KR100255269B1 - 인간성장호르몬의 대량생산을 위한 do­stat 유가식배양방법 - Google Patents

인간성장호르몬의 대량생산을 위한 do­stat 유가식배양방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 인간성장호르몬(human growth hormone: hGH)의 대량생산을 위한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가식 배양방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 살모넬라 균주의 L-아라비노즈 오페론을 이용한 유도성의 hGH 융합단백질 발현벡터를 포함하는 재조합 대장균을 초기배양배지에서 회분식으로 배양하다가, 용존산소의 양이 급격히 증가할 때부터 유가배지에서 배양하면서 동시에 유가배양 시작시점에서 L-아라비노즈를 첨가하는 공정을 포함하는, hGH 대량생산을 위한 DO-stat 유가식 배양방법에 관한 것이다. 본 발명의 DO-stat 유가식 발효방법에 의하면, 회분발효 구간에서는 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 아라비노즈 오페론의 억제효과와 아세트산의 축적을 감소시키고, 용존산소의 양을 지표로 하는 유가배양 구간에서는 탄소원으로서 값싸고 이용효율이 우수한 포도당을 발현억제 최소농도 이하로 유지시킴으로써, hGH 융합단백질 발현 저해 문제를 해결하였다. 그리고, 산소첨가를 통하여 고농도의 세포배양 및 높은 수준의 발현량을 얻을 수 있었다. 또한 유가배양 시작시점에서 L-아라비노즈를 첨가하여 세포 성장, 플라즈미드 안정성 및 hGH 융합단백질의 발현량을 높은 수준으로 안정적으로 유지시키므로, 저렴한 생산비용으로 hGH를 대량 생산하게 된다.

Description

인간성장호르몬의 대량생산을 위한 ＤＯ­ｓｔａｔ 유가식배양방법
본 발명은 인간성장호르몬(human growth hormone: hGH)의 대량생산을 위한 DO(dissolved oxygen)-stat 유가식 배양방법에 관한 것이다. 좀 더 구체적으로, 본 발명은 살모넬라 균주의 L­아라비노즈(arabinose) 오페론을 이용한 유도성의 hGH 융합단백질 발현벡터를 포함하는 재조합 대장균을 포도당 이외의 탄소원을 포함하는 초기 배양배지에서 회분식으로 배양하다가, 용존산소의 양이 급격히 증가할 때부터 유가배지에서 배양하면서, 세포의 성장, 플라즈미드의 안정성 및 hGH 융합단백질의 발현량을 고려하여 선정된 최적의 발현 유도시기인 유가배양 시작시점에서 L­아라비노즈를 첨가하는 공정을 포함하는, hGH 대량생산을 위한 DO­stat 유가식 배양방법에 관한 것이다.
일반적으로, 재조합 대장균에 의한 재조합 단백질의 생산시 해당 프로모터 및 발현 단백질의 특성에 따라 세포 성장과 단위 세포당 발현량이 영향을 받게 된다. 강력한 프로모터에 의하여 단백질의 발현이 조절되는 시스템의 경우, 재조합 단백질의 발현속도가 빠르게 되면 숙주세포의 에너지 대사균형에 영향을 주어 세포의 성장을 저해할 수 있다. 특히, 발현 단백질이 숙주세포에 직접 악영향을 끼치는 경우에는 세포성장이 더욱 저해된다
또한, 재조합 단백질의 생산에 있어서 강력한 프로모터에 의한 단백질의 과다발현은 많은 경우에 플라즈미드의 안정성을 저하시킨다. 즉, 단백질의 유도 직후 플라즈미드의 급격한 감소현상이 나타나고, 이러한 현상과 더불어 재조합 단백질의 발현속도도 감소되는 것으로 보고되고 있다(참조: Park, S.H. et al., Biotechnol. and Bioeng., 36:493(1990)).
강력한 유도성 프로모터에 의한 단백질의 발현은 상기한 원인들로 인하여 숙주세포 자체에 큰 부담으로 작용하게 되는 바, 이러한 부담을 최소화시킬수록 재조합단백질의 대량생산이 달성된다. 상술한 조건을 고려한 최적의 발현시기는 동일한 발현벡터와 동일한 숙주세포를 사용하더라도 발현되는 단백질의 특성에 따라 그 시기가 다를 수 있으며 ,발현시기가 세포성장 및 발현에 미치는 영향의 경중에 있어서도 다를 수 있다. 이러한 시스템에서 재조합 단백질을 대량생산하기 위해서는 발효공정의 최적화를 통하여 상기 저해효과들을 최소화할 수 있고, 원하는 재조합 단백질의 생산성을 향상시킬 수 있다.
한편, 인간 성장호르몬(hGH)은 뇌하수체전엽 호르몬 중 가장 많이 분비되는 단일쇄(single chain)의 단백질 호르몬으로서, 191개의 아미노산 잔기로 구성되는 분자량 약 21,500Da의 호르몬이다. 성장호르몬은 뇌와 눈을 제외한 거의 모든 체내 조직 장기의 세포를 증식시켜 균형잡힌 성장을 촉진하며, 골성장으로 키가 커지고 골격근이 비대해지는 생리학적 작용을 가지고 있어 임상적으로는 뇌하수체 기능 부전성 왜소증 치료에 사용되고 있다. 이전에는 주로 교통사고나 질병으로 사망한 인간의 뇌하수체로부터 인간 성장호르몬을 추출 정제하여 사용하여 왔으나, 그 양이 크게 제한되어 있고, 또한 고도로 정제된 사람의 뇌하수체 호르몬만을 사용하여야하는 점때문에 모든 왜소증 환자에게 공급되지 못하였으며, 가격 또한 높아 사용에 많은 어려움이 있었다. 더욱이, 추출 정제한 인간 성장호르몬을 투여받은 어린이가 괴질의 바이러스에 감염되어 사망한 사고가 발생하는 등, 그 사용에 문제점이 있어 미국 식품 의약국(FAD)에서는 사망한 인간의 뇌하수체로부터 추출정제한 인간 성장호르몬의 사용을 금지시켰다. 추출 이외에도 화학적 합성이나 조직 배양 방법 등도 있으나, 이들 역시 수율이 낮은 단점을 가지고 있어 생산 방법의 개선이 제기되어 왔다.
상기한 hGH를 대량 생산하기 위하여, 본 발명자들은 이미 L-아라비노즈 오페론을 이용한 유도성의 hGH 융합단백질(hGH­UK­GST) 발현벡터 ΔpG2를 제조하였는 바, 이 발현벡터에 사용된 융합파트너는 Schistosoma japonicum 유래의 GST( glutathione S-transferase) 중 아미노 말단부터 69번째 아미노산에 해당하는 단편이고, 또한 발현벡터에는 융합된 부분을 절단하기 위해서 우수한 기질 특이성을 갖는 유로키나제의 절단 인식부위가 포함되어 있다. 그러나, 전기 발현벡터 ΔpG2로 형질전환된 재조합 대장균(MC1061:ΔpG2)의 회분배양만으로는 만족할 만한 수준의 hGH를 생산할 수 없었다(참조: 대한민국 특허출원 제 97-40321호).
이에, 본 발명자들은 발효공정의 최적화를 통하여 hGH의 생산성을 향상시키고자 예의 연구노력한 결과, 재조합 대장균 MC1061:ΔpG2(KFCC-10976)를 포도당 이외의 탄소원을 포함하는 신규의 초기 배양배지에서 배양하다가, 영양성분이 고갈되어 용존산소의 양이 급격히 증가할 때부터 신규의 유가배지에서 DO-stat 유가식으로 배양하면서 동시에 L-아라비노즈를 첨가하여 단백질 발현을 유도시키면, 세포성장, 플라즈미드 안정성 및 재조합 hGH 융합단백질의 발현량이 높은 수준에서 안정적으로 유지됨을 확인하고, 본 발명을 완성하게 되었다.
결국, 본 발명의 목적은 hGH 대량생산을 위한 DO-stat 유가식 배양방법을 제공하는 것이다.
도 1은 전형적인 DO-stat 유가배양의 발효양상을 나타내는 그래프이다.
도 2는 DO-stat 고농도 유가식 배양에서 인간성장호르몬(hGH) 단백질의 유도시기에 따른 세포 성장 및 플라즈미드의 안정성을 발효시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 3은 DO-stat 고농도 유가식 배양에서 유도시기에 따른 hGH 단백질 발현 양상을 비교한 그래프이다.
도 4는 산소 첨가 및 글리세롤 대신 포도당을 탄소원으로하여 DO-stat 유가배양 하였을때, 세포농도와 플라즈미드 안정성 및 잔존 탄소원과 아세트산의 축적량을 발효시간에 따라 나타낸 그래프이다.
도 5는 산소 첨가 및 글리세롤 대신 포도당을 탄소원으로 하여 DO-stat 유가배양 하였을때, hGH 단백질의 발현양상을 비교한 그래프이다.
이하, 본 발명을 보다 구체적으로 설명하고자 한다.
살모넬라 균주의 L-아라비노즈 오페론을 이용한 유도성의 hGH 융합단백질 발현벡터를 포함하는 재조합 대장균 MC1061:ΔpG2(KFCC-10976)(참조: 대한민국 특허출원 제 97-40321호)로부터 hGH 융합단백질을 대량생산하기 위하여, 포도당 이외의 탄소원을 포함하는 초기배지, 가장 바람직하게는 효모엑기스 40g/L, 탄소원 40g/L, Na2HPO410.22g/L, KH2PO42.31g/L 및 앰피실린 0.07g/L로 구성된 배지에서 회분식으로 재조합 대장균을 배양하다가, 영양성분이 고갈되어 용존산소의 양이 급격히 증가할 때부터 유가배지(효모엑기스 300g/L, 탄소원 400g/L, 무수황산마그네슘 5.76g/L로 구성된 배지)를 첨가하는 DO-stat 유가식 배양법을 사용한다. 이때, 초기배지의 탄소원은 글리세롤이 가장 바람직하고, 유가배지의 탄소원은 포도당이 가장 바람직하다.
DO-stat 유가식 배양법은 용존산소량을 발효조 내 영양성분의 고갈정도의 지표로 삼아 용존산소량이 일정 수준 이상 증가하면 영양성분을 보충하여 주고, 이후 보충된 영양성분의 소비와 함께 감소된 용존 산소량이 영양성분의 고갈로 인하여 다시 증가하면 영양성분을 또 다시 보충하여주는 유가법을 의미한다. 이와같이 용존산소량을 영양성분의 고갈지표로 할수 있는 이유는 대장균이 호기적 조건에서 탄소원으로 대표되는 영양성분을 산화시키고 저분자물질로 분해하여 이를 이용하는데, 이러한 탄소원의 해당작용에 있어서 전자수용체로서 용존산소를 이용하기 때문이다. 즉, 산소의 소비속도는 영양성분의 소비속도와 비례하게 되고, 영양성분의 고갈은 산소 소비속도의 감소를 초래하여 용존산소량이 급격히 증가하게 된다.
본 발명에서는 배양액 중 용존산소량을 측정하여 용존산소가 50% 포화 이상일 때 유가배지를 주입하고, 50% 이하로 떨어질 때는 주입을 중단하는 DO-stat 유가법을 실시한다.
상술한 제조합 대장균의 DO-stat 유가식 배양시에 세포성장, 플라즈미드의 안정성 및 재조합 hGH의 발현량 모두가 높은 수준에서 안정적으로 유지될 수 있는 발현 유도시기를 결정하는 것이 중요하므로, 회분발효의 대수적 성장시점, DO-stat 유가배양의 시작점 및 유가배양의 완료시점으로 구분하여 L-아라비노즈를 첨가하여 발현을 유도한 다음 세포농도, 플라즈미드 안정성 및 재조합 hGH 융단백질의 발현량을 측정하였다. 그 결과, 최적의 유도시기는 DO-stat 유가배양의 시작점인 것으로 나타났다.
한편, L-아라비노즈 오페론은 5탄당인 아라비노즈의 대사에 관련된 유전자로서, 포도당이 일정농도 이상으로 존재할 때에는 강력한 억제(catabolite repression)를 받는다. 그런데, 미생물의 고농도 배양은 반드시 많은 양의 탄소원을 필요로 하고, 현재까지 미생물의 고농도 배양에 가장 많이 이용되는 탄소원은 포도당 또는 글리세롤이다. 탄소원으로 가장 광범위하게 사용되는 포도당은 대장균의 성장속도와 수율면에서 가장 우수한 탄소원으로 알려져 있으나, 배지 중에 높은 농도로 존재하는 경우 상술한 바와 같이 아라비노즈 오페론을 강력히 저해하는 양상을 나타내며, 또한 부산물로서 에세트산을 많이 생산하여 단백질의 생산수율을 저하시키는 결과를 초래한다. 이러한 점을 고려하여, 아라비노즈 오페론을 사용하는 본발명의 경우 고농도의 포도당이 존재하는 회분발효의 구간에서는 글리세롤을 탄소원으로 사용한다. 그러나, 글리세롤은 아라비노즈 오페론을 저해하지 않으며 포도당에 비하여 세포대사의 부산물인 아세트산을 적게 생산한다는 장점을 가지나, 세포의 성장속도가 감소되고 가격이 비싼 단점이 있다.
본 발명에서 사용하고 있는 유가배양방식인 DO-stat는 발효조 내의 탄소원이 고갈되는 것을 용존산소량의 증가로 인식하여 유가배양을 실시하는 방법으로, 탄소원의 축적을 막아 전술한 포도당의 발현억제 작용을 극복할 수 있고, 동시에 탄소원의 축적으로 인하여 유발되는 아세트산과 같은 부산물의 축적을 막을 수 있다.
이러한 배경 하에서, 본 발명에서는 탄소원이 고농도로 존재하는 회분발효 구간에서는 글리세롤을 탄소원으로 사용하여 아라비노즈 오페론의 억제효과와 아세트산의 축적을 감소시키고, 유가배양 구간에서는 탄소원으로서 값싸고 이용효율이 우수한 포도당을 발현억제 최소농도 이하, 바람직하게는 0.5g/L 이하로 유지시켜, 글리세롤을 탄소원으로 하였을 때와 비교하여 발현억제 현상없이 hGH 융합단백질을 대량생산하게 되었다.
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 오로지 본 발명을 설명하기 위한 것으로, 이들 실시예에 의해 본 발명의 범위가 한정되지 않는다는 것은 본 발명이 속하는 분야에서 통상의 지식을 가진 자들에게 있어서 자명할 것이다.
실시예 1: hGH 융합단백질 생산을 위한 DO-stat 유가식 배양
hGH 융합단백질 발현균주(MC1061:ΔpG2, KFCC-10976)(참조: 대한민국 특허출원 제 97-40321호)를 DO-stat 유가식으로 배양하기 위하여, 우선 냉동고(-70℃)에서 25% 글리세롤에 보관된 hGH 발현균주를 30℃ 진탕배양기에서 150rpm으로 15시간동안 배양한 다음, 하기 표 1의 조성으로 이루어진 초기배지에 최종 5%(v/v)의 농도가 되도록 초기배양부피 1.5L 발효조(KOREA fermentor, SY-500)에 무균적으로 접조하였다.
초기 운전조건은 중성 pH, 온도 37℃, 600rpm의 교반속도, 통기량 2vvm으로 하였고, 이후 용존산소량을 최소 포화대비 10% 이상으로 유지시켜주기 위하여 초기배지성분이 고갈될 때까지 1000rpm으로 교반속도를 증가시켰다. 이때 배양기 내의 pH는 50%(v/v) 인산과 12.5%(v/v) 수산화암모늄을 사용하여 중성으로 유지시켰다.
초기 배양배지에서 회분식으로 재조합 대장균을 배양하다가 영양성분이 모두 고갈되어 용존산소의 양이 급격히 증가할 때부터 하기 표 1의 유가배지를 첨가하여 DO-stat 유가식으로 배양하였다. 즉, 배양액 중 용존산소가 50% 포화 이상일 때 유가배지를 주입하고, 50% 이하로 떨어질 때 배지주입을 중단하는 DO-stat 유가법을 자동으로 조절하여 배양이 끝날 때가지 반복하였다. 도 1은 DO-stat 유가법을 이용하는 경우의 전형적인 발효양성을 나타낸다.
본 발명에 사용한 배지조성
배지구분 성분 함량(g/L)
초기배지 효모엑기스탄소원(글리세롤)Na2HPO4KH2PO4앰피실린 404010.222.310.07
유가배지 효모엑기스탄소원(글리세롤 또는 포도당)무수황산마그네슘 3004005.76
실시예 2: hGH 융합단백질 발현의 유도
DO-stat 유가식 배양과정 중 어느 시점에서의 발현유도가 세포농도, 플라즈미드 안정성 및 hGH 융합단백질의 발현량을 최대화할 수 있는지 알아보기 위하여, DO-stat 유가식 배양과정 중의 대수적 성장시점, 유가배양의 시작점, 유가배양이 시작된 지 약 4시간 및 12시간 경과된 시점에서 최종 L-아라비노즈의 농도가 1%(w/v)가 되도록 무균적으로 발효조에 각각 첨가하여 hGH 융합단백질의 발현을 유도하였다. 이후 일정한 시간간격으로 발효시료를 채취하여 세포농도, 플라즈미드 안정성 및 hGH 융합단백질 발현량을 각각 조사하였다.
상기에서, 세포의 농도는 채취한 시료를 10배씩 차례로 희석한 다음 분광광도계(LKB, Ultrospec Ⅱ, USA)를 이용하여 600nm에서 흡광도(A600)를 측정함으로써 결정하였다. 또한, hGH 융합단백질의 발현량은 각각의 농도를 알고 있는 4개의 hGH 융합단백질 표준물질과 함께, 채취한 시료를 SDS-PAGE한 다음 염색하여 레이저스캐너(laser scanner)로 탐지하고, 이미지 분석기(image analyzer)를 사용하여 시료의 염색된 부분의 밀도면적을, 표준물질의 밀도면적을 이용하여 만든 정량곡선과 비교하는 방법으로 구하였다. 플라즈미드 안정성은 채취한 시료를 10배씩 차례로 희석하고 LB 평판배지에 도말 배양하여 단일 콜로니를 형성시킨 다음, 이를 100μg/mL 농도의 앰피실린이 함유된 LB 평판배지에 옮겨 배양하고, 이중 앰피실린에 대한 저항성을 나타내는 콜로니의 비율로 나타내었다.
도 2는 hGH 융합단백질 유도시기에 따른 세포성장 및 플라즈미드 안정성을 발효시간에 따라 나타낸 그래프이고, 도 3은 hGH 융합단백질 유도시기에 따른 hGH 단백질의 발현양상을 비교한 그래프이다. 도 2 및 3에서, 유도시기 1은 DO-stat 유가식 배양과정 중의 대수적 성장시점에서 L-아라비노즈를 첨가한 경우를 나타내고, 유도시기 2는 유가배양의 시점에서 L-아라비노즈를 첨가한 경우를 나타내고, 유도시기 3은 유가배양이 시작된 지 4시간 경과 후 L-아라비노즈를 첨가한 경우이며, 유도시기 4는 유가배양이 시작된 지 12시간 경과 후 L-아라비노즈를 첨가한 경우를 나타낸다.
도 2 및 3에서 보듯이, 초기배지에서의 대수적 성장시점에서 발현을 유도하였을 때, hGH 융합단백질의 발현량은 비교적 높으나, 플라즈미드의 안정성은 발효 후반부에 다소 감소함을 알 수 있었다. 이와 반대로, DO-stat 유가배양 후반부에서(유가배양이 시작된 지 4시간, 12시간 경과 후) 단백질 발현을 유도하였을 때, hGH 융합단백질이 제대로 발현되지 않았음을 알 수 있었다. 그러나, 유가배양의 시작시점에서 단백질 발현을 유도하였을 때, hGH 융합단백질의 발현량이 높았을 뿐만 아니라 플라즈미드 안정성도 발효 후반부까지 높은 수준으로 유지됨을 알 수 있었다. 따라서, 세포농도, 플라즈미드 안정성 및 hGH 융합단백질 발현량의 최대화를 위한 최적의 단백질 유도시기는 회분배양이 끝나고 유가배양이 시작되는 시점임을 알 수 있었다.
실시예 3: 산소첨가 및 포도당을 탄소원으로 하는 DO-stat 유가식 배양에 의한 hGH 융합단백질의 생산
탄소원으로서 포도당은 대장균의 성장속도나 수율 면에서는 우수하나 일정 이상의 고농도로 존재하는 경우 아라비노즈 오페론을 강력히 저해할 뿐만 아니라 부산물인 아세트산을 많이 생산하여 단백질의 생산수율을 저하시키는 것으로 알려져 있다. 이러한 보고를 기초로 하여, 본 실시예는 회분발효 구간에서는 글리세롤을 탄소원으로 사용하였다. 그리고, DO-stat 유가식 배양에서는 탄소원의 축적 및 이로 인하여 유발되는 아세트산과 같은 부산물의 축적을 막을 수 있으므로 유가식 발효구간에서는 값싸고 이용효율이 우수한 포도당을 탄소원으로 이용하였다. 이때, 배양액 중의 포도당 농도는 0.5g/L 이하로 유지시켰다. DO-stat 유가식 발효 구간에서 탄소원으로 포도당을 사용한 경우의 결과를 글리세룰을 사용한 결과와 비교하였다.
도 4는 산소첨가 및 포도당 또는 글리세롤을 탄소원으로하여 DO-stat 유가식 배양하였을 때의 세포농도와 플라즈미드 안정성 및 잔존 탄소원의 양과 축적된 아세트산의 양을 발효시간에 따라 나타낸 그래프이다. 도 5는 산소첨가 및 포도당 또는 글리세롤을 탄소원으로 하여 DO-stat 유가식 배양하였을 때 발현된 hGH 융합단백질의 양을 나타낸 그래프이다.
도 4 및 5에서 보듯이, 산소첨가 및 포도당을 이용한 유가배양의 세포농도와 hGH 융합단백질 발현량은 글리세롤을 탄소원으로 한 유가배양보다 높은 값을 나타내었다. 플라즈미드 안정성은 글리세롤을 탄소원으로 하였을 때와 큰 차이가 없음을 알 수 있었다. 따라서, 포도당은 본 발명의 DO-stat 유가식 배양에서 값비싼 글리세롤을 대신할 만한 우수한 탄소원으로 이용될 수 있음을 확인하였다.
이상에서 설명하고 입증하였듯이, 본 발명의 DO-stat 유가식 발효방법에 의하면, 회분발효 구간에서는 글리세롤을 탄소원으로 이용하여 아라비노즈 오페론의 억제효과와 아세트산의 축적을 감소시키고, 용존산소의 양을 지표로 하는 유가배양 구간에서는 탄소원으로서 값싸고 이용효율이 우수한 포도당을 발현억제 최소농도 이하로 유지시킴으로써, hGH 융합단백질 발현 저해 문제를 해결하였다. 그리고, 산소첨가를 통하여 고농도의 세포배양 및 높은 수준의 발현량을 얻을 수 있었다. 또한 유가배양 시작시점에서 L-아라비노즈를 첨가하여 세포 성장, 플라즈미드 안정성 및 hGH 융합단백질의 발현량을 높은 수준으로 안정적으로 유지시키므로, 저렴한 생산비용으로 hGH를 대량 생산하게 된다.

Claims (9)

  1. L-아라비노즈 오페론을 이용한 유도성의 인간성장호르몬 융합단백질 발현벡터를 포함하는 재조합 대장균을 포도당 이외의 탄소원을 포함하는 초기 배양배지에서 회분식으로 배양하다가, 용존산소량이 급격히 증가할 때부터 유가배지에서 배양하고 L-아라비노즈를 첨가하여 단백질 발현을 유도하는 공정을 포함하는, 인간성장호르몬의 대량생산을 위한
    DO-stat 유가식 배양방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    재조합 대장균은 대장균 MC1061:ΔpG2(KFCC-10976)인 것을 특징으로 하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
  3. 제 1항에 있어서,
    초기 배양배지는 효모엑기스 40g/L, 탄소원 40g/L, Na2HPO410.22g/L, KH2PO42.31g/L 및 앰피실린 0.07g/L로 구성되는 것을 특징으로 하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    용존산소의 양이 50% 포화 이상일 때 유가배지를 주입하고 50% 이하로 떨어질 때 유가배지 주입을 중단하는 것을 특징으로 하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
  5. 제 1항 또는 제 4항에 있어서,
    유가배지는 효모엑기스 300g/L, 탄소원 400g/L 및 무수황산마그네슘 5.76g/L로 구성되는 것을 특징으로 하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
  6. 제 5항에 있어서,
    탄소원은 포도당인 것을 특징으로 하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
  7. 제 1항 또는 제 6항에 있어서,
    유가배지의 탄소원으로 포도당이 사용되는 경우, 유가배양시 포도당의 농도는 0.5g/L 이하로 유지되는 것을 특징으로 하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
  8. 제 1항에 있어서,
    L-아라비노즈는 DO-stat 유가배양 시작점에서 첨가하는 것을 특징으로하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
  9. 제 1항에 있어서,
    산소첨가를 특징으로하는
    DO-stat 유가식 배양방법.
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