KR100399262B1 - 한우 유래 락토페린 발현용 재조합 곰팡이 균주 및이로부터 얻은 재조합 한우 락토페린 - Google Patents

한우 유래 락토페린 발현용 재조합 곰팡이 균주 및이로부터 얻은 재조합 한우 락토페린 Download PDF

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Abstract

본 발명은 한우 유래 락토페린 발현용 재조합 곰팡이 균주 및 이로부터 얻은 재조합 한우 락토페린에 관한 것으로 본 발명은 한우 유래 락토페린 유전자가 도입된 재조합 벡터 pMKLF로 형질전환된 본 발명 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2(기탁번호 KCTC 0682BP)를 발효배양하여 항균활성이 우수한 재조합 한우 락토페린을 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있다.

Description

한우 유래 락토페린 발현용 재조합 곰팡이 균주 및 이로부터 얻은 재조합 한우 락토페린{Recombinant fungi strain for expressing lactoferrin derived from Bos taurus Coreanae and the recombinant cattle lactoferrin obtainable therefrom}
본 발명은 한우 유래 락토페린 발현용 재조합 곰팡이 균주 및 이로부터 얻은 재조합 한우 락토페린에 관한 것이다. 더욱 상세하게는, 본 발명은 한우로부터 유래한 락토페린 유전자로 재조합된 벡터에 의해 형질전환된 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2 및 이를 배양하여 얻은 재조합 한우 락토페린에 관한 것이다.
최근 축산 및 식품분야에서 많은 문제가 되고 있는 항생제 오ㆍ남용 및 잔류성 문제로 가축 및 식품으로의 항생물질 잔류 및 이로 인한 내성문제 등이 매우 심각한 사회문제로 대두되고 있는 실정이다. 따라서 축산물의 안정성을 높이고, 축산물의 생산성을 동시에 갖출 수 있는 항생제 대체물질의 필요성이 절실히 요구되고 있다. 또한 현재 세균감염에 의해 발생할 수 있는 여러 질병의 치료를 위해 사용되는 기존의 항생제를 대체할 수 있는 천연항생물질에 대한 요구가 높아지고 있으며, 장내 부패 균총에 대한 광범위한 항균작용 및 여러 가지 생리활성을 갖는 천연항생물질로 사료첨가제 및 식품ㆍ의약품 대체제로 유용하게 이용될 수 있을 것이다.
한편, 락토페린은 영양물질과 각종 세균이나 이종단백질로부터 수유기 새끼를 방어할 수 있는 생리활성 물질이 포함되어 있는데 광범위한 항 미생물 활성을 가지며 점막부위, 소화기관, 초유 등에서 외부항원에 대한 방어 시스템의 중요한 구성성분으로 알려져 있다. 이와 같이 광범위한 항 미생물 효과를 가지고 있는 락토페린은 항생제의 효능과 유사하여 최근 문제가 되는 항생제 과다사용, 내성문제 및 축산물의 잔류성 문제를 해결할 수 있는 물질이다. 이러한 락토페린은 주로 우유의 유청으로부터 분리되었으나, 최근에는 락토페린을 유전공학적인 방법으로 대량생산 하려는 시도가 많이 이루어지고 있으며 결과적으로 그 생산량과 다양성이 많이 향상되었다.
그러나 아직까지 한우 유래 락토페린 유전자를 곰팡이 균주에 도입하여 배양하므로써 재조합 한우 락토페린을 대량 생산하는 방법은 없었다. 따라서 본 발명자들은 항생제와 거의 유사한 항미생물 활성을 보이는 한우 유래 항균성 락토페린을 생산하는 재조합 곰팡이 균주 개발과 이를 이용한 천연 항생물질인 재조합 한우 락토페린을 개발하고자 연구한 결과, 한우로부터 락토페린 유전자를 분리하여 이를 함유하는 재조합 발현벡터를 구축하고 이들 재조합 발현벡터를 이용하여 숙주 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeRIB40을 형질전환시켜 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 얻은 후 이를 배양하여 락토페린을 대량 생산함으로서 기존항생제를 대체하는 천연 항생물질을 얻었으므로써 본 발명을 완성하였으며 상기 재조합 곰팡이 균주는 산업용 균주로 육종하여 유용 대사산물을 효과적으로 생산할 수 있어 그 산업적 가치가 매우 크다.
따라서, 본 발명의 목적은 한우(Bos taurus Coreanae)로부터 유래한 락토페린 유전자가 도입된 재조합 벡터 pMKLF를 제공함에 있다. 본 발명의 다른 목적은 상기 재조합 벡터 pMKLF에 의해 형질전환된 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2(기탁번호 KCTC 0682BP)를 제공함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은상기 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 배양하여 재조합 한우 락토페린을 대량 생산함에 있다. 본 발명의 또 다른 목적은 상기 재조합 한우 락토페린 및 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 함유하는 사료를 제조함에 있다.
본 발명의 상기 목적은 한우의 조직으로부터 분리한 전체 RNA로부터 프라이머를 이용해 락토페린만을 선택적으로 PCR 증폭한 후 벡터 pFGC33에 증폭한 유전자를 삽입하여 재조합 발현벡터 pMKLF를 제작하고 이 발현벡터로 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeRIB40를 형질전환시켜 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 얻은 후 이 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 발효배양하여 재조합 한우 락토페린을 얻었다. 이어서, 상기 재조합 한우 락토페린의 병원성 미생물에 대한 항균활성을 조사한 후 사료제조시에 첨가제로 일정량 첨가하여 사료를 제조함으로서 달성하였다.
이하, 본 발의 구성 및 작용을 설명한다.
도 1은 본 발명에서 숙주 곰팡이 균주로 사용한Aspergillus oryzaeRIB40이 성장하여 자실체를 형성한 사진도이다.
도 2는 본 발명 재조합 한우 락토페린 생산을 위해 한우로부터 유래한 락토페린 유전자가 도입된 재조합 발현벡터 pMKLF의 구축 모식도이다.
도 3은 본 발명 재조합 발현벡터와 함께 숙주 곰팡이 균주에 도입되는 선택마커 pDE·argB의 구축 모식도이다.
도 4는 본 발명 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 배양한 모습을 나타낸 사진도이다.
도 5는 본 발명 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 배양하여 얻은 배양액의 병원성 미생물Aspergillus niger6278,E.coliMV1184,Salmonella typhimuriumKCCM40253에 대한 항균력을 각각 나타낸 사진도이다.
본 발명은 아르기닌 탈수소효소(Arginine dehydrogenase)활성이 결여된 영양요구주Aspergillus oryzaeRIB40 균주를 외래 단백질 생산을 위한 숙주 균주로서 선별하여 배양하는 단계; 한우의 조직으로부터 전체 RNA을 분리하고, 분리된 RNA를RT-PCR로 증폭하여 cDNA를 분리하는 단계; 프라이머를 이용하여 상기 cDNA 중 한우 락토페린에 해당되는 부위를 선택적으로 PCR로 증폭하는 단계: 상기 증폭한 한우 락토페린 및 한우 락토페린 항균성 폴리펩타이드 cDNA 시그널 염기서열을 절단하여 변형시킨 한우 락토페린 유전자를 벡터인 pFGC33에 라이게이션 시켜E. coliDH5-α 균주에 도입하여 형질전환 시킨 후 이 형질전환체로부터 한우 락토페린을 발현 시킬 수 있는 재조합 벡터 pMKLF를 분리하는 단계: 상기 재조합 벡터 pMKLF와 함께 코-트랜스포메이션(co-transformation)에 이용되는 선택마커(selection marker) pDE·argB를 구축하는 단계; 숙주 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeRIB40를 상기 재조합 벡터 pMKLF와 선택마커 pDE·argB로 형질전환시켜 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 얻는 단계; 상기 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 배양하여 얻은 배양액으로 부터 한우 락토페린 게놈 DNA를 정제한 후Aspergillus oryzae의 염색체 DNA내로 한우 락토페린 유전자가 도입됨을 PCR과 서던 블럿(Southern blot)으로 확인하고 상기 재조합 곰팡이 균주가 생산한 재조합 한우 락토페린의 병원성 미생물에 대한 항균활성을 저해환 측정법으로 조사하는 단계; 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 EDTA (ethylenediaminetetraacetic acid)와 PMSF(phenylmethylsulfonyl fluoride)가 첨가된 DPYA(dextrin polypepton yeast extract ammonium sulfate) 배지에서 발효배양하여 재조합 한우 락토페린을 대량 발현시키는 단계 및; 상기 대량 발현시켜 생산한 재조합 한우 락토페린을 사료제조시에 첨가하여 기능성 사료를 제조하는 단계로 구성된다.
본 발명에서 사용한 숙주 곰팡이 균주인Aspergillus oryzaeRIB40은 일본 동경대학교 이병로 박사에게서 분양받았으며 상기Aspergillus종(species)은 편모성 곰팡이(filamentous fungi)로써 Eumycota(門), Plectomycetes(鋼), Eurotiales(目), Eurotiaceae(科)에 속하며 유성생식을 가지지 않는 균류(불완전 세대)이고 사상의 균사(hyphae)를 갖는 비광합성 균류이다. 균사는 영양분을 섭취하여 선단생장(apical growth)하며 공기중에 돌출된 균사(기균사)의 선단에는 무성적으로 포자를 착생시켜 자실체를 만든다.Aspergillusspecies 중Aspergillus oryzae는 α-아밀로오스(α-amylase)(12g/L), 글루코아밀라아제(glucoamylase), 글루코실트랜스퍼라아제(glucosyltransferase), 리파제(lipase), 펙틴나아제(pectinase) 등의 효소와 보빈 키모신(bovine chymosin)(2.5mg/L), 인간 락토페린(human lactoferrin), 식물 타우마틴(plant thaumatin), 뮤코 미헤이 산 프로테아제(Mucor miehei acidic protease)(3.3g/L) 등의 이종 단백질을 생산하였으며, 미국의 경우에 그 안정성(generally recognized as safe: GRAS) 면에서도 인정을 받았다.
본 발명에서 재조합 한우 락토페린의 항균 활성 실험에 사용된E. coliMV1184 균주는 상기Aspergillus oryzaeRIB40과 함께 일본 동경대학교 이병로 박사에게서 분양 받았으며,Aspergillus nigerKCTC 6278은 한국 유전자원 센타 유전자 은행(KCTC)에서 분양 받았고,Salmonella typhimuriumKCCM 40253은 한국 종균 협회(KCCM)에서 분양을 받았다.
본 발명에서 사용한 모든 제한효소는 Takara 사에서 구입하였고 올리고 누클레오타이드 프라이머는 Bioneer사에서, DPYA 배지 및 최소배지(MM)는 Difco사에서,EDTA 와 PMSF는 Sigma 사에서 구입하였으며 단백질 전기영동 등에 사용되는 시약 및 기구는 Bio-Rad 사 제품을 이용하였다.
이하, 실시예를 통해 본 발명을 더욱 상세하게 설명하고자 하지만 본 발명의 권리범위는 이들 실시예에만 한정되는 것은 아니다.
실시예 1 : 재조합 곰팡이 균주 Aspergillus oryzae SKM2을 이용한 한우 락토페린의 생산
제 1 공정: 한우 락토페린의 생산을 위한 최적의 숙주세포 선별
본 공정에서는 아르기닌 탈수소 효소(Arginine dehydrogenase) 활성이 결여된 영양요구주Aspergillus oryzaeRIB40 균주를 공시균주로 이용하였다.Aspergillus oryzaeRIB40은 PDA(Potato Dextrose Agar)나 아르기닌(arginine)이 첨가된 MM(Minimal Medium : 10% 10×stock solution, 0.2% trace element solution, 1.2M sorbitol, 40% glucose, 1M MgSO4,Agar)이나 DPYA(dextrin polypepton yeast extract ammonium slfate) 배지에서 진탕 배양하거나 평판배양을 실시하였다. 본 숙주 곰팡이 균주는 도 1에 나타낸 바와 같으며 자실체가 형성되어 있다.
제 2 공정: 한우 조직으로부터 전체 RNA와 RT-PCR을 이용한 cDNA의 분리
한우의 간, 유선, 창자, 고환조직 10mg을 액체질소로 분쇄하고 catrimox 1mL을 넣고 실온에서 10분정도 방치한 후 원심분리로 팰렛(pellet)을 분리한 다음 0.1% DEPC H2O로 씻어(rinse)내고, 2M LiCl을 넣어 실온에 방치한 후 원심분리로 펠렛(pellet)을 분리하고 다시 70% 에탄올로 씻고 RNA를 전기영동으로 로딩(loading)하여 조사하였다. 전체 RNA 분리에 이용된 키트(kit)는 Takara사에서 만든 Catrimox-14TMRNA Isolation Kit ver 2.11을 이용하였다. 이어서 RT-PCR 분리를 위해 Boehringer Mannheim사에는 만든 TitanTMone tube RT-PCR system 키트를 이용하여 증폭 시킴으로써 cDNA를 분리하였다.
제 3 공정: PCR을 이용한 한우 락토페린 유전자의 증폭
제 2 공정에서 얻은 한우 락토페린 유전자 cDNA로부터 락토페린 전체 부위 즉, 시작 코돈과 종결 코돈의 해당부위를 선택적으로 증폭하기 위하여 프라이머(primer)를 디자인하였다. 이때 프라이머는 증폭시킨 유전자를 벡터에 구축(construction)하기 위해 벡터 pFGC33이 가지고 있는 프로모터 글루코아밀라제 암호화 유전자(glucoamylase encoding gene;glaA) 사이에 제한효소HindⅢ 부위에 맞게 디자인 하였다. 따라서 제작한 프라이머는 하기와 같으며 PCR 반응 조건은 표 1에 나타낸 바와 같이 디내츄레이션은 94℃에서, 어닐링은 50℃에서, 폴리메리제이션은 72℃에서 실시하여 30번 반복하였으며 최종 확장을 72℃에서 6분동안 실시하였다.
A: KCN 5' AAAGCTTCAGGTGGCAGACCTTCGTTC
HindⅢ
B: KCC 5' TCAGCTTCGGCTTTACCTCGTCAGGAAG
HindⅢ
PCR에 사용한 프라이머
PCR 반응조건
반 응 조 건 시 간 사이클 수
열 사이클 디내츄레이션 94℃ 1초 30 사이클
94℃ 1분
어닐링 50℃ 1초
50℃ 2분
폴리메리제이션 72℃ 1초
72℃ 3분30초
최종 확장 72℃ 6분
소크 4℃
제 4 공정: 재조합 발현벡터 구축
제 3 공정에서 PCR 증폭하여 얻은 한우 락토페린 유전자를 제한효소HindⅢ로 처리하고, 마찬가지로 pFGC33 벡터도HindⅢ로 처리한 다음 상기 락토페린 유전자와 라이게이션(ligation) 시켰다. 라이게이션 산물(Ligation product)을E. coliDH5-α 균주에 형질전환하여 형질전환체를 얻었다. 이렇게 형질전환된 형질전환체로부터 한우 락토페린을 발현시킬 수 있는 재조합 플라스미드(Recombinant plasmid)인 pMKLF 벡터를 분리하였다. 발현벡터 모식도는 도 2에 나타낸 바와 같다.
제 5 공정: 선택마커(selectation marker)의 구축
한우 락토페린의 선택마커(selectation marker)는Aspergillus속 형질전환에 사용되어지는 선택마커 중의 하나로 오리니틴 카바모일트랜스퍼라아제 (Orinithine carbamoyltransferase;OTase)를 암호화하는 유전자(coding gene)를 가진argB유전자를 이용한 것으로 먼저 pTAex3 벡터를 제한효소PstⅠ으로 처리하고, 또 다른 벡터 pDE도 동일한 제한효소로 처리한 다음 라이게이션 시켰다. 이 라이게이션 산물(pDEㆍargB)을E. coliDH5-α에 형질전환하여 배양하므로써 형질전환체로 선택마커 pDE·argB를 얻었다. 이 과정의 모식도를 도 3에 나타냈다.
제 6 공정: 재조합 곰팡이 균주 Aspergillus oryzae SKM2 제조
본 공정에서Aspergillus의 형질전환은 상기 제 5 공정에서 제조한 선택마커(selection marker)와 함께 코-트랜스포메이션(co-transformation)방법으로, 첫째, 포자현탁(spore suspension)과 원형질체(protoplast) 형성, 둘째, 원형질체(protoplast)의 분리와 정제, 셋째, PEG(Polyethylene Glycol)와 CaCl2를 이용한 발현 벡터 및 선택마커(selection marker)를 원형질체(protoplast) 내로 도입하여 형질전환(transformation)을 시키는 3단계로 진행하였다. 유전자 재조합으로 만든 재조합 벡터 pMKLF를 숙주 곰팡이인Aspergillus oryzaeRIB40에 도입 시키기 위해 Tilburn, J.(Tilburn, J., G. G. Taylor. and R. W. Davies. Transformationby integrationAspergillus nidulans. Gene. vol.26, 205-221(1983))등의 방법으로 형질전환을 수행하였다. 숙주로 사용할 곰팡이Aspergillus oryzaeRIB40를 0.1% Tween80 2mL로 잘 현탁하여 YPD배지에 넣고 30℃에서 mid-log phase(OD600＝0.6∼1.0) 까지 배양(20∼24시간)한 후 3G1 유리필터(glass filter)(100∼120㎛, IWAKI Co. Japan)에서 균체만을 회수한 후에 용해 효소(lysing enzyme) 0.1g과 TF solutionⅠ(0.27M CaCl2, 0.6M NaCl) 20mL을 넣고 30℃ water shaking incubator에서 2시간 반응 후 3G3 유리 필터(glass filter)(20∼30㎛, IWAKI Co. Japan) 위에 Myracloth을 얹고 배양액을 붓었다. 이 배양액에 TF soutionlⅡ｛1.2M Sorbitol, 50mM CaCl2, 35mM NaCl, 10mM Tris(pH 7.5)｝ 5mL을 넣고, 얼음(ice)에서 5분 방치한 후 원심분리(3,000rpm, 10분, 4℃)하여 펠렛(pellet)을 회수한 후 다시 TF solutionⅡ 10mL을 넣고 얼음(ice)에서 5분 반응시킨 후 원심분리하여 펠렛을 회수하였다. 그 다음에 TF solutionⅡ 1mL로 현탁한 후 재조합 벡터 pMKLF 10㎕와 선택마커(selectable marker) DNA인 pDE·argB 10㎕을 넣고 상온에서 25분간 반응시켰다. 이어서, TF solutionⅢ｛60% PEG4000, 50mM CaCl2, 10mM Tris(pH 7.5)｝을 125㎕씩 두 번 나누어 넣고 마지막에 425㎕을 넣고 잘 현탁하여 상온에서 20분간 반응시킨 후 원심분리해서 회수한 펠렛(pellet)을 TF solutionⅡ 500㎕ 넣고 MM 배지에 스프래딩(spreading)하고 여기에 0.6% Top agar(NO3, sorbitol, glucose)를 부어 중층배지를 만들었다. 30℃배양기(incubator)에 4∼5일간 배양(incubation)시켰다. 이렇게 형질전환된 형질전환체를 DPYA 배지에서 배양하여 한우 락토페린의 게놈 DNA(genome DNA)를 정제하여 제 3 공정에서 사용한 프라이머 A와 B를 사용하여 PCR 반응시킨 후 한우 락토페린 유전자를 프로브로 사용하여 서던 블롯(Southern blot)을 실시한 결과, 한우 락토페린 유전자가 삽입된 균을 최종 선별하였다. 형질전환된 재조합 곰팡이 균주는Aspergillus oryzaeSKM2는 도 4에 나타낸 바와 같다. 또 최종 선발된 형질전환체를 DPYA 배지에서 OD600＝1.0∼1.7까지 배양한 후, LB 한천 아가배지에Aspergillus niger6278,E.coliMV1184,Samonella typhimuriumKCCM 40253 균을 각각 고르게 도말한 중층배지 위에 배양한 시간대 별로 형질전환체 배양액 60㎕을 적신 종이 디스크를 상치하여 30℃에서 40∼48시간 배양한 후 생육 저해환(Growth inhibition zone)의 형성여부를 관찰하였다. 실험결과, 도 5에 나타낸 바와 같이 상기 3종의 균주에 대해 각각 저해환을 나타내 항균활성이 있음을 확인하였다.
본 발명 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2는 생명공학연구소내 미생물기탁센터에 1999년 11월 5일, 기탁번호 KCTC 0682BP로 기탁하였다.
실시예 2: Aspergillus oryzae SKM2의 발효배양에 의한 재조합 한우 락토페린 대량생산
상기 실시예 1에서 얻은 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2의 세포내에서 재조합 한우 락토페린의 생산 여부를 알아보기 위하여 DPYA(dextrinolypepton yeast extract ammonium sulfate)배지에 0.4% (NH4)2SO4을 넣고 pH 5.6로 만들어 포자 형성 배지(SMM, 10mL 10×저장용액, 0.1mL 미량 원소용액, 2g Bacter agar, 2% starch, 3% NaCl, 0.2mL 1M MgSO4)에서 자란 포자를 DPYA배양액 50mL에 48시간 동안 30℃에서 셰이킹(shaking) 하면서 배양하였다. 이를 종 배양(Seed culture)라고 하고, 종 배양으로부터 규모 확대(Scale up) 하기 위하여 50mL의 배양액이 든 배플 삼각 플라스크 배지를 5L 발효기에 무균적으로 접종하였다. 5L 발효기를 멸균한 다음 암모니아수 pH 5.6으로 조종하고 50mL 배양액을 접종하여 발효기 본 배양을 실시하였다. 발효 조건은 공기 공급량 1VVM (volume of air per volume of medium per minute), 교반속도 1000 rpm, 온도 30℃, pH 5.6으로 수행하였다. 프로테아제 저해제(Protease inhibitor)로서는 먼저 메탈로프로테이나아제 저해제(Metalloproteinase inhibitor)인 500mM EDTA 5mL(1mM/total volume)을 약 25∼30시간 사이에 첨가하고, 배양이 끝난 직후에 세린 프로테아제 저해제(serine proteinase inhibitor)인 100mM PMSF (phenyl methyl sulfonyl fluoride) 5mL(1mM/total volume)을 첨가한 후 배양액과 균체를 분리하였다. 본 발명에 사용된 배지는 삼각 플라스크 배지에서는 곰팡이 전용 복합배지인 PDB(Potato dextrose broth) 배지와 2% 수용성 전분(soluble starch), 0.2% 카사미노산(casamino acid)을 이용하였고, 5L 발효기에서는 DPYA(2% dextrin, 1% polypeptone, 0.5% yeast extract, 0.5% KH2PO4, 0.05% MgSO4, 0.4% (NH4)2SO4), 0.2% 카사미노산, 2% 수용성 전분(soluble starch)을 사용하였다. 재조합 한우 락토페린을 분리정제하기 위하여배양액을 Centriprep-50 (50KDa 이상, Amicon Co. USA)에 넣고 20mM 인산버퍼(phosphate buffer)(pH 8.0)로 버퍼(buffer) 교환을 하면서 원심분리를 하였다. 원심분리는 3,000rpm, 4℃에서 20분간 3회 반복하였다. 이렇게 배양하여 얻어진 재조합 한우 락토페린 양은 0.5g/L 정도가 생산됨을 확인하였다.
이때, 상기 포자형성 배지에서 저장용액은 NaNO36%, KCl 0.52%, KH2PO41.52%을 함유하고 pH 6.5을 하였으며 미량원소 용액은 FeSO4·7H2O 1%, ZnSO4·7H2O 0.88%, CuSO4·5H2O 0.04%, MnSO4·4H2O 0.015%, Na2B4O7·10H2O 0.01%, (NH4)6Mo7O24·4H2O 0.005g을 함유한다.
실시예 3: 재조합 한우 락토페린을 함유한 사료 제조
본 실시예에서는 상기 실시예 2에서 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 발효배양하여 얻은 재조합 한우 락토페린을 재조합 곰팡이 균체와 함께 사료 첨가제로 사용하여 사료를 제조하였다. 발효배양이 끝난 배양액으로부터 부형제(carrier)로 혼합건조된 사료제품에 사료 총중량에 대해 0.05 ~ 1.5% 범위로 형질전환된 재조합 곰팡이 균주와 재조합 한우 락토페린을 혼합하였다.
이상, 상기 실시예를 통하여 설명한 바와 같이 한우 유래 락토페린 유전자가 도입된 재조합 벡터 pMKLF로 형질전환된 본 발명 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 발효배양하여 항균활성이 우수한 재조합 한우 락토페린을 대량 생산하는 뛰어난 효과가 있으므로 생물의약 및 축산업상 매우 유용한 발명인 것이다.

Claims (6)

  1. 한우 유래 항균성 락토페린 유전자를 벡터 pFGC33에 삽입하여 제작한 재조합 벡터 pMKLF.
  2. 제 1 항 기재의 재조합 벡터 pMKLF를 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeRIB40에 도입하여 형질전환시킨 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2(기탁번호 KCTC 0682BP).
  3. 삭제
  4. 제 2 항 기재의 재조합 곰팡이 균주Aspergillus oryzaeSKM2를 NaNO36%, KCl 0.52%, KH2PO41.52%를 함유하는 저장용액, FeSO4·7H2O 1%, ZnSO4·7H2O 0.88%, CuSO4·5H2O 0.04%, MnSO4·4H2O 0.015%, Na2B4O7·10H2O 0.01%, (NH4)6Mo7O24·4H2O을 함유하는 미량원소용액, 박터아가(Bacter agar) 및 NaCl 3%, MgSO41M를 함유한 포자형성배지에서 성장시키는 단계;
    (NH4)2SO40.4%를 첨가한 DPYA(dextrin polypepton yeast extract ammonium sulfate) 배지에서 하룻밤 동안 셰이킹하면서 배양하여 종배양하는 단계;
    상기 종 배양하여 얻어진 배양액을 PDB(Potato dextrose broth) 배지, 수용성 전분 2%, 카사미노산 0.2%를 함유한 곰팡이 배양용 삼각플라스크 배지에 접종하여 배양하는 단계;
    DPYA(덱스트린 2%, 폴리펩톤 1%, 효모추출물 0.5%, KH2PO40.5%, MgSO40.05%, (NH4)2SO40.4%), 카사미노산 0.2%, 수용성 전분 2%를 함유하는 배지를 5L 발효조에 넣고, 상기 삼각플라스크 배지에서 배양하여 얻어진 배양액을 상기 5L 발효조에 접종한 후, 공기 공급량 1VVM, 교반속도 1000rpm, 온도 30℃, pH 5.6의 발효조건에서 본 배양을 실시하는 것을 특징으로 하는 재조합 한우 락토페린 제조방법.
  5. 삭제
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