CN109797144A - 芽孢杆菌dl-2的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种芽孢杆菌DL‑2的胞外蛋白酶在催化(±)‑乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。本发明从西太平洋深海分离到一株芽孢杆菌Bacillus sp.DL‑2，发酵培养制备其胞外蛋白酶，用硅藻土固定化后能够催化(±)‑乙酸苏合香酯不对称水解，可用于制备手性(R)‑1‑苯乙醇和(S)‑乙酸苏合香酯。本发明利用固定化的胞外蛋白酶作为催化剂，对反应体系和反应条件进行优化，制备得到了光学纯度约为97％的(R)‑1‑苯乙醇和光学纯度大于99％的(S)‑乙酸苏合香酯。本发明的Bacillus sp.DL‑2的胞外蛋白酶具有生产工艺简单、催化效率高的优点，在生物医药和精细化工领域具有非常大的应用前景。

Description

芽孢杆菌DL-2的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对 称水解中的应用

技术领域：

本发明属于生物化工和生物技术领域，具体涉及一种从西太平洋深海样品中分离的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2产生的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。

背景技术：

1-苯乙醇等手性仲醇是精细化学品合成的重要手性中间体，在医药、农药和化工等领域有着广泛的应用，其光学纯对映体的制备是手性化合物合成中的关键步骤。乙酸苏合香酯作为一种重要的酯类香料，是配制栀子、晚香玉香型日用香精的主要原料，在香料香精行业中用量很大。手性香料是一类重要的化合物，不同对映体香料可能显示出不同的香气特征、香气强度和生物活性。利用酶法拆分手性化合物具有专一性强、拆分效率高、操作简单、成本低和环境污染小等诸多优点，近年来获得了长足的发展。蛋白酶(Proteases,EC3.4)是水解蛋白质肽键的一类酶的总称。按其水解多肽的方式，可以将其分为内肽酶和外肽酶两类。内肽酶将蛋白质分子内部切断，形成分子量较小的朊和胨。外肽酶从蛋白质分子的游离氨基或羧基的末端逐个将肽键水解，而游离出氨基酸，前者为氨基肽酶后者为羧基肽酶。工业生产上应用的蛋白酶，主要是内肽酶。蛋白酶广泛存在于动物内脏、植物茎叶、果实和微生物中。由于动植物资源有限，微生物蛋白酶，主要由霉菌、细菌，其次由酵母、放线菌生产，广泛用于洗涤剂工业、饲料工业、食品工业、酿造工业、制革工业和医药工业。

发明内容：

本发明的目的是克服现有技术中的缺陷，提供一种芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。

本发明的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2于2018年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC1.1556。该菌株为公开保藏，在广东省微生物菌种保藏中心是可以对外销售的。

本发明从西太平洋深海分离到一株芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2，经发酵培养制备其胞外蛋白酶，用硅藻土吸附固定后作为催化剂，能够催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解，可用于制备手性(R)-1-苯乙醇和(S)-乙酸苏合香酯。

因此，本发明的目的是提供芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2所产的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用。

所述的胞外蛋白酶优选为固定化的胞外蛋白酶。

所述的固定化的胞外蛋白酶是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌Bacillussp.DL-2接种到液体培养基中进行发酵培养，得到发酵液，离心取上清液得到粗酶液，按每100mL的粗酶液加入5g硅藻土的量加入硅藻土，经吸附、抽滤、干燥后得到固定化的胞外蛋白酶。

优选，所述的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2所产的胞外蛋白酶在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(R)-1-苯乙醇中的应用。

优选，所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(R)-1-苯乙醇是在金属离子、表面活性剂或有机溶剂存在环境下进行的。

所述的金属离子优选为K⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Al³⁺或Fe³⁺；所述的表面活性剂优选为三聚磷酸钠；所述的有机溶剂优选为N,N-二甲基甲酰胺或正丙醇。

所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(R)-1-苯乙醇的反应体系优选为：包括360mg/mL固定化的胞外蛋白酶、5mM底物(±)-乙酸苏合香酯和2mM Mn²⁺，其余为pH6.5的磷酸钠缓冲液；反应条件优选为：20℃反应2h。

优选，所述的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2所产的胞外蛋白酶在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(S)-乙酸苏合香酯中的应用。

所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(S)-乙酸苏合香酯是在金属离子存在环境下进行的；所述的金属离子为Ca²⁺或Mg²⁺。

所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(S)-乙酸苏合香酯的反应体系优选为：包括440mg/mL固定化的胞外蛋白酶、2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯和2mM Ca²⁺或Mg²⁺，其余为pH7.5的磷酸钠缓冲液；反应条件优选为：35℃反应10h。

本发明从西太平洋深海分离到一株芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2，发酵培养制备其胞外蛋白酶，用硅藻土固定化后得到固定化的胞外蛋白酶，利用该固定化的胞外蛋白酶作为催化剂，能够催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解，可用于制备手性(R)-1-苯乙醇和(S)-乙酸苏合香酯。本发明利用固定化的胞外蛋白酶作为催化剂，对反应体系和反应条件进行优化，制备得到了光学纯度约为97％的(R)-1-苯乙醇(转化率17.4％，产率41％)和光学纯度大于99％的(S)-乙酸苏合香酯(转化率61％，产率71％)。本发明的Bacillus sp.DL-2的胞外蛋白酶具有生产工艺简单、催化效率高的优点，在生物医药和精细化工领域具有非常大的应用前景。

附图说明：

图1是Bacillus sp.DL-2的生长曲线。

图2是Bacillus sp.DL-2发酵培养不同时间点下胞外蛋白酶酶活和拆分效果的关系。

图3是pH对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(R)-1-苯乙醇的影响。

图4是温度对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(R)-1-苯乙醇的影响。

图5是e.e._p和C随酶量的变化曲线。

图6是e.e._p和C随底物浓度的变化曲线。

图7是e.e._p和C随反应时间的变化曲线。

图8是pH对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(S)-乙酸苏合香酯的影响。

图9是温度对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(S)-乙酸苏合香酯的影响。

图10是e.e._s和C随酶量的变化曲线。

图11是e.e._s和C随底物浓度的变化曲线。

图12是e.e._s和C随反应时间的变化曲线。

图13是(±)乙酸苏合香酯和(±)-1-苯乙醇的气相色谱图。

图14是最适反应条件下固定化的胞外蛋白酶对(±)-乙酸苏合香酯的选择性水解生成高光学纯的(R)-1-苯乙醇的气相色谱图。

图15是最适反应条件下固定化的胞外蛋白酶对(±)-乙酸苏合香酯的选择性水解得高光学纯的(S)-乙酸苏合香酯的气相色谱图。

图16是Bacillus sp.DL-2的固定化的胞外蛋白酶水解拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(R)-1-苯乙醇1)和(S)-乙酸苏合香酯2)。

具体实施方式：

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

本发明的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2从西太平洋深海样品中筛选得来并保存在中国科学院南海海洋研究所热带海洋生物资源与生态重点实验室。

实施例1：芽孢杆菌菌种的鉴定

筛选纯化后的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2菌株利用其保守的16S rRNA基因序列对其菌种进行鉴定。用16S rRNA通用引物27F：5'-AGAGTTTATCCTGGCTCAG-3'；和1492R：5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，以芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2菌液为DNA模板对其进行PCR扩增。建立如表1所示反应体系：

表1 PCR反应体系

PCR扩增条件：94℃预变性10min，然后94℃变性30s，56℃退火30s，72℃延伸2min30s，循环30次；最后72℃延伸10min，冷却到18℃。扩增产物经1％琼脂糖凝胶电泳，进行检测，然后进行双向DNA测序。得到该菌的16S rRNA基因序列拼接后(其核苷酸序列如SEQID NO.1所示)利用BLAST鉴定出该菌株为芽孢杆菌并命名为Bacillus sp.DL-2，该菌于2018年9月12日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC 1.1556。该菌株为公开保藏，在广东省微生物菌种保藏中心是对外销售的。

实施例2：Bacillus sp.DL-2的生长曲线及产出的胞外蛋白酶酶活测定

将保存的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2划线到LB平板上，37℃培养16h，然后挑取单菌落接种到100mL的LB液体培养基中，200r/min，37℃培养12h，得到种子液，按1％的接种量接种于LB培养基中培养，200r/min，37℃培养，每隔2h测定其生物量OD-600nm，结果如图1所示。随后将种子液按1％的接种量接种于脱脂奶粉液体培养基中，200r/min，37℃培养，取不同培养时间点(12h、24h、36h、48h和60h)的胞外蛋白酶并依据SB/T 10317-1999标准进行了酶活的测定，同时也对这五个时间点的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果进行了气相检测并计算出产物对映体过量值(e.e._p)和底物转化率C，结果如图2所示，培养24h时胞外蛋白酶酶活相对较低但其拆分时e.e._p却最大，说明该菌株所产的胞外蛋白酶的拆分效果并不跟其酶活的大小呈正相关，其原因可能是胞外蛋白酶是几种蛋白酶的混合酶。

实施例3：Bacillus sp.DL-2胞外蛋白酶的固定化

将Bacillus sp.DL-2的种子液按1％的接种量接种于脱脂奶粉液体培养基进行发酵培养，200r/min，37℃培养24h(培养基变澄清)，得到发酵液，离心取上清液即粗酶液，按每100mL的粗酶液加入5g硅藻土的量加入硅藻土，200r/min，25℃吸附10h，然后抽滤，将硅藻土部分38℃烘干，即得固定化的胞外蛋白酶。

实施例4：固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(R)-1-苯乙醇

4.1 pH对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

配制不同的缓冲溶液，这些缓冲溶液具有不同的pH，如表2所示，其浓度均为50mM。

表2不同pH的缓冲体系

在上表2所列的各种pH缓冲液反应体系中加入浓度为360mg/mL固定化的胞外蛋白酶，5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，在20℃下以200rpm反应2h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算产物醇对映体过量值(e.e._p)和底物转化率(C)，结果见图3。公式1：公式2：

R_nol和S_nol分别表示(R)-1-苯乙醇和(S)-1-苯乙醇的峰面积。R₀和S₀分别表示反应前对应构型的底物浓度；R和S分别代表反应后对应构型的底物浓度。

从图3中可看出在50mM的Na₂HPO₄/NaH₂PO₄缓冲液(PB)pH6.5时，产物的对映体过量值最高为95.9％，此时底物转化率为23.4％。故pH 6.5的50mM磷酸钠缓冲液适合固定化的胞外蛋白酶拆分5mM(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(R)-1-苯乙醇。

4.2温度对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 6.5的50mM PB反应体系中加入浓度为360mg/mL固定化的胞外蛋白酶，5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，于不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)下以200rpm反应2h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e._p和C，结果见图4。表明温度为20℃时，固定化的胞外蛋白酶对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其产物醇的对映体过量值和底物转化率分别为95.4％和27.9％。高于20℃时产物的对映体过量值降低。故温度为20℃时适合胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(R)-1-苯乙醇。

4.3酶量对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 6.5的50mM PB反应体系中分别加入浓度为120mg/mL、160mg/mL、200mg/mL、240mg/mL、280mg/mL、320mg/mL、360mg/mL、400mg/mL、440mg/mL、480mg/mL的固定化的胞外蛋白酶，5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，于20℃下以200rpm反应2h，用气相色谱手性柱检测并计算产物醇对映体过量值e.e._p和底物转化率C，结果见图5。表明酶量为360mg/mL时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其产物醇的对映体过量值和底物转化率分别为96.0％和25.1％。酶量过高或过低都会降低拆分效果。

4.4底物浓度对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在加有360mg/mL固定化的胞外蛋白酶的pH 6.5的50mM PB反应体系中分别加入浓度为2.5mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM的底物(±)-乙酸苏合香酯，于20℃下以200rpm反应2h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e._p和C，结果见图6。表明底物浓度为5mM时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其产物醇的对映体过量值和底物转化率分别为96.0％和22.4％。底物浓度低于5mM时e.e._p值下降，高于5mM时底物转化率明显降低。

4.5反应时间对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 6.5(50mM PB)的缓冲液体系中加入360mg/mL固定化的胞外蛋白酶，5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，于20℃下以200rpm分别反应1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后用气相色谱检测并计算产物醇对映体过量值e.e._p和底物转化率C，结果见图7。显示反应时间为2h时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其产物醇的对映体过量值e.e._p和底物转化率C分别为95.9％和18.1％。反应时间过短反应不完全，底物转化率低，反应时间过长产物的对映体过量值降低。

4.6金属离子和表面活性剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 6.5的50mM PB反应体系中加入浓度为360mg/mL固定化的胞外蛋白酶，5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，2mM金属氯化盐或0.05％(w/v)的表面活性剂，以未加金属盐或表面活性剂为对照，在20℃下反应2h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e._p和C，结果见表3。

表3金属离子与表面活性剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表3可以看出与对照组相比绝大多数金属离子及表面活性剂的存在降低了胞外蛋白酶的立体选择性或底物转化率，K⁺，Ca²⁺，Co²⁺，Mn²⁺，Al³⁺，Fe³⁺和STPP(三聚磷酸钠)对胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯得到的(R)-1-苯乙醇的立体选择有稍微的促进作用，Mn²⁺的存在使e.e._p提高到了96.8％，Cu²⁺和表面活性剂SDBS(十二烷基苯磺酸钠)对拆分有非常明显的抑制作用。

4.7有机溶剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 6.5(50mM PB)反应体系加入终浓度为360mg/mL固定化的胞外蛋白酶，5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，5％(v/v)有机溶剂，以未加有机溶剂为对照，在20℃下200rpm反应2h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e._p和C，结果见表4。

表4有机溶剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表4可以看出绝大多数有机溶剂的存在降低了胞外蛋白酶的立体选择性及底物转化率。DMF(N,N-二甲基甲酰胺)和正丙醇的存在在一定程度上提高了产物的对映体过量值。最适条件下(反应体系为：包括5mM底物(±)-乙酸苏合香酯、360mg/mL的固定化的胞外蛋白酶和2mM Mn²⁺，其余为pH6.5的磷酸钠缓冲液(PB)；反应条件为：在20℃下200rpm反应2h)反应前后气相色谱图见图13、图14。最适条件下制备得到了光学纯度约为97％的(R)-1-苯乙醇(转化率17.4％，产率41％)(见图16)。

实施例5：固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯制备(S)-乙酸苏合香酯

反应体系中加入不同的酶量或底物浓度对拆分效果有较大的影响，此酶优先水解(R)-乙酸苏合香酯生成(R)-1-苯乙醇，而当酶量增加到一定值或底物浓度降低到一定值时(R)-乙酸苏合香酯被基本水解完全，再增加酶量或降低底物浓度便开始水解(S)-乙酸苏合香酯。因此，为得到高光学纯度的(S)-乙酸苏合香酯，增加一定的酶量或降低底物浓度，进行反应条件的优化。最终得到了底物的对映体过量值(e.e._s)高达99.5％的(S)-乙酸苏合香酯。

5.1 pH对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

同4.1中配制不同pH的缓冲液，在各种pH缓冲液反应体系中加入浓度为440mg/mL固定化的胞外蛋白酶，2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，在35℃下以200rpm反应10h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算底物酯对映体过量值e.e._s和底物转化率C，结果见图8。

公式3：

S_ac和R_ac分别表示(S)-乙酸苏合香酯和(R)-乙酸苏合香酯的峰面积。

从图8中可看出在50mM的磷酸钠缓冲液(PB)pH7.5时，底物的对映体过量值最高为98.0％，和较好的转化率62.1％，故pH 7.5的50mM磷酸钠缓冲液适合固定化的胞外蛋白酶拆分2.5mM(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(S)-乙酸苏合香酯。

5.2温度对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 7.5的50mM PB反应体系中加入浓度为440mg/mL固定化的胞外蛋白酶，2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，于不同温度(20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃)下以200rpm反应10h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e._s和C，结果见图9。结果表明温度为35℃时，酶对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其底物酯的对映体过量值和底物转化率分别为98.8％和64.3％，随着反应温度的升高底物对映体过量值e.e._s逐渐增大，到35℃时达到最高，温度再升高时e.e._s便逐渐减小。故温度为35℃时适合固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯得到高光学纯度的(S)-乙酸苏合香酯。

5.3酶量对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 7.5的50mM PB反应体系中分别加入浓度为120mg/mL、160mg/mL、200mg/mL、240mg/mL、280mg/mL、320mg/mL、360mg/mL、400mg/mL、440mg/mL、480mg/mL的固定化的胞外蛋白酶，2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，于35℃下以200rpm反应10h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e._s和C，结果见图10。表明酶量为440mg/mL时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其底物酯的对映体过量值和底物转化率分别为98.3％和64％。酶量过高或过低都会降低拆分效果。

5.4底物浓度对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在加有440mg/mL固定化的胞外蛋白酶的pH 7.5(50mM PB)的反应体系中分别加入浓度为2.5mM、5mM、10mM、15mM、20mM、30mM、40mM、50mM的底物(±)-乙酸苏合香酯，于35℃下以200rpm反应10h，用气相色谱手性柱检测并计算e.e._s和C，结果见图11。表明底物浓度为2.5mM时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其底物酯的对映体过量值和转化率分别为98％和62.1％。随着底物浓度的增加，其e.e._s值逐渐降低。

5.5反应时间对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 7.5(50mM PB)的缓冲液体系中加入440mg/mL固定化的胞外蛋白酶，2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，于35℃下以200rpm分别反应1h、2h、4h、6h、8h、10h、12h，然后用气相色谱检测并计算e.e._s和C，结果见图12。显示反应时间为10h时，对(±)-乙酸苏合香酯的拆分效果最佳，其底物酯的对映体过量值e.e._s和转化率C分别为98.8％和61％。随着反应时间的延长，底物e.e._s值逐渐升高，10h时达到最大，时间再增加，e.e._s改变不大但底物转化率增大，不利于拆分反应。

5.6金属离子和表面活性剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 7.5的50mM PB反应体系加入浓度为440mg/mL固定化的胞外蛋白酶，2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，2mM金属氯化盐或0.05％(w/v)的表面活性剂，以未加金属盐或表面活性剂为对照，在35℃下反应10h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e._s和C，结果见表5。

表5金属离子与表面活性剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表5可以看出绝大多数金属离子及表面活性剂的存在降低了胞外蛋白酶的立体选择性，Ca²⁺，Mg²⁺，Al³⁺和Fe³⁺在一定程度上对胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯得到的(S)-乙酸苏合香酯的立体选择有促进作用，Cu²⁺，Ni²⁺尤其是表面活性剂SDBS对拆分有非常明显的抑制作用。

5.7有机溶剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

在pH 7.5的50mM PB反应体系加入终浓度为440mg/mL固定化的胞外蛋白酶，2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯，5％(v/v)有机溶剂，以未加有机溶剂为对照，在35℃下200rpm反应10h，用气相色谱手性柱检测，根据峰面积计算e.e._s和C，结果见表6。

表6有机溶剂对固定化的胞外蛋白酶拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响

从表6可以看出有机溶剂的存在基本都降低了胞外蛋白酶的立体选择性，DMSO的存在对拆分制备(S)-乙酸苏合香酯的效果影响不大。最适条件下(反应体系为：2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯、440mg/mL的固定化的胞外蛋白酶、2mM Ca²⁺，其余为pH7.5的磷酸钠缓冲液(PB)；反应条件为：35℃反应10h)反应前后气相色谱图见图13、图15。最适条件下制备得到了光学纯度大于99％的(S)-乙酸苏合香酯(转化率61％，产率71％)(见图16)。

序列表

<110> 中国科学院南海海洋研究所

<120> 芽孢杆菌DL-2的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1450

<212> DNA

<213> 芽孢杆菌DL-2(Bacillus sp. DL-2)

<400> 1

tttggtccac cttaggcggc tagctcctta cggttactcc accgacttcg ggtgttacaa 60

actctcgtgg tgtgacgggc ggtgtgtaca aggcccggga acgtattcac cgcggcatgc 120

tgatccgcga ttactagcga ttccagcttc atgtaggcga gttgcagcct acaatccgaa 180

ctgagaatgg ttttatggga ttggcttgac ctcgcggtct tgcagccctt tgtaccatcc 240

attgtagcac gtgtgtagcc caggtcataa ggggcatgat gatttgacgt catccccacc 300

ttcctccggt ttgtcaccgg cagtcacctt agagtgccca actaaatgct ggcaactaag 360

atcaagggtt gcgctcgttg cgggacttaa cccaacatct cacgacacga gctgacgaca 420

accatgcacc acctgtcact ctgtcccccg aaggggaacg ctctatctct agagttgtca 480

gaggatgtca agacctggta aggttcttcg cgttgcttcg aattaaacca catgctccac 540

cgcttgtgcg ggcccccgtc aattcctttg agtttcagtc ttgcgaccgt actccccagg 600

cggagtgctt aatgcgttag ctgcagcact aaagggcgga aaccctctaa cacttagcac 660

tcatcgttta cggcgtggac taccagggta tctaatcctg tttgctcccc acgctttcgc 720

gcctcagcgt cagttacaga ccaaaaagcc gccttcgcca ctggtgttcc tccacatctc 780

tacgcatttc accgctacac gtggaattcc gcttttctct tctgcactca agttccccag 840

tttccaatga ccctccacgg ttgagccgtg ggctttcaca tcagacttaa gaaaccgcct 900

gcgcgcgctt tacgcccaat aattccggat aacgcttgcc acctacgtat taccgcggct 960

gctggcacgt agttagccgt ggctttctgg ttaggtaccg tcaaggtacg agcagttact 1020

ctcgtacttg ttcttcccta acaacagagt tttacgaccc gaaagccttc atcactcacg 1080

cggcgttgct ccgtcagact ttcgtccatt gcggaagatt ccctactgct gcctcccgta 1140

ggagtctggg ccgtgtctca gtcccagtgt ggccgatcac cctctcaggt cggctatgca 1200

tcgttgcctt ggtgagccgt tacctcacca actagctaat gcaccgcggg cccatctgta 1260

agtgatagcc gaaaccatct ttcaatcatc tcccatgaag gagaagatcc tatccggtat 1320

tagcttcggt ttcccgaagt tatcccagtc ttacaggcag gttgcccacg tgttactcac 1380

ccgtccgccg ctaacgtcat agaagcaagc ttctaatcag tcgctcgact gcatgtatag 1440

cacccgccac 1450

Claims (10)

1.芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2所产的胞外蛋白酶在催化(±)-乙酸苏合香酯不对称水解中的应用；所述的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2，其保藏编号为：GDMCC 1.1556。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述的胞外蛋白酶为固定化的胞外蛋白酶。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的固定化的胞外蛋白酶是通过以下方法制备的：将芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2接种到液体培养基中进行发酵培养，得到发酵液，离心取上清液得到粗酶液，按每100mL的粗酶液加入5g硅藻土的量加入硅藻土，经吸附、抽滤、干燥后得到固定化的胞外蛋白酶。

4.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2所产的胞外蛋白酶在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(R)-1-苯乙醇中的应用。

5.根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(R)-1-苯乙醇是在金属离子、表面活性剂或有机溶剂存在环境下进行的。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的金属离子为K⁺、Ca²⁺、Co²⁺、Mn²⁺、Al³⁺或Fe³⁺；所述的表面活性剂为三聚磷酸钠；所述的有机溶剂为N,N-二甲基甲酰胺或正丙醇。

7.根据权利要求5所述的应用，所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(R)-1-苯乙醇的反应体系为：包括360mg/mL固定化的胞外蛋白酶、5mM底物(±)-乙酸苏合香酯和2mM Mn^{2 +}，其余为pH6.5的磷酸钠缓冲液；反应条件为：20℃反应2h。

8.根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，所述的芽孢杆菌Bacillus sp.DL-2所产的胞外蛋白酶在催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(S)-乙酸苏合香酯中的应用。

9.根据权利要求8所述的应用，其特征在于，所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(S)-乙酸苏合香酯是在金属离子存在环境下进行的；所述的金属离子为Ca²⁺或Mg²⁺。

10.根据权利要求9所述的应用，所述的催化拆分(±)-乙酸苏合香酯得到(S)-乙酸苏合香酯的反应体系为：包括440mg/mL固定化的胞外蛋白酶、2.5mM底物(±)-乙酸苏合香酯和2mM Ca²⁺或Mg²⁺，其余为pH7.5的磷酸钠缓冲液；反应条件为：35℃反应10h。