KR0150917B1 - 신균주 잔토모나스 말토필리아 yl-37과 이로부터 생산되는 신규 알칼리성 단백질 분해효소 - Google Patents

신균주 잔토모나스 말토필리아 yl-37과 이로부터 생산되는 신규 알칼리성 단백질 분해효소

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Abstract

본 발명은 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37(KCTC 0146BP)과 이로부터 생산되고 저온성이고 내알칼리특성이 우수하여 식품, 세제, 피혁공업 등에 유용하게 사용가능한 알칼리성 단백질 분해효소에 관한 것이다.

Description

신균주 잔토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia) YL-37과 이로부터 생산되는 신규 알칼리성 단백질 분해효소
제1도는 본 발명의 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37의 전자현미경 사진 (X16,800)을 나타낸 것이고,
제2도는 본 발명의 신균주를 탈지유가 포함된 고체배지에 접종하여 20℃에서 48시간 배양했을 때 탈지유의 분해로 생기는 투명환의 사진을 나타낸 것이고,
제3도는 본 발명의 신균주의 온도에 따른 단백질 분해효소(프로테아제)의 활성을 나타낸 그래프이고,
제4도는 본 발명의 신균주에 의해 생산된 단백질 분해효소의 pH에 따른 활성을 나타낸 그래프이고,
제5도는 본 발명의 신균주에 의해 생산된 알칼리성 단백질 분해효소의 온도에 따른 활성과 열안정성을 나타낸 그래프이고,
제6도는 본 발명의 신균주가 생산하는 알칼리성 단백질 분해효소의 SDS-플리아크릴아마이드겔 전기영동 사진을 나타낸 것이다.
본 발명은 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37과 이로부터 생산되고 저온성이고 내알칼리특성이 우수하여 식품, 세제, 피혁공업 등에 유용하게 사용가능한 알칼리성 단백질 분해효소에 관한 것이다.
단백질 분해효소는 작용기작에 따라 세린(serine), 메탈(metal), 티올(thiol), 프로테아제(protease)로 구분되며 작용 pH에 따라 산성(acid), 중성(neutral), 알칼리(alkaline) 프로테아제로 구분된다. 알칼리성 단백질 분해효소(alkaline protease : serine protease)는 알칼리 범위의 pH에서 최적활성을 갖는 효소로서 식품, 세제, 피혁공업에 사용되고 있으며 특히, 세제공업에 있어서 높은 비중을 차지하고 있다. 가정에서 일반적으로 사용하고 있는 합성세제는 사용 후 하천과 해양으로 혼입되어 거품을 발생하며, 이때 발생한 거품은 산소투과를 차단하여 하천 및 해양의 자정능력을 저하시키고, 세정력을 강화하기 위해 첨가하는 계면활성제 및 표백제, 형광제 등은 환경오염을 가속화하고 있다. 세제용 효소의 주류는 알칼리성 단백질 분해 효소이며 이것은 오염을 섬유에 결합시키는 결합체(binder)의 역할을 하고 의류에 부착되는 유기오염의 15 ~ 40%를 차지하는 단백질을 분해함으로서 세정효율을 높이는 작용을 한다.
현재 세제에 첨가하는 효소는 전량 수입에 의존하고 있으며 이들은 구미의 고온 고농도형 세척조건에 적합하도록 개발된 것으로 우리나라를 비롯한 동북아시아의 세탁 조건(세탁온도 : 15 ~ 25℃)에는 적합하지 않다.
따라서, 본 발명자들은 알칼리 조건하에서 본 발명의 신균주를 배양하고 이를 이용하여 저온성, 내알칼리성 단백질 분해효소를 생산함으로써 본 발명을 완성하였다.
본 발명은 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37 이로부터 생산되는 신규 알칼리성 단백질 분해효소를 제공하는데 그 목적이 있다.
이하, 본 발명을 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 신규한 잔토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia) YL-37 균주(KCTC 0146BP)에 관한 것이다.
또한 본 발명은 상기 신균주가 생산하는 알칼리성 단백질 분해효소에 관한 것을 포함한다.
이와같은 본 발명을 더욱 상세히 설명하면 다음과 같다.
본 발명은 토양에서 분리한 신규한 미생물 잔토모나스 말토필리아 YL-37 균주(KCTC 0146BP)와 이로부터 생산되는 신규한 알칼리성 단백질 분해효소에 관한 것으로서, 본 발명의 균주는 국내 각종 토양 및 하천수에서 분리한 것으로서 버어지스 매뉴얼(Bergy's Manual of Determinative Bacteriology)와 의약 박테리아의 동정 매뉴얼(Manual for the Identification of Medical Bacteria)를 참고하여 본원 균주의 형태학적, 생리학적 및 생화학적 특성을 조사한 후 균주동정을 실시하였고, 형태는 주사형 전자현미경(SEM-515, 필립사 제품, 네덜란드)을 사용하여 관찰하였으며 G + C몰 함량은 타마오카와 코마가타[Tamaoka, J. and K. Komagata, Determination of DNA base composition by reversed-phase high-performance liquid chromatography. FEMS Microbiol. Letters 25 : 125 ~ 128 (1984)]의 방법에 따라 역상 HPLC로 분석하였다.
또한, 균체 지방산 분석은 대수증식기의 습균체 40 ~ 50 mg에서 지방산을 추출하여 MIS(Microbial Identification System, 휴렛-팩커드 5890A)에 의해 가스 액체크로마토그래피를 사용하여 분석하였다.
그 결과 다음 표 1에 나타낸 바와같이 본 발명의 신균주는 고체배지에서 원형의 집락(colony)을 형성하며, 집락색깔은 노란색을 띄었다. 모양은 간균이며, 크기는 주사 전자현미경으로 측정한 경우 직경이 0.4 내지 0.5 ㎛이고 길이는 1.2 내지 1.5 ㎛였다. 본 균주는 그림 음성균으로 생육 pH 범위는 pH 8.0 ~ 12.0 이었고, 생육 온도범위는 10 ~ 25℃이며, 호기성 세균이며 운동성을 지니고 있다. 카탈라제 생성은 양성이며, 옥시다제 생성은 음성이고 글루코즈 이용시 발효를 하였다. 젤라틴 액화, 에스큘린 가수분해, 칼륨 시아나이드에서의 생육은 양성이고, 메틸레드 반응, 인돌 생성, 우레아제 생성은 음성이었다. 탄수화물(carbohydrate)로부터 산 생성은 락토즈, 말토즈, D-만니톨, 람노즈, 살리신, 슈크로즈 및 자이로즈 모두 산을 생성하지 못하였다.
DNA의 G + C몰 함량은 65.3%로서 잔토모나스 속(63-71%)과 비슷한 결과로 나타났다. 이상의 결과로부터 본 균주는 잔토모나스 속으로 추정되었지만 더 정확한 균주 동정을 위하여 균체 지방산 조성을 분석한 결과 15:0 이소(iso)(37.02%), 15:0 안테이소(anteiso)(9.96%), 16:1 w7c (9.91%) 순으로 우점한 지방산 형태로 나타났다. 특이적으로, 그람 음성균주에서는 이소와 안테이소 형태를 갖는 균주는 잔토모나스 속으로 알려져 있다[참조 : Miller, L. T. and T. Berger, Bacteria identification by gas chromatography of whole cell fatty acid In Hewlett-Packard Application Note].
상기한 형태학적, 배양학적 및 생리학적 특성에 기초하고 본 균주가 잔토모나스 속(Xanthomonas sp.)과 가장 유사한 균체 지방산을 나타내는 균주이므로 본 발명에서 분리된 미생물을 자토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia) YL-37이라 명명하고, 1995년 1월 12일자로 국제 균주기탁기관인 한국과학기술연구원 부설 생명공학연구소 유전자 은행에 기탁하고 수탁번호 KCTC 0146BP를 부여받았다.
상기한 본 발명의 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37(KCTC 0146BP)의 배양방법과 이로부터 알칼리성 단백질 분해효소(protease)를 제조하는 방법을 다음의 실시예를 통하여 구체적으로 설명하는 바, 본 발명이 이들에 한정되는 것은 아니다.
[실시예1]
저온에서 활성이 우수하고 계면활성에 내성이 있는 알칼리성 단백질 분해효소를 생산하는 미생물의 분리를 위하여 다음과 같은 분리용 고체배지를 사용하였다. 즉, 효모 추출물 1g, NaCl 5g, 시판세제 2g, 탈지분류(Difco사 제품) 20g, NaCO2g, 박토 아가(Bacto agar) 15g, 증류수 1ℓ의 조성이였으며 탈지분유 NaCO및 세제는 분리해서 별도로 멸균한 후에 첨가하여 사용하였다. pH는 NaCO용액으로 10.0으로 조정하였다. 전배양 배지는 증류수 1ℓ에 수크로즈 60g, 대두분(soybean meal) 20g, NaCl 1g, NHCO1g, KHPO2g, MgSO·7HO 0.2g, 그리고 NaCO3g 첨가한 것으로서 NaCO는 분리해서 멸균 후 첨가하여 사용하였고, 단백질 분해효소의 생산배지는 전배양배지에 트립톤 10 g/ℓ을 첨가하여 사용하였다.
국내 각종 토양 및 하천수 등의 균원시료를 멸균된 생리식염수에 균일하게 현탁한 후 분리용 고체배지상에 도말하여 20℃에서 3일간 배양한 후 우유단백의 분해로 형성되는 투명대의 크기에 따라 1차 선별하고, 선별된 균주는 다시 분리용 고체배지를 pH 7.0, 9.0, 10.0으로 조정하여 20℃에서 3일간 배양한 후 균생육과 분해능이 우수한 균주를 2차 선별하였다. 2차 선별된 균주는 액체배양을 통하여 얻는 배양상등액을 이용하여 20℃에서 효소활성은 측정, 높은 알칼리성 단백질 분해효소의 생산균주인 YL-37 균주(KCTC 0146BP)를 최종 선발하여 실험에 사용하였다. 균주의 보존은 분리용 고체배지에 계대배양 및 앰플(ampoule)에 동결건조하여 4℃에서 보존하였다.
[실시예2]
효소활성측정
상기 실시예 1에서 선별 분리된 분리균주가 생산하는 단백질 분해효소 활성은 주로 라이톤(Leighton, T. J., R.H. Doi, R. A. J. Warren, and R. A. Kelln. 1973. The relationship of serine protease activity to RNA polymerase modification and sporulation in Bacillus subtilis. J. Mol. Biol. 76 : 103 ~ 122)등의 방법을 약간 변형하여 측정하였다. 즉, 효소액 0.1 ㎖에 1 mM CaCl가 포함된 0.2M Tris-HCl(pH 8.0) 완충용액에 용해시킨 5.0% 아조카제인 (Sigma사 제품) 0.2 ㎖, 1M Tris-HCl(pH 8.0) 0.2 ㎖, 10 mM CaCl0.1 ㎖, 증류수 1.0 ㎖로 구성된 반응 혼합물을 40℃에서 30분간 반응시킨 후 10%(w/w) 트리클로로아세트 산(trichloroacetic acid) 1.0 ㎖을 첨가하여 반응을 정지시키고 0℃에서 15분간 정치한 후 침전된 단백질을 제거하기 위하여 원심분리하고, 상등액 밀리포어 필터[Millipore filter(0.45 ㎛)]로 여과하였다. 여액 1.2 ㎖에 1.8N NaOH 0.3 ㎖을 첨가하여 발색시킨 후 분광광도계(Beckman DU-60)를 이용하여 420 nm에서 흡광도를 측정하였다. 효소의 활성은 40℃에서 30분 동안에 1.0 ㎍의 아조카제인을 가수분해시킬 수 있는 효소량을 1 unit로 정하였다. 또한 배양조건 검토시의 효소활성은 하마스텐-카제인(MerK사 제품)을 기질로 하여 델프트 유닛 분석(Anton, G. V. V. 1974, Enzyme-polymer complexes, London Patent No. 1353317)으로 측정하였다.
균주의 배양
분리균주의 효소생산 조건을 검토하기 위하여 전배양 배지를 500 ㎖ 둥근바닥 플라스크에 50 ㎖을 넣고 121℃에서 15분간 가압습윤 멸균 후 분리균주를 일백금이 접종하여 20℃에서 24시간 전배양한 후 본배양 배지에 4%(v/v) 수준으로 접종하여 효소생산을 위한 최적 배양조건, 즉 최적배양온도, 최적초발 pH, 그리고 최적배양시간등을 조사하였다.
자아르 배양기(Jar Fermenter) 배양
분리균주 YL-37을 전배양 배지에서 20℃, 24시간 진탕배양한 것을 종균으로 사용하였다. 자아르 배양기 배양은 5ℓ 발효조(KFC 5ℓ, 한국)에 반응부피 3ℓ로 하여 통기량은 1.0 vvm, 교반은 450 rpm, 소포제는 실리콘 SAG-471을 최종 0.1%(v/v) 첨가하였으며, 20℃에서 배양하면서 균체증식, pH 변화, 그리고 단백질 분해효소의 활성도를 경시적으로 측정하였다. 균체증식은 분광광도계(Beckman DU-60)를 이용하여 660 nm에서 흡광도로 측정하였다.
조효소의 성질
분리균주를 단백질 분해효소 생산배지에서 4일간 진탕배양하여 원심분리 (12,000 rpm, 15분, 4℃)한 후, 얻은 배양상등액을 조효소액으로 하여 최적온도 및 열안정성, 최적 pH 및 pH 안정성 등을 조사하였으며, 각종 저해제에 대한 영향도 조사하였다. 실험에 사용한 완충용액을 시트르산염 완충용액(pH 5.0), 인산염 완충 용액(pH 6.0), Tris-HCl 완충용액(pH 7.0 ~ 9.0), 붕산나트륨 완충용액(pH 10.0 ~ 11.0) 및 NaOH-KCl 완충용액(pH 12.0 ~ 13.0) 등 이었다.
상기한 실험결과 본 발명의 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37(KCTC 0146BP)를 단백질 분해효소(프로테아제) 생산배지에서 15, 20, 28, 37℃로 4일간 진탕배양하면서 배양시간별로 활성을 측정한 결과 제3도에 나타낸 바와 같이 20℃에서 가장 높은 효소활성을 나타내었으며, 28℃에서는 현저히 저하되었고, 37℃이상에서는 효소활성은 거의 나타내지 않는 것으로 보아 본 발명의 신균주는 최적 생육온도가 20℃ 부근임을 알 수 있다.
또한, 제2도에 나타낸 바와같이 본 발명의 신균주가 단백질인 탈지유를 분해하는 효소를 생산함을 알 수 있다.
또한 , 프로테아제 생산배지를 각각 다른 pH로 보정하여 효소생산 최적 초발(initial) pH를 검토하기 위하여 20℃에서 4일간 진탕배양하면서 크로테아제 활성을 측정하여 그 결과를 제 4도에 나타내었는 바, 본 발명의 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37(KCTC 0146BP)는 알칼리성 범위인 pH 9.0 ~ 12.0에서 효소활성이 높았고, 효소생산을 위한 최적 초발 pH는 11.0이었다.
또한 , 조효소액과 기질을 혼합하여 각 온도에서 30분간 반응시켜 효소활성을 측정한 결과 제5도에 나타낸 바와같이 프로테아제의 활성은 70℃에서 최적이었고 20℃에서도 최적온도의 약 40% 정도의 활성을 나타내어 동북아시아의 세탁조건에 맞는 세제용 효소로서 이용가능성이 있다고 사료된다.
그리고 프로테아제의 열안정성을 각 온도별로 30분간 방응시킨 후 기질을 첨가하여 잔존활성을 측정한 결과 20 ~ 50℃에서는 안정하였으나 60℃ 이상에서는 불안정하였으나(제5도) Ca 첨가시 열안정성이 60℃로 증가한다.
한편, 본 발명의 신균주에 의해 생상되는 알칼리성 단백질 분해효소 프로테아제는 금속이온(칼슘, 망간)에 의해 효소활성이 증가하고, 에틸렌 디아민 테트라아세트산(EDTA)과 환원제에 의해 효소활성이 영향을 받지않고 페닐 메탄설포닐 플루오라이드(PMSF)에 의해 활성이 완전히 저해된다.
또한, 본 발명의 신균주가 생산하는 정제된 알칼리성 단백질 분해효소의 분자량을 SDS-플리아크릴아마이드겔 전기영동법(제6도)으로 측정한 결과 약 62,000달톤이었으며, 이는 이미 보고된 다른 저온성 슈도모나스 플로레슨스(Magesin과 Schinner)의 50,000, 바실러스 속(Margesin 등)의 27,000과는 분자량이 상이함을 알 수 있다.
[실시예 3]
상기 실시예 2에서 제조된 본 발명의 효소용액과 사비나제(Savinase, NOVO사 제품) 4.0T 각각 1㎖를 카제인 용액 5㎖에 첨가하여 각각의 온도에서 40분간 반응시킨 후 TCA(Trichloroacetic acid) 용액을 5ml 첨가하여 반응정지시킨 다음 30분 정치 후 침전된 단백질을 원심분리(5,000 rpm, 10분)하여 제거하고 상등액을 밀리포어 필터를 사용하여 여과한 후 275 nm에서 측정한 흡광도로 세탁력을 측정하여 그 결과를 다음 표 2에 나타내었다.
상기 표 2에서 알 수 있는 바와같이 본 발명의 효소의 활성이 저온인 20 ~ 40℃에서 사비나아제 4.0T보다 훨씬 우수함을 알 수 있어 동북아시아 세탁조건에 맞는 세제로서 유용하게 사용 가능함을 알 수 있다.
상기한 바와같이 본 발명의 신균주 잔토모나스 말토필리아 YL-37(KCTC 0146BP)로부터 생산되는 정제된 알칼리성 단백질 분해효소는 내알칼리성이고, 특히 저온에서 활성이 높았으며 계면활성제 내성도 강할 뿐 아니라 분자량도 상이하여 기존의 알칼리성 단백질 분해효소와는 다른 신규한 효소임을 알 수 있고, 특히 저온활성이 높아 동북아시아 세탁조건에 맞는 세제의 유효성분으로 유용하게 사용 가능하다.

Claims (3)

  1. 신균주 잔토모나스 말토필리아(Xanthomonas maltophilia) YL-37 균주(KCTC 0146BP)
  2. 제1항의 신균주가 생산하고 다음과 같은 특성을 갖는 알칼리성 단백질 분해효소.
    분자량 : 62,000 달톤
    최적 pH : 11.0
    안정 pH : 9.0 ~ 12.0
    작용온도범위 : 50℃ 이하
    반응최적온도 : 70℃
  3. 제2항에 알칼리성 단백질 분해효소를 세제 제조에 사용하는 방법.
KR1019950009600A 1995-04-24 1995-04-24 신균주 잔토모나스 말토필리아 yl-37과 이로부터 생산되는 신규 알칼리성 단백질 분해효소 KR0150917B1 (ko)

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