有机体(优选相关菌株)中编码具有相同功能的酶的序列能够消除个别缺陷，并由此提供在无进一步选择压力的情况下保证相关蛋白质的高生产率的系统，那么也可能使用所述序列。这一染色体外DNA的丧失对于在基本培养基中生长的营养缺陷型宿主细胞是致死的，以致迫使所述细胞在每次细胞分裂时都将这一染色体外元件传递到下一代。当重组菌株在不提供3-磷酸甘油或甘油的培养基中生长时，本发明的系统中存在内源性选择压力。无需添加抗生素来避免具有待表达的基因的载体的丧失。

可用于将编码3-磷酸甘油脱氢酶活性或本发明的开放阅读框的DNA序列引入宿主细胞中的表达盒优选包含与所述开放阅读框连接的转录起始区。所述表达盒可包含多个限制性裂解位点以插入开放阅读框和/或其它DNA(例如转录调控区)。转录盒包含(按转录的5’→3’方向)：转录和翻译起始区、编码3-磷酸甘油脱氢酶活性的DNA序列以及在微生物细胞中具有功能的转录和翻译终止区。终止区就转录起始区来说可为原生的；就相关DNA序列来说也可为原生的；或可源自任何其它来源。

术语“开放阅读框”(ORF)是指在编码序列的翻译起始密码子与终止密码子之间编码的氨基酸序列。术语“起始密码子”和“终止密码子”是指编码序列中的三个相邻核苷酸的整体(密码子)，其指定蛋白质合成(mRNA翻译)的链起始和终止。

与核酸有关的“可操作性连接”是指在适合启动子转录起始的位置和方向上成为同一核酸分子的一部分的化合物。与启动子可操作性连接的DNA位于启动子的转录起始调控的下游。编码序列可在有义或反义方向上与调控序列可操作地连接。对于多肽，可操作性连接意思指成为同一多肽的一部分(即，经由肽键)的化合物。

根据本发明，可使用任何启动子，只要所述启动子使本发明的系统保持稳定即可。在优选实施例中，使用弱的组成性启动子。启动子通常是指在编码序列上游(5’)的核苷酸序列，并且通过识别RNA聚合酶和正确转录所需的其它因子来控制编码序列的表达。本发明所用的启动子可包含最小启动子(即，来自TATA盒的短DNA序列)，以及指定转录起始位点的其它序列，所述序列与调控元件相连接以便控制表达。

可利用本发明的表达系统来产生相关多肽，其产率比在产生的任何时间点都不添加抗生素并且不存在抗生素标记基因并且蛋白质产物中也不存在抗生素或抗生素抗性基因的情况下的产率高，甚至至少相同。因此，通过使用本发明的表达系统，使得所述产物也可用于不容许或不需要存在完整或部分抗生素标记基因的应用中。

本发明另外涉及所述表达系统的用途，其用于在无抗生素存在的情况下产生靶多肽。由此，所述表达系统是在无3-磷酸甘油或提供3-磷酸甘油的化合物的培养基中生长。所述培养基的实例阐述于上文中。表达系统的生长是以本身已知的方式进行。

本发明的表达系统适于任何宿主细胞。本发明的表达系统一般可用于实际上所有用于发酵产生蛋白质的重要的工业宿主细胞。实例为例如葡萄球菌属、棒杆菌属(Corynebacterium)或芽孢杆菌属的革兰氏阳性宿主有机体，尤其是种群肉葡萄球菌(Staphylococcus carnosus)、谷氨酸棒杆菌(Corynebacterium glutamicum)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、地衣芽孢杆菌(B.licheniformis)、解淀粉芽孢杆菌(B.amyloliquefaciens)、短小芽孢杆菌(B.brevis)、球形芽孢杆菌(B.globigii)、巨大芽孢杆菌(B.megaterium)、克劳氏芽孢杆菌(B.clausii)或迟缓芽孢杆菌(B.lentus)，特别是菌株地衣芽孢杆菌或解淀粉芽孢杆菌的衍生物。

优选使用芽孢杆菌属菌株作为宿主细胞。特别优选使用解淀粉芽孢杆菌。在解淀粉芽孢杆菌中，3-磷酸甘油脱氢酶基因是以gpsA形式存在。意外地发现，与含有抗生素标记的类似质粒(pUB110衍生物)相比，可在不减少生产质粒的拷贝数的情况下，在解淀粉芽孢杆菌中建立本发明的表达系统。甚至与经具有抗生素标记基因的起始质粒(源自pUB110的pIK91，参看EP 0 585 617 B1)转化的宿主菌株(GpsA⁺)相比，利用由此转化的解淀粉芽孢杆菌宿主菌株(GpsA^-)获得较高生产率也是可能的。

还发现，利用侧接解淀粉芽孢杆菌的内源性gpsA基因的序列，可很好地从解淀粉芽孢杆菌的基因组中去除所述gpsA基因。此外，如果由此以游离基因形式提供内源性gpsA基因，将极为有利。为此，分离出解淀粉芽孢杆菌中的gpsA基因，所述基因迄今仍为未知的。尽管序列数据库，例如EMBL(欧洲生物信息研究所(EuropeanBioinformatics Institute，EBI)，英国剑桥(Cambridge，Great Britain)；http://www.ebi.ac.uk)或GenBank(美国生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information，NCBI)，美国国立卫生研究院(National Institutes of Health)，美国马里兰州贝塞斯达(Bethesda，MD，USA)；http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)，都含有gpsA基因数据，但通过将本发明的基因与来自其它有机体的gpsA基因相比较发现，在DNA水平上，本发明的基因仅与枯草芽孢杆菌的所述基因展现76％的一致性，或与地衣芽孢杆菌的基因展现71％的一致性。

酶3-磷酸甘油脱氢酶在杆菌中提供顺-3-磷酸甘油(G3P)(细胞膜合成的基本代谢物)。Morbidoni等人(1995)中描述须极精细地调控枯草芽孢杆菌细胞中G3P的含量，并且所述细胞中G3P的合成与降解之间的平衡至关重要。由Freese等人进行的实验(1972，Halverson等人(编)Spores V，212-221)表明，枯草芽孢杆菌细胞中因缺乏分解代谢的磷酸甘油脱氢酶(Gof)而导致磷酸甘油积累，致使枯草芽孢杆菌细胞的生长情况不如芽孢形成受抑制的正常细胞。

一般说来，编码待产生的多肽的相关基因理想地是以可能较高的拷贝数存在于宿主细胞中，以便经由基因剂量效应增加产率。因此，在优选实施例中，使用以多个拷贝存在于细胞中的质粒，例如pUB110的衍生物，其在每个细胞中以约50个拷贝存在(Gryczan等人，1978，J.Bacteriol.134，318-329)。然而，引入大量待互补的基因gpsA的拷贝可能会破坏G3P的合成与降解之间敏感的平衡。

现已意外地发现，在本发明的条件下，针对枯草芽孢杆菌所描述的这些问题不会在解淀粉芽孢杆菌中发生。由此，在优选实施例中，gpsA基因是位于弱启动子的下游。Zyprian和Matzura(1986，DNA 5，219-225)报导，在载体pUB110中，通常存在所述启动子。如果使gpsA基因处于这种启动子的调控下，那么细胞中G3P的合成与降解之间的精密平衡明显得到保持，但基因拷贝数相比未经修饰的芽孢杆菌细胞有所增加。由于所述启动子也为组成性的，故可在芽孢杆菌细胞周期的任一时间点提供充足的3-磷酸甘油脱氢酶。此外，如果在复合培养基中生长，所述系统还可在gpsA阴性宿主细胞中稳定保持高拷贝数。这允许在工业上常用的培养基中以高浓度产生也由互补载体编码的相关多肽。

如所述，可根据本发明使用任何启动子，只要所述启动子使本发明的系统保持稳定即可。特别优选弱的组成性启动子，例如上文关于质粒pUB110所述的启动子(Zyprian和Matzura(1986))。来自枯草芽孢杆菌的ptsH启动子也为适当的弱的组成性启动子(Stülke和Hillen，2000，Annu.Rev.Microbiol.54，849-80)。

如上文所述，在本发明的表达系统中，宿主染色体上的3-磷酸甘油脱氢酶基因失活。通过提供游离型个别基因来平衡无法合成3-磷酸甘油脱氢酶的能力。很早以前，就已经通过经典突变法产生GpsA阴性枯草芽孢杆菌突变体(Mindich，1970，J.Mol.Biol.49，415-432)。这些突变为gpsA基因的等位基因(Morbidoni等人，1995)，其可能只是gpsA基因或其调控中的点突变。

这些菌株(和这种方法)不适用于工业上产生蛋白质，因为其可能会自发回复突变成为活性形式，而且所提供的完整游离型gpsA基因与缺陷型染色体基因可能因具有长同源区而重组(也参看Ostroff等人，1984，Mol.Gen.Genet.193，299-305)。Khasanov等人(1992，Mol.Gen.Genet.234，494-497)表明在芽孢杆菌属基因组中70bp的同源区可能已发生同源重组。在所述情况中，宿主细胞可能又变为原养型(prototrophic)，并且不再依赖于具有gpsA基因的质粒。这将使质粒更易于整合或丢失，以致宿主细胞不再产生或仅产生少量由也存在于所述质粒上的基因构成的相关多肽。

解淀粉芽孢杆菌中的gpsA基因以及所述基因的上游和下游区域并未得到描述；数据库(例如EMBL、GenBank、SubtiList(Moszer等人，1995，Microbiology 141，261-268，Moszer，1998，FEBS Lett.430，28-36；http://genolist.pasteur.fr./SubtilList/)))只提供了有关枯草芽孢杆菌和更远亲微生物的数据。解淀粉芽孢杆菌的基因组结构也是未知的。与gpsA基因直接相邻位于枯草芽孢杆菌染色体上的基因(即，其表示产生营养缺陷型宿主所需的侧接区)可存在于解淀粉芽孢杆菌基因组中完全不同的位置，或可能甚至完全缺失。还应考虑到，gpsA基因上游和下游的区域可在宿主菌株中编码对所述宿主至关重要的功能。对于枯草芽孢杆菌，上游和下游具有未知功能的基因都得到描述，而对于解淀粉芽孢杆菌，并无有关相邻基因的信息。因此，完整地保持枯草芽孢杆菌和解淀粉芽孢杆菌以及其它杆菌属中与gpsA基因相邻的区域是明智的，以免破坏基因组中其它未知且因此未得到补充的功能。由此，本发明迫切需要gpsA基因的完整但也可能精细的缺失，所述缺失不会引起可能相邻的基因的任何突变或读框移位(reading frame shift)。

同源区越长，通过同源重组精细地去除染色体基因或基因片段将越容易获得成功(参看Hamilton等人，1989，J.Bacteriol.171(9)4617-4622)。已发现，在解淀粉芽孢杆菌中侧接gpsA基因的区域中，上游具有约1.3kbp的区域与枯草芽孢杆菌中的相应区域(如数据库SubtiList中所述)仅展现约84％的序列一致性，并且下游具有约1.1 kbp的区域与枯草芽孢杆菌中的相应区域仅展现约69％的序列一致性(Moszer等人，1995；1998)。因此，很难扩增宿主菌株解淀粉芽孢杆菌的染色体DNA上的侧接区域，这尤其是因为构筑缺失载体还需产生可能较长的同源区。

举例来说，借助于质粒载体使宿主染色体上的3-磷酸甘油脱氢酶基因缺失，所述质粒载体具有对温度敏感或在芽孢杆菌属中不工作的复制起点，并且已另外插入欲缺失的基因的可能(侧接)的同源DNA区(缺失载体)。然而，也可以设想例如通过将可移动的遗传元件(例如转座子)整合到欲失活的基因中来实现可逆失活。

有关经由缺失载体使基因失活的方法描述于Vehmaanper

等人发表的文章中(1991，J.Biotechnol.19，221-240)。这种缺失载体的复制起点是以其温度依赖性为特征。因此，可能首先在低温下选择成功的转化，随后通过增加温度来执行选择压力以供成功整合。随后，利用包含内源性基因拷贝的载体来处理细胞，以致功能性基因拷贝不再存在于染色体上。细胞中也不保留任何载体序列，即，也不保留抗生素抗性基因。

因此，本发明涉及一种编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的DNA序列，其特征在于：所述DNA序列是选自a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA序列；b)包含由SEQ ID NO：1中的核苷酸1338到2375表示的核苷酸序列的DNA序列；c)由质粒pTP01编码的DNA序列，所述质粒具有图4的质粒图并且以寄存编号DSM 18890寄存；d)编码SEQ ID NO：2的蛋白质序列的DNA序列；e)在严格条件下与a)、b)、c)或d)的DNA序列中的一者杂交的DNA序列；f)因遗传密码简并性而与a)、b)、c)、d)或e)的DNA/核苷酸序列相关的DNA序列；和g)a)到f)的序列的互补链，并且具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽是选自：a)由上述DNA序列的编码部分编码的多肽；b)具有SEQ ID NO：2的序列或通过SEQ ID NO：2的序列中一个或一个以上氨基酸的取代、添加和/或缺失而获得的序列的多肽；c)具有与SEQ ID NO：2的氨基酸1到345展现至少77％一致性的序列的多肽；d)由在严格条件下与(i)SEQ ID NO：1中的核苷酸1338到2375、(ii)(i)中具有至少100个核苷酸的部分序列或(iii)(i)或(ii)的互补链杂交的核酸序列编码的多肽；e)具有SEQ ID NO：2的多肽的变异体，其包含一个或一个以上氨基酸的取代、缺失和/或插入；f)氨基酸序列a)到e)的等位基因变异体。

本发明另外涉及上述DNA序列的用途，其用于产生本发明的表达系统。意外地发现，源自解淀粉芽孢杆菌的编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的DNA序列特别有利于产生本发明的表达系统。

对于所提出的序列，优选通过测定比较中所涉及的两个具有“相应”对应物(counterpart)的序列中较短序列的残基数来分析序列一致程度。出于本发明的目的，优选以本身已知的方式，使用常用算法来测定一致性。根据本发明，只有编码成熟蛋白质或个别成熟蛋白质的氨基酸的核苷酸才用于比较。根据本发明，同样地，优选借助于已知的计算机程序来检测作为同源序列的一致序列对应物。这类程序的实例为程序CloneManager Suite，其包含程序部分Align Plus，并且是由Scientific&Educational Software(Durham，NC，USA)发布。由此，根据FastScan-MaxScore方法或根据Neeldeman-Wunsch方法，保持默认值，在选项局部比对(local alignment)下进行如上文所定义的两个或两个以上DNA或氨基酸序列的比较。为了计算一致性，根据本发明特别使用利用函数“Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequences as DNA bases”或针对氨基酸利用“Compare Two Sequences/Local/Fast Scan-Max Score/Compare sequencesas Amino Acids”的“Clone Manager 7 Algin Plus 5”程序版本。由此，使用从以下来源得到的算法：Hirschberg(1975，Commun.Assoc.Comput.Mach.18，341-343)；Myers和Miller(1988，CABIOS 4，11-17)；Chao等人(1992，CABIOS 8，481-487)。

本发明另外涉及上述具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的分子中的添加和/或缺失。因此，可通过在N末端和/或C末端或在分子中添加其它序列，来获得根据本发明修饰的具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽，以致由此获得的多肽仍展现3-磷酸甘油脱氢酶活性，或须能够与3-磷酸甘油脱氢酶缺陷型菌株互补。由此可产生具有其它有利特性的杂交分子。

根据本发明，具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽也可缺失序列部分，同时仍保持3-磷酸甘油脱氢酶活性。突变、延长和缩短都可根据所属领域中本身已知的方法，以本身已知的方式进行。

所属领域中一般已知所述变异体的产生。举例来说，可通过DNA突变产生多肽的氨基酸序列变异体。现有技术中众所周知进行诱变和核苷酸序列修饰的方法(例如参看Kunkel，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，488-492；Kunkel等人，1987，MethodsEnzymol.154，367-382；美国专利第4873192号，Walker和Gaastra(编)，1983，Techniquesin Molecular Biology，Mac Millan Publishing Company，New York)。有关不影响相关蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的参考文献可见于Dayhoff等人(1978，Atlas of ProteinSequence and Structure.Natl.Biomed.Res.Found.，Washington D.C.)的模型中。优选保守性取代，例如将一个氨基酸用另一个具有类似特性的氨基酸置换。这些置换可主要分为2组(总共4个亚组)，而且各亚组中的置换都称为保守性置换，其优选不影响蛋白质的活性或折叠。

术语“蛋白质”、“肽”和“多肽”基本上可以互换使用。具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽或酶是指催化将二羟丙酮磷酸还原成3-磷酸甘油的偶联NAD(P)H的还原反应的酶。3-磷酸甘油脱氢酶活性可使用本身已知的任何测试方法来确定，所述方法使用一种所述底物或产物(Morbidoni等人，1995；Bergmeyer，1970，Methoden der enzymatischenAnalyse.Verlag Chemie，426-227)。

本发明另外涉及编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的DNA序列，其包含SEQID NO：1的序列的突变、修饰或变异。此外，本发明还涉及在松弛或严格条件下与上述序列杂交的序列。严格条件为：在65℃下，在硫酸葡聚糖溶液(GenescreenPlus，DuPont)中杂交18小时；随后在65℃下，用6xSSC洗涤过滤器1次，用2xSSC洗涤2次，用2xSSC(0.1％SDS)洗涤2次，随后用0.2xSSC洗涤，各30分钟(膜转移和检测方法，Amersham)。

此外，本发明还涉及因遗传密码简并性而与本发明的上述序列相关的DNA序列以及其等位基因变异体。遗传密码简并性可由天然的简并性或由特别选择的密码子的使用引起。天然存在的等位基因变异体可使用分子生物学中众所周知的技术来鉴别，所述技术例如聚合酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)、测序技术和杂交技术。

可使用将在任何宿主细胞中缺失的编码本发明多肽的DNA序列，随后利用同样携带相关基因的质粒使其再次可用。在使3-磷酸甘油脱氢酶基因缺失/失活后，宿主细胞的特征是缺乏3-磷酸甘油脱氢酶的基本功能。

如本文所述构筑本发明的营养缺陷型宿主菌株的方式使得可能使用一次产生的染色体3-磷酸甘油脱氢酶基因失活的营养缺陷型微生物株，从而利用以类似方式构筑的互补载体不断地对其进行新的转化，所述互补载体每次都将提供相同的消除基因缺陷的功能，但每次也都携带用于产生其它相关多肽的不同基因。由此，提供一种极为实用并且通用的产生系统。

所述系统的价值在于：能够在无抗生素选择压力的情况下，使产生相关多肽所需的遗传元件历经许多代仍然保持稳定，并且使其在细胞中保持高拷贝数。这一元件为携带3-磷酸甘油脱氢酶基因以及欲产生的多肽的基因的质粒。

所述选择压力的保持对于重组产生菌株的储存极为有利。然而，所述系统所固有的稳定性足以在产生过程中保持高拷贝数，因此确保高生产率。

由于所述系统所固有的高稳定性，其甚至能在不应用选择压力(即，即使是在工业培养基中生长，所述培养基可能含有痕量甘油)的情况下仍在主要培养物中保持稳定，靶多肽的产率在培养期间不会降低，即，互补载体在细胞中保持稳定。

特别值得关注的是针对由微生物培养所产生的某些产物的本发明的表达系统，所述产物尤其为多肽或蛋白质，例如水解酶或氧化还原酶，特别优选α-淀粉酶、β-淀粉酶、麦芽糖淀粉酶、CGT酶、木聚糖酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、磷脂酶、磷酸酶、植酸酶、内切葡聚糖酶(尤其是内切β-1，4-葡聚糖酶、内切β-1，3(4)-葡聚糖酶、内切1，2-β-葡聚糖酶和内切1，3-α-葡聚糖酶)、纤维素酶、木糖苷酶、半乳聚糖酶(尤其是阿拉伯半乳聚糖-内切1，4-β-半乳糖苷酶和阿拉伯半乳聚糖-内切1，3-β-半乳糖苷酶)、果胶降解酶(尤其是果胶酶、果胶酯酶、果胶裂解酶、多聚半乳糖醛酸酶、阿拉伯聚糖酶(arabananase)、鼠李糖半乳糖醛酸酶(rhamnogalacturonase)、鼠李糖半乳糖醛酸乙酰酯酶、鼠李糖半乳糖醛酸-α-鼠李糖苷酶、果胶裂解酶和α-半乳糖醛酸酶)、甘露聚糖酶、β-甘露糖苷酶、甘露聚糖乙酰酯酶、木聚糖乙酰酯酶、其它木聚糖酶、阿拉伯木聚糖酶(arabinoxylanase)、蛋白水解酶(例如蛋白酶和肽酶)、脂肪分解酶(例如脂酶、双半乳糖苷-二甘油-酯酶和角质酶)，和其它酶(例如漆酶和谷氨酰胺转胺酶)。

因此，在主要用于产生蛋白质的工业方法中使用本发明的系统特别重要。如果质粒是基于可由抗生素产生的选择压力，那么通过培养微生物株的细胞来产生蛋白质的方法一般为现有技术中所知。

本发明另外涉及一种使用本发明的表达系统来产生相关多肽的方法。

以相关蛋白质被分泌到相邻培养基中为特征的蛋白质产生方法极为重要。由此，使所得产物的处理明显减少。然而，在实际产生之后将产生蛋白质的个别细胞溶解，并由此获得产物，也是本发明的一种可能的替代方法。

特别有利的一个方面在于，通过始终进行同一类失活和消除，但每次都在消除载体上提供另一种编码另一相关多肽的基因，将获得大量的相关微生物。以这种方式，可将一次成功开发出来的系统转移到无数的其它制造工艺中。

附图说明

随附图式将较为详细地说明本发明。其展示于以下：

图1：来自解淀粉芽孢杆菌的gpsA基因和侧接区的DNA序列；SEQ ID NO.1

(斜体字：gpsA基因，斜体/粗体：推定的RBS，粗体：推定的终止子)。

图2：由图1的gpsA基因编码的氨基酸序列，SEQ ID NO.2。

图3：图1的DNA序列与其它已知的芽孢杆菌属gpsA区的比对

(解淀粉芽孢杆菌：解淀粉芽孢杆菌RH 1330；枯草芽孢杆菌：枯草芽孢杆菌168；地衣芽孢杆菌：地衣芽孢杆菌ATCC 14580)。

图4：具有寄存的gpsA基因的pTP01的质粒图。

图5：缺失质粒的质粒图

(ALF：解淀粉芽孢杆菌RH 1330的染色体上位于gpsA基因上游的区域；ARF：解淀粉芽孢杆菌RH 1330的染色体上位于gpsA基因下游的区域；ermC：ermC基因编码腺嘌呤甲基化酶，从而提供针对红霉素的抗性)。

图6：pIK91的质粒图。

图7：用于表达多肽的载体pTP15的质粒图。

图4的质粒pTP01与菌株RH 1626是在2006年12月22日或2006年12月1 8日寄存于DSMZ(德国微生物菌种保藏中心(Deutsche Sammlung von Mikroorganismen undZellkulturen GmbH)，Mascheroder Weg1B，38124 Braunschweig；http://www.dsmz.de)，编号为DSM 18890和DSM 18878。以编号DSM 18878寄存的解淀粉芽孢杆菌RH 1626为缺失gpsA并且无质粒的受体菌株。寄存物DSM 18890是枯草芽孢杆菌RH 1632，其携带质粒pTP01。

具体实施方式

以下实例将较为详细地说明本发明。

实例

分子生物学工作是根据例如Sambrook和Russell所著指南(2001，Molecular cloning.Cold Spring Harbour Laboratory Press)中所述的标准方法来进行。所用试剂盒和酶都是根据相应制造商的说明书应用。

实例1：解淀粉芽孢杆菌中gpsA基因的分离

为了分离gpsA基因，借助于QIAGEN DNeasy Tissue试剂盒(Qiagen，Hilden)来制备解淀粉芽孢杆菌(AB Enzymes GmbH菌株保存中心)的染色体DNA，并在其上经由PCR扩增gpsA基因。由此使用与gpsA基因的上游和下游杂交的引物，以致所述基因完全扩增。所述引物是源自由实例2a)中的测序所确定的gpsA的侧接区的序列。使用以下引物来进行扩增：

SEQ ID NO.3：AL 1_1198 gctgttaagccgccgagcttcgttg，

SEQ ID NO.4：AR_180C taatcccatagcaccaagcgcaaaccac。

利用Sanger等人(1977，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 74，5463-5467)的方法，对含有1591 bp的DNA片段进行完全测序。所用的测序引物列于表1中。

表1：用于对解淀粉芽孢杆菌的gpsA基因进行完全测序的引物

SEQ IDNO.	引物	序列
			3	AL 1198	gctgttaagccgccgagcttcgttg
4	AR 180C	taatcccatagcaccaagcgcaaaccac
			5	TPAfw1	cgacaaaagccattcgggaagtg
6	TPAfw2	tccgcgtctatacaaatcccg
			7	TPAfw3	cgtaggcgatttaatcgtgac

1035 bp长的gpsA基因和因此由345个氨基酸组成的3-磷酸甘油脱氢酶以及侧接的DNA区描述于图1中。

实例2：解淀粉芽孢杆菌中gpsA基因的缺失

通过缺失载体来进行解淀粉芽孢杆菌染色体上基因gpsA的消除。所述程序是根据Vehmaanper

等人(1991)的描述。选择质粒PE194(描述于同一文章中)作为用于gpsA缺失的载体。这种载体的优点在于：它没有温度依赖性复制起点。在28℃下，pE194可在细胞中复制，以致在这一温度下，可首先选择pE194用于成功转化。随后，在46℃下培育含有所述载体的细胞。在这一温度下，载体不再复制，并且当质粒经两个同源区(gpsA的上游和下游)中的一者整合到染色体中时，运用选择压力。随后，经另一(第二个)同源区进一步同源重组，从而引起gpsA缺失。第一个同源区也有可能进一步重组。此时，载体再在染色体外重组，以致染色体gpsA基因将得到保持。

解淀粉芽孢杆菌RH 1330的基因组中gpsA基因的消除包含以下步骤：

步骤1：构筑缺失载体

分离解淀粉芽孢杆菌中侧接gpsA的区域

根据Sachse(Bertram和Gassen，1991，Gentechnische Methoden.Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，Jena，New York，99-100)的说明，制备解淀粉芽孢杆菌RH 1330的染色体DNA。

在解淀粉芽孢杆菌RH 1330的染色体DNA上，通过PCR来扩增侧接gpsA的区域。由于无法获得解淀粉芽孢杆菌中这些区域的序列，故从枯草芽孢杆菌(数据库SubtiList(Moszer等人，1995；1998)，state：18/02/2002)中yphC-gpsA-yphE-yphF区的已知序列得到不同引物。将所述引物放入非编码区(枯草芽孢杆菌中)，以避免在gpsA基因的侧接区内引入基因突变。由于解淀粉芽孢杆菌与枯草芽孢杆菌的这些非编码区之间具有特别低的序列一致性，故很难通过PCR进行侧接gpsA基因的区域的扩增，因此须在极为温和的条件(低退火温度、高模板浓度)下进行扩增。

使用以下引物来进行位于gpsA基因上游的区域的PCR扩增：

SEQ ID NO.8 ALF.Xba.fw aatgaaagcgtctagattgaaagg

SEQ ID NO.9：ALF.Kpn.bw catgtttgattggtacctttttattttc。

将PCR产物(ALF，1.4 kbp)插入质粒pCR

2.1-TOPO

(Invitrogen，Carlsbad，USA)中。所得质粒被称为pCC1。

使用以下引物来进行位于gpsA基因下游的区域的PCR扩增：

SEQ ID NO.1 0：ARF.Kpn.fw aagcgaaggtacccctctttg

SEQ ID NO.11：ARF.Xba.bw cctatttgaatatgacatctctagaaaatttc。

将PCR产物(ARF，1.2 kbp)插入质粒pCR

2.1-TOPO

中。所得产物被称为pCC2。

在载体pE194中并入解淀粉芽孢杆菌中侧接gpsA的区域

利用KpnI进行切割，从质粒pCC1中分离出ALF区，并将所述区域插入经同一种限制酶切割的质粒pCC2中。侧接gpsA的区域以“头尾相接(head-to-tail)”的形式存在于所得质粒pCC3中。

通过用Pst I和Sac I进行限制性切割，从质粒pCC3中分离出侧接gpsA的区域，并使所述区域成为经同一种限制酶切割的载体pE194的组成部分。所得温度依赖性复制的质粒pCC10为一种缺失质粒。通过限制性分析和测序证实这一点。

步骤2：用所述缺失载体转化解淀粉芽孢杆菌，并使染色体中的gpsA基因缺失

根据Chang和Cohen(1979，Mol.Gen.Genet.168，111-115)所述的方法，利用所述缺失载体经由原生质体转化解淀粉芽孢杆菌RH 1330。

相应地，根据Vehmaanper

等人(1991)的方法，使gpsA基因缺失。首先在抗生素压力和温度压力下，通过gpsA基因的一个侧接区的同源重组，将所述缺失载体整合到染色体中。随后，利用红霉素，使无选择压力的细胞生长，这能够使第二同源区中的两个拷贝之间发生二次重组，并切除携带gpsA的缺失载体。以这种方式，从所述芽孢杆菌基因组中完全去除染色体上编码的gpsA基因。

最后，使细胞在个别琼脂板上生长，检查所述细胞对红霉素的敏感性以及其针对甘油的营养缺乏，从而分离发生所需重组事件的细胞。

所分离的菌株解淀粉芽孢杆菌RH 1330Δ(gpsA)被称为RH 1626。通过测序和Southern印迹法证实，这一菌株的染色体中不含gpsA基因并保留侧接区域，以及pE194中不含抗生素抗性基因和其它序列。

实例3：构筑重组表达系统

重组表达系统的构筑包含以下步骤：

步骤1：利用解淀粉芽孢杆菌木聚糖酶将gpsA基因插入pUB110衍生物中

通过gpsA基因自身的核糖体结合位点(RBS)和其自身的转录终止子，由解淀粉芽孢杆菌的染色体DNA开始，扩增所述基因。为此，使用以下引物：

SEQ ID NO.12：ABa Ale fw cgaatccggcacgcttgtggatttg

SEQ ID NO.1 3：ABa Sph bw ccgtcccatcattgcatgcgttatatttc。

构筑引物，以便将RBS上游的Ale I裂解位点和终止子下游的Sph I裂解位点插入PCR产物中。随后，可通过这些插入木聚糖酶表达载体pIK91(EP0585617)中启动子后(Zyprian和Matzura(1986)中关于pUB110所述)的裂解位点，克隆所得PCR片段。载体pIK91(pUB110的衍生物；McKenzie等人，1986，plasmid 15，93-103；McKenzie等人，1987，plasmid 17，83-85)包含枯草芽孢杆菌的内切β-1，4-木聚糖酶(xyl)基因(重新分类为解淀粉芽孢杆菌)。由克隆得到的质粒pTP01(如图4中所述)具有7267 bp的尺寸，并且不仅携带基因gpsA和xyl，而且还携带卡那霉素(kanamcycine)抗性基因和博来霉素(bleomycine)抗性基因。通过限制性分析和测序来确定所得质粒pTP01的序列。利用pTP01来转化枯草芽孢杆菌菌株(1A247，BGSC；基因型：sacU(H)、rpsL)，由此使用感受态细胞(Bertram和Gassen，1991，Gentechnische Methoden.Gustav Fischer Verlag，Stuttgart，Jena，New York)进行转化。所得菌株被称为RH 1632。

可通过Morbidoni等人(1995)和Bergmeyer(1970)所述的酶活性测试，来验证携带pTP01的芽孢杆菌菌株RH 1632中活性3-磷酸甘油脱氢酶的表达(与先前文献中的报导相反)。在所述活性测试中，利用光度计监测在由3-磷酸甘油脱氢酶催化将二羟丙酮磷酸转化成顺3-磷酸甘油的偶联NADH的转化期间NADH浓度的变化。340 nm下吸光度的降低与底物浓度的降低成比例。由此，使芽孢杆菌菌株RH 1632在摇瓶(shaking flask)中的LB肉汤培养基(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、1％NaCl、自来水，在灭菌前将pH值调节为pH 7.2)中生长，通过离心收集细胞，并利用溶菌酶溶解。使用细胞溶解产物进行3-磷酸甘油脱氢酶活性测试。使用来自兔肌的3-磷酸甘油脱氢酶类似物作为标准品，可发现，携带质粒的芽孢杆菌菌株RH 1632的活性比枯草芽孢杆菌1A 247的活性高2.0个单位/克细胞湿重。因此，除染色体上编码的gpsA基因外，以游离基因形式编码的gpsA基因也在转化株中表达。

为证实营养缺陷型GpsA^-解淀粉芽孢杆菌菌株RH 1626(实例2)经由pTP01补充，利用质粒pTP01，经由原生质体转化所述菌株RH 1626(符合Chang和Cohen，1979)。通过在补充有木聚糖(xylane)和卡那霉素的TYE琼脂板(1％蛋白胨、0.5％酵母提取物、0.8％NaCl、1％木聚糖、10 g/l卡那霉素)上进行抗生素选择，来选择转化株。在不添加甘油或G3P的情况下，通过在基本培养基(Spizizen盐(Anagnostopoulos和Spizizen，1961，J.Bacteriol.81/5)，741-746)，以及0.7％葡萄糖和0.4％谷氨酰胺、经Millipore WaterSystem纯化的水，灭菌前pH值为pH 7.2)中培养，来验证营养缺陷型解淀粉芽孢杆菌菌株经由pTP01补充。

步骤2：抗生素标记基因的缺失

从质粒pTP01(实例3步骤1)中去除抗生素抗性基因kan和ble，随后通过PCR来扩增不含基因kan和ble的完整质粒。为此，使用将Sac II裂解位点插入PCR产物中的每一端的引物：

SEQ ID NO.14：pT ble kan Sac fw gctaaaatctattattccgcggttcagcaatcgg

SEQ ID NO.15：pT kan ble Sac bw gtccattcactatccgcggtcccttttcag。

用Sac II切割所得PCR产物，并丢弃限制性产物。利用接合产物来转化枯草芽孢杆菌菌株BGSC 61106(gol(＝gpsA)metC trpC2；Morbidoni等人，1995)的原生质体。所述菌株BGSC 61106充当中间宿主。在营养缺陷型GpsA^-解淀粉芽孢杆菌转化株RH 1626(实例2)中，不可能进行接合产物的直接转化。在由Spizizen盐、0.7％葡萄糖和0.2％谷氨酰胺组成的琼脂板上进行芽孢杆菌转化株的选择。通过定位和测序来确定所得5864bp的质粒，并将其称为pTP15(图7)。

步骤3：重组表达系统的制备

枯草芽孢杆菌BGSC 61106中质粒pTP15的分离是通过QIAGEN PlasmidMiniprepKit进行。利用质粒pTP15，经由原生质体转化解淀粉芽孢杆菌菌株RH 1626(ΔgpsA；实例2)。所得宿主/载体系统(在不存在抗生素抗性基因和无抗生素情况下，在培养基中得到)在AB Enyzmes菌种保存中心登记为编号RH 1810。通过在基本培养基(Spizizen盐以及0.7％葡萄糖和0.4％谷氨酰胺、经Millipore Water System纯化的水，在灭菌之前pH值为pH 7.2)中培养，来验证营养缺陷型解淀粉芽孢杆菌菌株经pTP15补充。与RH 1626相对，RH 1810是在基本培养基中生长。利用具有源自gpsA基因的侧接区的序列的引物，通过PCR来验证RH 1810的染色体DNA上不含gpsA基因。使用以下引物进行验证：

SEQ ID NO.1 6：A_313 gaaggtgtgacgtctgcggatgaa

SEQ ID NO.4：AR_180C taatcccatagcaccaagcgcaaaccac。

为了检查RH 1810中xyl基因的表达，测定培养上清液中木聚糖酶的活性。在摇瓶中，使芽孢杆菌菌株在不同培养基中分两个阶段生长。在第一步骤中，生长是在选择压力下在基本培养基(Spizizen盐以及0.7％葡萄糖和0.4％谷氨酰胺、经Millipore WaterSystem纯化的水，灭菌之前的pH值为pH 7.2)中进行。在第二步骤中，用5％第一培养物接种复合培养基。所述培养基符合以下组成：9％Glucidex 12、2％玉米浆粉、1.32％(NH₄)₂HPO₄、0.05％MgSO₄*7 H₂O、0.5％CaCO₃、自来水，在灭菌前将pH值调节为pH 8.0。使用48小时培育后所获得的培养上清液，根据以下方法来测定木聚糖酶的活性。

在412nm下，利用光度计测定通过酶促裂解木聚糖所释放的木聚糖片段。1个单位是指在标准条件下，在30℃下，1分钟内通过木聚糖裂解来释放1μmol木糖等效物的酶的量。利用0.04 M乙酸钠缓冲液(pH 4.5)来制备酶稀释液。对于主值(main value)，反应批料是由0.75 ml于0.04 M乙酸钠缓冲液(pH 4.5)中的0.5％麦木聚糖(oat speltxylane)和0.25 ml经相应稀释的酶溶液组成。对于空白值，将4 ml含0.5％对羟基苯甲酰肼(PAHBAH，Janssen Chimica公司)、0.465％Titriplex III(EDTA，company Merck)的溶液添加到0.5 M NaOH中，随后添加酶溶液以停止反应。

在30℃下培育20分钟后，通过添加4ml与关于空白值所述相同的溶液来停止主值的酶促反应，并通过在75℃下培育30分钟使其显色。利用将木糖用作标准品所获得的校准曲线进行校准，从而进行评估。

对于RH 1810的培养上清液中木聚糖酶活性的双重测定，测量出活性为153.4XylHg^-1和151.1 XylH g^-1。因此，在摇瓶中，无抗生素抗性基因的木聚糖酶产生的生产率高于利用RH 6000的生产率(其中卡那霉素用作选择压力)。通过比较发现，重组芽孢杆菌菌株RH 6000(RH 1330::pIK91)在摇瓶中获得仅57.8 XylH g^-1的木聚糖酶活性(EP0585617 B1)。

实例4：所述系统的稳定性的测定

为了测定GpsA^-解淀粉芽孢杆菌细胞中携带gpsA-xyl的质粒的遗传稳定性，在摇瓶实验中，在液体培养基中，在无选择压力的情况下检查实例3中所获得的菌株RH 1810。为此，使RH 1810的预培养物在选择压力下生长，即，使用营养缺陷型解淀粉芽孢杆菌无法生长并且芽孢杆菌菌株也无法获取甘油或G3P或者甘油或G3P的析出物的培养基。生长是在150 ml的Erlenmeyer摇瓶中进行，每次使用20 ml培养基。预培养物的培养基是由以下组成组成：Spizizen盐+7％Glucidex 12-2％酪蛋白水解物(pH值为pH7.2)。将第一预培养物培育16小时，并将由此获得的第二预培养物接种于同一种培养基组合物中。8小时培育后，接种由此得到的主要培养物。在具有150 ml培养基的11的Erlenmeyer摇瓶中进行无生长压力的生长，所述培养基的组成为：9％Glucidex 12、2％玉米浆粉、1.32％(NH₄)₂HPO₄、0.05％MgSO₄*7 H₂O、0.5％CaCO₃、自来水，在灭菌前将pH值调节为pH 8.0。在这种培养基中，无互补质粒pTP15(实例3步骤2)的GpsA^-芽孢杆菌菌株可能生长。8到16小时后，将培养物过度接种到2个具有新鲜培养基的Erlenmeyer摇瓶中(各5％)，由此，将一个摇瓶用于过度接种下一摇瓶，并在24小时培育后，测定来自另一摇瓶的培养上清液的木聚糖酶活性。将其培养5昼夜；由此，主要培养物过度接种4次。每次终止培养后，测定每毫升培养基中的总细胞数，以便能够控制RH 1810中pTP15质粒的稳定性。结果呈现于表2中。

表2：GpsA^-解淀粉芽孢杆菌细胞RH 1626的携带pTP15的转化株中的质粒稳定性(根据数代的木聚糖酶活性验证)

如表2中的结果所示，在无选择压力的情况下，木聚糖酶活性经历正常发酵的5倍时间仍保持稳定。通过在无选择压力的情况下仍保持恒定并且甚至略有增加的第一培养物的相对木聚糖酶活性，可看出这一点。

实例5：通过在生物反应器中利用重组系统发酵来产生木聚糖酶

a)预培养

使菌株RH 1810在选择板(Spizizen盐以及0.7％葡萄糖、0.4％谷氨酰胺和1％琼脂、经Millipore Water System纯化的水，灭菌前的pH值为7.2)上生长。在37℃下培育至少32小时。

第一预培养物：用琼脂板中的RH 1810接种11的具有挡板的Erlenmeyer烧瓶中的150 ml培养基。营养液具有以下组成：

在37℃下，将培养物培育16小时，同时振荡(150 rpm)。

第二预培养物：11的具有挡板的Erlenmeyer烧瓶中填装有150 ml相同组合物，并用5％第一预培养物接种。在37℃下培养8小时。

b)生物反应器

主要培养物：20 1由以下各物组成的营养液

用5％第二预培养物接种生物反应器。培养条件：37℃；通风0.5 vvm；以450 rpm搅拌，历时48小时。通过离心使培养肉汤澄清，并用于木聚糖酶活性的测定。在培养上清液中，测量出木聚糖酶活性为166 XylH g^-1。

c)烘烤实验

在揉面团机(Diosna公司制造)中，将100重量份燕麦粉、2重量份盐、3重量份酵母粉、58-60重量份水和40-50 ppm(以生面团的重量计)抗坏血酸以低档I搓揉2-3分钟，并以较高档II搓揉3-4分钟，从而制备出面团。在开始搓揉过程之前，将个别量的酶添加到水中。面团温度为25℃-28℃。将面团静置10分钟，随后将所述面团分成350g面片，从而得到德国白面包(German white bread)(“freigeschobenes Weiβbrot”)。再将面团静置20分钟，随后形成350g面片，在32℃和80％相对湿度下精制70分钟，并在230℃下烘烤32分钟。

待其冷却后，借助于TexVol instrument BVM-L370，利用激光扫描来测量面包的体积。在评估过程中，考虑由一个面片得到的全部4个面包的平均值。

烘烤实验的结果

将根据实例5a)和b)中所述的条件使RH 1810发酵而得到的培养上清液用于烘烤实验。利用根据本发明产生的酶，根据所述程序烘烤面包，所述面包展现以下特性：

表3：利用根据本发明产生的RH 1810的烘烤活性木聚糖酶与利用由重组芽孢杆菌菌株RH 6000产生的木聚糖酶(EP 0585617 B1)的浓度系列的比较

添加有来自RH 6000的烘烤活性木聚糖酶的面包的体积为100％。

每100kg面粉Xyl剂量单位	体积[％]
		1800	101
3600	102
		5400	99

<120>无抗生素状态下产生多肽的表达系统

<130>17327WO

<140>

<141>

<150>DE 10 2007 021 001.0

<151>2007-05-04

<160>16

<170>PatentIn version 3.3

<210>1

<211>3715

<212>DNA

<213>解淀粉芽孢杆菌

<220>

<221>CDS

<222>(1338)..(2372)

<400>1

aagggtacta tgggtaaacc tgtcgtagcc attgtcggaa gaccgaatgt gggaaaatcc 60

acaatcttta accggattgc gggtgaaaga atttcaatag tagaagatac ccccggagtg 120

acgcgggacc ggatatacag ttcggcggaa tggctgaatt atgattttaa cctgattgat 180

acgggcggaa ttgatatcgg agacgagccg tttctgacac agatccgcca gcaggctgaa 240

atcgccatgg acgaggctga tgtgatcatc tttatggtga acggccgcga aggtgtgacg 300

tctgcggatg aagaagtggc aaaaatactg taccggacga aaaaaccggt cgtattagcc 360

gttaataaat tagataatac cgaaatgaga gcgaacattt atgactttta tgcgctcggc 420

tttggagaac cgtatccgat ttcggggaca cacggtttag gattgggaga tttgctcgat 480

gcttgtgccg agcattttaa aaacattccg gagacgaagt acagtgatga tgtcgttcaa 540

ttctgcctga tcggccgccc gaatgtcgga aaatcatccc ttgtcaatgc gatgctcggc 600

gaagagcggg ttatcgtgag caacgtagcc ggaacgacta gagacgctgt ggatacggcg 660

ttcacttaca atcagcagga atttgtaatc gttgacacgg cgggaatgag aaaaaagggt 720

aaagtatatg aaacaacaga aaaatacagt gtgctgcggg cgttaaaagc cattgaccgc 780

tcagacgtcg tcggcgttgt gctgaatgca gaagaaggca tccttgagca ggacaagcgg 840

atcgccggat acgcccatga agccgggaaa gccgtcgtca ttatcgtaaa caaatgggat 900

gccgttgata aggacgagcg cacgatgaaa gaatttgaac agaatattcg ggagcatttc 960

caatttctcg attatgcgcc ggtgctgttt atgtcggcac tgacgacaaa gcggattcat 1020

acactcatgc ctgcgattat taaagcgagt gaaaaccact ctctccgcgt gcagacaaat 1080

atcttaaatg atgtcatcat ggatgcggtc gccatgaatc cgactccgac gcacaacggc 1140

tcccgtctga aaatttatta tgcgactcaa gtcgctgtta agccgccgag cttcgttgtt 1200

tttgtcaacg atccggaact gatgcatttt tcttatgaac gctttttaga aaaccgaatc 1260

cgggacgctt tcggatttga aggtacgcca attaaaatat ttgcaagagc aagaaaataa 1320

aaaggtgtga tacagag atg aaa aaa gtg gca atg ctt gga gcg gga agc 1370

Met Lys Lys Val Ala Met Leu Gly Ala Gly Ser

1 5 10

tgg ggc act gca ctt tct tta gtg ctg gct gat aac gga cat caa gtc 1418

Trp Gly Thr Ala Leu Ser Leu Val Leu Ala Asp Asn Gly His Gln Val

15 20 25

atg atg tgg gga cac cgt gcc gaa ttg atc gat caa atc aac gaa ctg 1466

Met Met Trp Gly His Arg Ala Glu Leu Ile Asp Gln Ile Asn Glu Leu

30 35 40

cat gaa aac aaa gat tac ctg ccg ggt gtg gag cta tca agt tct atc 1514

His Glu Asn Lys Asp Tyr Leu Pro Gly Val Glu Leu Ser Ser Ser Ile

45 50 55

atc ggg aca gcc gat tta agc gag gct tta aaa gga gct gac ttc atc 1562

Ile Gly Thr Ala Asp Leu Ser Glu Ala Leu Lys Gly Ala Asp Phe Ile

60 65 70 75

att gtg gca gta ccg aca aaa gcc att cgg gaa gtg ctg aaa aag gct 1610

Ile Val Ala Val Pro Thr Lys Ala Ile Arg Glu Val Leu Lys Lys Ala

80 85 90

ctg ccg tac atc ccg aaa caa tcg att ttt gtt cat gtc agc aag gga 1658

Leu Pro Tyr Ile Pro Lys Gln Ser Ile Phe Val His Val Ser Lys Gly

95 100 105

att gag ccg gat tcg ctt ctc cgc att tca gaa tta atg gag gag gag 1706

Ile Glu Pro Asp Ser Leu Leu Arg Ile Ser Glu Leu Met Glu Glu Glu

110 115 120

ctg cct gag gag tac aga aaa gac atc gtc gtg ctt tca ggg ccg agc 1754

Leu Pro Glu Glu Tyr Arg Lys Asp Ile Val Val Leu Ser Gly Pro Ser

125 130 135

cac gct gag gaa gtc gga tta aga cac ccg acg act gtt aca tca tct 1802

His Ala Glu Glu Val Gly Leu Arg His Pro Thr Thr Val Thr Ser Ser

140 145 150 155

tca aaa aat atc aag gct gca gaa gcg gtt cag gat tta ttc atg aac 1850

Ser Lys Asn Ile Lys Ala Ala Glu Ala Val Gln Asp Leu Phe Met Asn

160 165 170

cag cat ttc cgc gtc tat aca aat ccc gat atg atc ggt gtt gaa ata 1898

Gln His Phe Arg Val Tyr Thr Asn Pro Asp Met Ile Gly Val Glu Ile

175 180 185

ggg gga gcg tta aaa aat atc atc gct ctt gca gcg ggg att aca gac 1946

Gly Gly Ala Leu Lys Asn Ile Ile Ala Leu Ala Ala Gly Ile Thr Asp

190 195 200

gga ttg gga tac gga gat aat gca aaa gcg gcc tta atc acc cga ggt 1994

Gly Leu Gly Tyr Gly Asp Asn Ala Lys Ala Ala Leu Ile Thr Arg Gly

205 210 215

ctt gct gaa atc gcc aga ctc ggc aca aag atg ggc gga aat ccg ctc 2042

Leu Ala Glu Ile Ala Arg Leu Gly Thr Lys Met Gly Gly Asn Pro Leu

220 225 230 235

acc ttt tcc ggc ctg acc ggc gta ggc gat tta atc gtg acg tgt aca 2090

Thr Phe Ser Gly Leu Thr Gly Val Gly Asp Leu Ile Val Thr Cys Thr

240 245 250

agc gtt cat tcc cga aac tgg cgc gcc ggc aac ctg ctc ggc aaa gga 2138

Ser Val His Ser Arg Asn Trp Arg Ala Gly Asn Leu Leu Gly Lys Gly

255 260 265

tat aag ctg gaa gct gtc ctg gat aag atg ggg atg gtt gtt gaa ggc 2186

Tyr Lys Leu Glu Ala Val Leu Asp Lys Met Gly Met Val Val Glu Gly

270 275 280

gtg cgg acg acg aaa gct gcg tat cag ctg tct caa aaa tat cag gtg 2234

Val Arg Thr Thr Lys Ala Ala Tyr Gln Leu Ser Gln Lys Tyr Gln Val

285 290 295

aaa atg ccg atc aca gaa gcg ctt cac caa gta tta ttt aat ggg cag 2282

Lys Met Pro Ile Thr Glu Ala Leu His Gln Val Leu Phe Asn Gly Gln

300 305 310 315

aag gta gaa act gcc gta gaa tcc tta atg gcc aga gtg aaa acc cat 2330

Lys Val Glu Thr Ala Val Glu Ser Leu Met Ala Arg Val Lys Thr His

320 325 330

gag atg gaa gac ttg gtc aac aca ttc gaa aac cgg gtg aag 2372

Glu Met Glu Asp Leu Val Asn Thr Phe Glu Asn Arg Val Lys

335 340 345

tgacaataac atgccgtcag catattctga agtgacgaaa gtacaaaacg cagaactctc 2432

cggctgaaat cgcttaaaac atttgctgat ttaggcagaa gaggatgcag acgtacgcat 2492

ctacgcatac tatagcatcg aagtccaaga gagtgtatct cagacgtaca ggtgaatata 2552

gtcaacttga ctgaagcaaa gtccccctct ttgcttcagt ttttttgttt tttcaataga 2612

tggaaaacct gttgatcttt tcaacatttg tatattaaaa tgaaatataa cgcttacaat 2672

gatgggacgg ggggcacgaa cgtgagtgtg gcattgatga aaatgtggtt tgcgcttggt 2732

gctatgggat taatgtttgt tgcggtcgcc tctatttatg tcagcaggta caaagtgaaa 2792

aacaaactga taaaagcagc ggtttcttca ctcgcttatg cctgcatggt catctcggga 2852

ttgatcgtgt taatggtcgt tttcagcggg cctgtcaatg aataaagcca aaagggggcg 2912

cggaatgcat aagttaaaaa tggccgtcat aacggcaatg gcggtgcttc tgctgtcggg 2972

ctgtctgtac cctgaagcaa aaaaaactga aaataaagta tcttacaaac atcagcttca 3032

gcaggtgcaa gcggcagtgg atgaatttaa aaaggcgaac ggcggacttc tgccgattca 3092

gacaaaagat atgaaaacac cgctctatca aaaatatccg atagatttta agcggctcgc 3152

gcccagatac atcgaggagc cgccggcctc agcttatgaa agcggaggaa tgtaccaata 3212

cgtgcttgtc gatgtggaaa ataagccgac cgtcaagctg gtcgatctcc aaatggcgga 3272

agcaatccgc gacatgaagc tgcgtgtcaa aatgtatcag gaaaagcata catatcctcc 3332

ctatgaggac gctgtttcaa aagggctgtt cactttaaat aaaaaaaagc tcggcatgaa 3392

agactctcct tcagtcaaaa gtccggtttc aggcacgtct ctgccgcttt taatcggcgc 3452

tgacggagaa atctatgccg actatcgcgt cgatctcgcc cgctgcctga aggaaaacaa 3512

aaagaaaatc aaaccggggg cggaaattca ggatatttta tggaaagaga ctcctttcgt 3572

cccggccttt tcagtcacat acaccgtaaa tgaaaaacag gaacccgttt ttttagaaag 3632

tcaaacgaaa caggaatgaa cctttttccc gcgcatacaa atagggagaa aggttttttt 3692

gattttgata gaaaagactg cct 3715

<210>2

<211>345

<212>PRT

<213>解淀粉芽孢杆菌

<400>2

Met Lys Lys Val Ala Met Leu Gly Ala Gly Ser Trp Gly Thr Ala Leu

1 5 10 15

Ser Leu Val Leu Ala Asp Asn Gly His Gln Val Met Met Trp Gly His

20 25 30

Arg Ala Glu Leu Ile Asp Gln Ile Asn Glu Leu His Glu Asn Lys Asp

35 40 45

Tyr Leu Pro Gly Val Glu Leu Ser Ser Ser Ile Ile Gly Thr Ala Asp

50 55 60

Leu Ser Glu Ala Leu Lys Gly Ala Asp Phe Ile Ile Val Ala Val Pro

65 70 75 80

Thr Lys Ala Ile Arg Glu Val Leu Lys Lys Ala Leu Pro Tyr Ile Pro

85 90 95

Lys Gln Ser Ile Phe Val His Val Ser Lys Gly Ile Glu Pro Asp Ser

100 105 110

Leu Leu Arg Ile Ser Glu Leu Met Glu Glu Glu Leu Pro Glu Glu Tyr

115 120 125

Arg Lys Asp Ile Val Val Leu Ser Gly Pro Ser His Ala Glu Glu Val

130 135 140

Gly Leu Arg His Pro Thr Thr Val Thr Ser Ser Ser Lys Asn Ile Lys

145 150 155 160

Ala Ala Glu Ala Val Gln Asp Leu Phe Met Asn Gln His Phe Arg Val

165 170 175

Tyr Thr Asn Pro Asp Met Ile Gly Val Glu Ile Gly Gly Ala Leu Lys

180 185 190

Asn Ile Ile Ala Leu Ala Ala Gly Ile Thr Asp Gly Leu Gly Tyr Gly

195 200 205

Asp Asn Ala Lys Ala Ala Leu Ile Thr Arg Gly Leu Ala Glu Ile Ala

210 215 220

Arg Leu Gly Thr Lys Met Gly Gly Asn Pro Leu Thr Phe Ser Gly Leu

225 230 235 240

Thr Gly Val Gly Asp Leu Ile Val Thr Cys Thr Ser Val His Ser Arg

245 250 255

Asn Trp Arg Ala Gly Asn Leu Leu Gly Lys Gly Tyr Lys Leu Glu Ala

260 265 270

Val Leu Asp Lys Met Gly Met Val Val Glu Gly Val Arg Thr Thr Lys

275 280 285

Ala Ala Tyr Gln Leu Ser Gln Lys Tyr Gln Val Lys Met Pro Ile Thr

290 295 300

Glu Ala Leu His Gln Val Leu Phe Asn Gly Gln Lys Val Glu Thr Ala

305 310 315 320

Val Glu Ser Leu Met Ala Arg Val Lys Thr His Glu Met Glu Asp Leu

325 330 335

Val Asn Thr Phe Glu Asn Arg Val Lys

340 345

<210>3

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>3

gctgttaagc cgccgagctt cgttg 25

<210>4

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>4

taatcccata gcaccaagcg caaaccac 28

<210>5

<211>23

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>5

cgacaaaagc cattcgggaa gtg 23

<210>6

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>6

tccgcgtcta tacaaatccc g 21

<210>7

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>7

cgtaggcgat ttaatcgtga c 21

<210>8

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>8

aatgaaagcg tctagattga aagg 24

<210>9

<211>28

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>9

catgtttgat tggtaccttt ttattttc 28

<210>10

<211>21

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>10

aagcgaaggt acccctcttt g 21

<210>11

<211>32

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>11

cctatttgaa tatgacatct ctagaaaatt tc 32

<210>12

<211>25

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>12

cgaatccggc acgcttgtgg atttg 25

<210>13

<211>29

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>13

ccgtcccatc attgcatgcg ttatatttc 29

<210>14

<211>34

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>14

gctaaaatct attattccgc ggttcagcaa tcgg 34

<210>15

<211>30

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>15

gtccattcac tatccgcggt cccttttcag 30

<210>16

<211>24

<212>DNA

<213>人工序列

<220>

<223>引物

<400>16

gaaggtgtga cgtctgcgga tgaa 24

权利要求书(按照条约第19条的修改)

1.一种用于产生一种或一种以上靶多肽的表达系统，其包含宿主细胞，在所述宿主细胞的基因组中，编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，并且所述宿主细胞经包含编码所述靶多肽和3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列的染色体外元件转化，由此所述宿主细胞基因组与所述染色体外元件都不携带抗生素抗性基因。

2.根据权利要求1所述的表达系统，其特征在于，所述染色体外元件为质粒、噬菌体、噬菌粒或转座子。

3.根据权利要求1或2中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述染色体外元件包含对应于编码所述宿主细胞的内源性3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列的DNA序列；编码相关3-磷酸甘油脱氢酶或外来3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列。

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述编码2-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列处于弱启动子的控制下。

5.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述弱启动子为位于图7中质粒pUB 110的gpsA基因的下游的启动子。

6.根据权利要求4所述的表达系统，其特征在于，所述弱启动子为来自枯草芽孢杆菌(B.subtilis)的ptsH启动子。

7.根据权利要求1至6中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述编码所述内源性3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列基本上精细缺失，并且不会在相邻区域引起突变或读框移位。

8.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞是源自革兰氏阳性(Gram-positive)细菌细胞。

9.根据权利要求8所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞是源自葡萄球菌属(Staphylococcus)、棒杆菌属(Corynebacterium)或芽孢杆菌属(Bacillus)的细胞。

10.根据权利要求9所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞是源自解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)。

11.根据权利要求10所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞为以寄存编号DSM18878寄存的解淀粉芽孢杆菌RH 1626。

12.根据权利要求1至7中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述宿主细胞是源自革兰氏阴性细菌细胞。

13.根据权利要求1至12中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述靶肽是选自水解酶、果胶降解酶、蛋白水解酶或脂肪分解酶。

14.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列是选自：

a)SEQ ID NO：1的核苷酸序列，

b)编码SEQ ID NO：2的蛋白质序列的DNA序列，

c)在严格条件下与a)或b)的序列杂交的DNA序列，

d)因遗传密码简并性而与a)、b)或c)的序列相关的DNA序列，或

e)所述序列a)到d)的互补链。

15.一种在无抗生素情况下产生靶多肽的方法，其特征在于，根据权利要求1至14中任一权利要求所述的表达系统是在表达所述靶多肽的条件下生长，并分离出由此所表达的靶多肽。

16.一种根据权利要求1至14中任一权利要求所述的表达系统的用途，其用于在无抗生素情况下产生靶多肽。

Claims

4.根据权利要求1至3中任一权利要求所述的表达系统，其特征在于，所述编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列处于弱启动子的控制下。

14.一种与宿主细胞基因组互补的载体，在所述宿主细胞基因组中，编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列失活，或者部分或完全缺失，所述载体包含编码所述靶多肽的DNA序列，以及编码所述3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列，由此所述载体不含抗生素抗性基因。

15.根据权利要求14所述的载体，其特征在于，所述编码所述3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列对应于编码所述宿主细胞中待互补的基因组的内源性3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列。

16.一种宿主细胞，其特征在于，基因组中缺失编码3-磷酸甘油脱氢酶的DNA序列，并且所述宿主细胞经根据权利要求14或15中任一权利要求所述的载体转化。

17.一种在无抗生素情况下产生靶多肽的方法，其特征在于，根据权利要求1至12中任一权利要求所述的表达系统或根据权利要求16所述的宿主细胞是在表达所述靶多肽的条件下生长，并分离出由此所表达的靶多肽。

18.根据权利要求1至13中任一权利要求所述的表达系统或根据权利要求16所述的宿主细胞的用途，其用于在无抗生素情况下产生靶蛋白。

19.一种编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的DNA序列，其特征在于，所述DNA序列是选自：

a)包含SEQ ID NO：1的核苷酸序列的DNA序列，

b)包含由SEQ ID NO：1中的核苷酸1338到2375表示的核苷酸序列的DNA序列，

c)由质粒pTP01编码的DNA序列，所述质粒pTP01具有图4的质粒图并且是以寄存编号DSM 18890寄存，

d)编码SEQ ID NO：2的蛋白质序列的DNA序列，

e)在严格条件下与a)、b)、c)或d)的DNA序列中的一者杂交的DNA序列，

f)因遗传密码简并性而与a)、b)、c)、d)或e)的DNA/核苷酸序列相关的DNA序列，和

g)a)到f)的序列的互补链。

20.根据权利要求19所述的DNA序列，其特征在于，所述序列是源自芽孢杆菌。

21.根据权利要求20所述的DNA序列，其特征在于，所述序列是源自解淀粉芽孢杆菌。

22.一种核酸序列，其包含一个根据权利要求19至21中任一权利要求所述的序列的类似物，其特征在于，所述序列编码具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽，以及

a)与一个所述序列展现至少77％的一致性，或

b)在严格条件下与一个所述序列杂交，或

c)为一个所述序列的等位基因变异体，或

d)为a)到c)的序列中的一者的互补链，

由此，所述序列可通过SEQ ID NO：1的DNA序列中一个或一个以上核酸的取代、缺失、插入、添加或突变而获得。

23.一种具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽，其是选自：

a)由根据权利要求19至22中任一权利要求所述的DNA序列的编码片段编码的多肽，

b)具有SEQ ID NO：2的序列或可通过所述SEQ ID NO：2的序列中一个或一个以上氨基酸的取代、添加和/或缺失而获得的序列的多肽，

c)具有与SEQ ID NO：2中的氨基酸1到345展现至少77％一致性的序列的多肽，

d)由在严格条件下与以下序列杂交的核酸序列编码的多肽：

(i)SEQ ID NO：1中的核苷酸1338到2375，

(ii)(i)中具有至少100个核苷酸的一部分序列，或

(iii)(i)或(ii)的互补链，

e)具有SEQ ID NO：2的多肽的变异体，其包含一个或一个以上氨基酸的取代、缺失和/或插入，

f)所述氨基酸序列a)到e)的等位基因变异体。

24.根据权利要求23所述的多肽，其特征在于，所述多肽是源自解淀粉芽孢杆菌。

25.一种表达构筑体，其包含：

(i)根据权利要求19至22中任一权利要求所述的核苷酸序列，或编码根据权利要求23或24中任一权利要求所述的多肽的核苷酸序列，所述序列与以下序列(ii)可操作性连接，

(ii)一个或一个以上控制适当宿主细胞中具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的表达的序列。

26.根据权利要求25所述的表达构筑体，其特征在于，所述控制所述3-磷酸甘油脱氢酶基因的表达的序列为组成性启动子。

27.根据权利要求25或26所述的表达构筑体，其特征在于，所述控制所述3-磷酸甘油脱氢酶的表达的序列为弱启动子。

28.一种宿主细胞，其包含根据权利要求25所述的表达构筑体。

29.一种产生具有3-磷酸甘油脱氢酶活性的多肽的方法，其特征在于，使根据权利要求27所述的宿主细胞在适于表达所述多肽的条件下生长，并且随后回收所述多肽。

30.一种根据权利要求19至22中任一权利要求所述的DNA序列的用途，其用于产生根据权利要求1至13中任一权利要求所述的表达系统。