CN104962533A - 一种新型酯酶及其编码基因和在拆分(±)-1-苯乙醇和(±)-乙酸苏合香酯中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开一种新型酯酶及其编码基因和在拆分(±)-1-苯乙醇和(±)-乙酸苏合香酯中的应用。酯酶氨基酸序列如SEQ ID NO.2，核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。在水相中对(±)-乙酸苏合香酯进行不对称水解，得到对映体过量值为95％的(S)-乙酸苏合香酯和对映体过量值大于99％的(R)-1-苯乙醇；在有机相中对(±)-1-苯乙醇进行不对称转酯，得到对映体过量值大于99％的(R)-乙酸苏合香酯和对映体过量为70％的(S)-1-苯乙醇。本发明与传统的化学拆分相比具有反应条件温和、无污染、对映体过量值高的优点，所得产品可以简单加以纯化后用于相应药物的合成。

Description

一种新型酯酶及其编码基因和在拆分(±)-1-苯乙醇和(±)-乙酸苏合香酯中的应用
技术领域：
本发明属于基因工程和生物催化技术领域，具体涉及一种新型酯酶及其编码基因和在拆分(±)-1-苯乙醇和(±)-乙酸苏合香酯中的应用。
背景技术：
酯酶(Esterase)是一种能催化酯键水解和合成的酶的总称，在催化酯键水解时产生甘油和脂肪酸；在催化酸的羧基与醇的羟基进行脱水缩合反应时则产生酯类等香味物质。酯酶广泛的存在于动物、植物和微生物中，其中动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源。目前酯酶已经被广泛的应用于食品酿造、农业、医药化学、制浆造纸工业、污水处理和生物修复等领域。
1-苯乙醇等手性仲醇与酯是精细有机化学品合成的重要中间体，在医药、农药和化工等领域有着广泛的应。其中，光学纯对映体的制备是手性化合物合成中的关键步骤。传统的制备法是从消旋的芳香醇或者酯经多级拆分得到，不仅步骤繁琐和产物纯度低，而且容易对环境造成污染。目前，利用酯酶/脂肪酶高度的立体选择性，在水相或者有机相中进行水解或酯化反应，进而拆分制备单一手性醇和酯倍受人们的关注。该方法不仅简化了生产步骤，而且节省成本，具有很大的经济效益。
目前，国内外研究人员对1-苯乙醇的生物法拆分已取得一定成果。其中，单海霞等人在新型1,3-二丁基咪唑离子液体中利用一个来自假单胞菌的商业化脂肪酶PCL催化折分(R,S)-1-苯乙醇获得较理想的效果，1-苯乙醇的转化率达50％，对映体过量值eep＞99％；严祥辉等人用壳聚糖修饰的MCM-48固定化脂肪酶PCL拆分(R,S)-1-苯乙醇，经过条件优化后得到，1-苯乙醇的转化率(C)达到46.9％，(S)-1-苯乙醇的对映体过量值(ees)达到87.5％，产物(R)-1-乙酸苯乙酯的对映体过量值(eep)大于99％，对映选择性参数(E)为576；张立根和陈华宝等人利用生物催化法制备光学纯的1-苯乙醇同样取得较理想的结果；Isabel Hoffmann等人研究来自Burkholderia cepacia(BCL)的脂肪酶，并固定化在淀粉膜上，对(R,S)-1-苯乙醇进行手性拆分，获得转化率为9％，(R)-酯的ee值>99％；Wei Baia、Jing-Yun Wang等对1-苯乙醇的手性拆分也取得了不错的成果。
然而，目前报道的这些制备光学纯1-苯乙醇的方法多是在非水相体系中以消旋的1-苯乙醇和乙酸乙烯酯为底物利用脂肪酶的转酯化功能进行拆分，而脂肪酶在非水相中活性相对较低，这样反应时间较长，造成耗能较高。在水相中酯酶/脂肪酶普遍具有较高的活性，因此有必要对酯酶/脂肪酶在水相中对消旋1-苯乙醇的手性拆分进行研究。
发明内容：
本发明的目的是提供一种来源于印度洋深海的芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 15121的新型酯酶BSE01281。
本发明的新型酯酶，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的第二个目的是提供一种编码上述酯酶的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQID NO.1所示。
本发明的第三个目的是提供上述酯酶在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用。
本发明的第四个目的是提供上述酯酶在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用。
所述的酯酶在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用，其特征在于，酯酶BSE01281经冷冻干燥制成酶粉，在酯酶BSE01281酶粉存在的情况下，在有机相中对(±)-1-苯乙醇进行转酯，酯酶BSE01281催化(R)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应生成(R)-乙酸苏合香酯，然后再将(R)-乙酸苏合香酯和(S)-1-苯乙醇进行分离，所述的酯酶BSE01281，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的酯酶在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用，具体步骤优选如下：
往反应器中加入反应介质，再加入(±)-1-苯乙醇、乙酸乙烯酯和酯酶BSE01281酶粉形成转酯反应体系，在适当温度和转速下，酯酶BSE01281酶粉催化(R)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯生成(R)-乙酸苏合香酯，最终得到(R)-乙酸苏合香酯和(S)-1-苯乙醇。
进一步优选，在上述转酯反应体系中，(±)-1-苯乙醇的初始反应浓度为50mM，(±)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯的浓度比为1:1～1:40，酯酶BSE01281酶粉用量为20g/L，反应温度为30～70℃，反应摇床转速为200转/分钟，反应时间为12～96小时。
所述的反应介质优选为丙酮、正己烷、二甲苯、二氯甲烷、甲苯、三氯甲烷、1,4-二氧六环、乙酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯、异丙醇、异辛烷和乙腈。
按照上述拆分(±)-1-苯乙醇的方法进行拆分，最高转化率为41％，底物(S)-1-苯乙醇的对映体过剩值ees(T)为70％，产物(R)-乙酸苏合香酯eep(T)值>99％。
所述的酯酶在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用，其特征在于，在酯酶BSE01281存在的情况下，在水相中对(±)-乙酸苏合香酯进行水解，酯酶BSE01281催化(R)-乙酸苏合香酯生成(R)-1-苯乙醇，然后再将(S)-乙酸苏合香酯和(R)-1-苯乙醇进行分离，所述的酯酶BSE01281，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
所述的酯酶在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用，具体步骤优选如下：
往反应器中加入反应缓冲液，再加入(±)-乙酸苏合香酯和酯酶BSE01281形成水解反应体系，在适当温度下，酯酶BSE01281催化(R)-乙酸苏合香酯生成(R)-1-苯乙醇，然后用正己烷进行萃取，从有机相中得到(S)-乙酸苏合香酯和(R)-1-苯乙醇。
进一步优选，在上述水解反应体系中，反应缓冲液的pH值为6～9，(±)-乙酸苏合香酯的初始反应浓度为50mM，酯酶BSE01281用量为40mg/L，反应温度为20～60℃，反应时间为1～16小时。
所述的反应缓冲液，优选为100mM、pH分别为6.0、7.0和8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或100mM、pH分别为8.0、9.0和10.0的TriS-HCl缓冲液。
按照上述拆分(±)-乙酸苏合香酯的方法进行拆分，底物转化率为49％时，底物(S)-乙酸苏合香酯的对映体过量值ees(H)最高为95％，产物(R)-1-苯乙醇eep(H)值>99％。
本发明的第五个目的是提供了酯酶BSE01281在拆分(±)-乙酸苏合香酯获得光学纯(R)-1-苯乙醇和光学纯(S)-乙酸苏合香酯中的应用，所述的酯酶BSE01281，其氨基酸序列如SEQ IDNO.2所示。
本发明的第六个目的是提供了酯酶BSE01281在拆分(±)-1-苯乙醇获得光学纯(S)-1-苯乙醇和光学纯(R)-乙酸苏合香酯中的应用，所述的酯酶BSE01281，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
本发明的酯酶BSE01281，水解活性最高的底物为对硝基苯基乙酸酯(p-NP C2)，其次为对硝基苯基丁酸酯(p-NP C4)。反应的最适pH值为8.5，在pH＝7.5～10.0之间具有较高的水解活性。反应的最适温度为50℃，45～60℃之间保留有较高的水解活性。
本发明的(±)-乙酸苏合香酯是指(R)-乙酸苏合香酯和(S)-乙酸苏合香酯的混合物；(±)-1-苯乙醇是指(R)-1-苯乙醇和(S)-1-苯乙醇的混合物。
本发明与传统的化学拆分相比，具有反应条件温和、无污染、对映体过量值高的优点；与目前报道的酶法催化拆分相比，所用酯酶EST04211优先水解S构型的扁桃酸甲酯得到光学纯的R-扁桃酸甲酯，立体选择性强。所得产品可以简单加以纯化后用于相应药物的合成。
附图说明：
图1是酯酶BSE01281对不同底物p-NP(C2-C12)进行水解分析的图；
图2是以p-NP C2为底物，在不同pH的缓冲液下分析酯酶BSE01281水解活性的影响图；
图3是以p-NP C2为底物，在pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液下分析不同反应温度对酯酶BSE01281水解活性的影响图；
图4是酯酶BSE01281催化(±)-乙酸苏合香酯水解以及(±)-1-苯乙醇转酯化的过程方程式，其中，a是催化(±)-乙酸苏合香酯水解，b是催化(±)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯酯化反应；
图5是酯酶BSE01281催化(±)-乙酸苏合香酯水解以及(±)-1-苯乙醇转酯化分别得到(R)-1-苯乙醇和(S)-乙酸苏合香酯，以及(R)-乙酸苏合香酯和(S)-1-苯乙醇的手性GC分析图，其中，a是(±)-乙酸苏合香酯底物，b是(±)-1-苯乙醇底物，c是(R)-1-苯乙醇标样，d是(±)-乙酸苏合香酯水解产物，e是(±)-1-苯乙醇转酯产物；
图6是酯酶BSE01281催化(±)-乙酸苏合香酯水解不同反应时间对拆分效果的分析图；
图7是酯酶BSE01281催化(±)-1-苯乙醇转酯化不同反应温度对拆分效果的分析图；
图8是酯酶BSE01281催化(±)-1-苯乙醇转酯化不同底物比对拆分效果的分析图；
图9是酯酶BSE01281催化(±)-1-苯乙醇转酯化不同反应时间对拆分效果的分析图。
具体实施方式：
以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。
实施例1：
1、芽孢杆菌的分离与鉴定
芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 15121分离自印度洋(89°29.22′E，10°00.12′N)-3400米深海泥，培养好的菌体用于总DNA的提取。
2、酯酶EST01281基因的克隆、表达及酶粉制备
根据全基因组中EST01281基因序列的分析，设计相应引物扩增该基因并连接到表达载体pET-28a(+)上，然后导入大肠杆菌BL21(DE3)进行高效表达。
设计引物如下：上游引物为5′-TGCTAGCCATATGTCAAACCATTCACCGATTACCC-3′；下游引物为5′-CGAATTCTTATTTACTGAAAAAACGTAATATAC-3′，上下游引物的5′端分别设计了NdeI和EcoRI酶切位点(下划线标记部分)，以芽孢杆菌(Bacillus sp.)SCSIO 15121的基因组DNA为模板，进行PCR扩增，对PCR产物进行测序，上述引物扩增得到的PCR产物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，其含有885bp的碱基，命名为酯酶EST01281基因，将其在NCBI中进行blastx比对分析，表明其与来源Bacillus licheniformis的羧酸酯酶(Carboxylesterase,GI:647499300)具有99％的一致性。该羧酸酯酶只在蛋白质数据库中进行了序列注释并未对其功能进行鉴定(链接http://www.ncbi.nlm.nih.gov/protein/647499300)，并且目前没有发现对这个羧酸酯酶的功能进行相应的鉴定和在手性拆分中的应用的报道。酯酶EST01281基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示，含有294个氨基酸，命名为酯酶EST01281。
对上述含有酯酶EST01281基因的PCR产物用胶回收试剂盒(OMEGA BIO-TEK产品)纯化回收目的扩增片段，分别用NdeI和EcoRI(购自ThermoFisher公司)酶切含有酯酶EST01281基因的PCR产物(目的扩增片段)和表达质粒pET-28a(+)(购自Novagen公司)，然后将酶切产物进行连接，使酯酶EST01281基因插入到表达质粒pET-28a(+)中，经测序验证，确认酯酶EST01281基因插入到表达质粒pET-28a(+)的NdeI和EcoRI位点之间，由此得到重组表达质粒pET-28a(+)-EST01281。
把重组表达质粒pET-28a(+)-EST01281转化到大肠杆菌BL21(DE3)菌株的感受态细胞(购自北京全式金生物技术有限公司)中，挑取转化子于LB液体培养基中，在37℃摇床中培养，当OD600达到0.8左右时，加入IPTG使其终浓度达到0.2mmol/L，转置20℃继续培养20h进行诱导表达。诱导表达培养好的发酵液离心收集菌体，利用破胞缓冲液洗涤菌体一次，再利用破胞缓冲液重悬菌体后在冰浴条件下利用超声波进行破胞，破胞至菌液澄清，11000rpm/min离心20分钟离心收集上清，所收集的上清液即为粗酶液，可用于纯酶与酶粉的制备。粗酶液通过镍离子亲和层析柱纯化后得到纯酶(由酯酶EST01281基因编码的酯酶EST01281，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示)。酶粉直接用粗酶液冻结后，在冷冻干燥机中制备。
3、酯酶EST01281的水解活性分析
标准反应体系为1mL，包含2μg纯酶(酯酶EST01281)，2mM的p-NP酯底物，100mM的pH＝7.0的磷酸盐缓冲液，30℃反应10分钟，然后利用酶标仪在405nm处检测底物的水解情况，并以相对酶活性进行表征。
(1)底物特异性分析
按照标准反应体系，对不同底物p-NP(C2-C12)进行水解分析，结果如图1所示。
酯酶EST01281水解活性最高的底物为对硝基苯基乙酸酯(p-NP C2)，其次为对硝基苯基丁酸酯(p-NP C4)与对硝基苯基己酸酯(p-NP C6)。
(2)最适反应pH值的分析
按照标准反应体系，以p-NP C2为底物，在不同pH的缓冲液下分析酯酶EST01281的水解活性，结果见图2。
酯酶EST01281的最适pH值为8.5，在pH＝7.5～10.0之间具有较高的水解活性。
(3)最适反应温度的分析
按照标准反应体系，以p-NP C2为底物，在pH＝8.5的Tris-HCl缓冲液下分析不同反应温度对酯酶EST01281水解活性的影响，结果见图3。
酯酶EST01281的最适温度为50℃，45～60℃之间保留有较高的水解活性。
4、酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响分析
酯酶BSE01281催化(±)-乙酸苏合香酯水解的过程方程式如图4(a)所示。
(1)不同温度中酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响分析
用100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液(pH＝8.0)配制一定量终浓度为50mM的(±)-乙酸苏合香酯，按0.5ml每管的体积分装到10个EP管中，其中5个加入20μg酯酶BSE01281后分别置于20℃、30℃、40℃、50℃和60℃的恒温装置下反应，反应4h后加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物，然后加入500μl正己烷进行萃取，取上层有机相用气相色谱进行检测，正己烷中得到(R)-1-苯乙醇和(S)-乙酸苏合香酯，如图5所示。与此同时，另外5个EP管不加任何酶也分别置于20℃、30℃、40℃、50℃和60℃的恒温装置下作为对照实验。
气相色谱仪为福立GC-9790Ⅱ，配备氢火焰离子化检测器，以氮气为载气。手性色谱柱为安捷伦产品112-6632CYCLOSIL-B(30m×0.25mmID,0.25μm df)，进样器和检测器温度分别为250℃和280℃，升温程序为：先60℃保持1分钟，然每分钟升温15℃至120℃保持1分钟，再每分钟升温10℃至200℃保持1分钟。水解反应的对映体过量值(ee(H))、底物转化率(c(H))和对映体选择率(E(H))按照下列公式计算：
c ( H ) = ee s ( H ) ee s ( H ) + ee p ( H ) - - - ( 3 )
E ( H ) = l n [ 1 - c ( H ) ( 1 + ee p ( H ) ) ] l n [ 1 - c ( H ) ( 1 - ee p ( H ) ) ] - - - ( 4 )
ees(H)和eep(H)分别为反应后检测得到的(S)-乙酸苏合香酯和(R)-1-苯乙醇的对映体过量值。(检测方法以下实施例同)
不同反应温度的拆分效果如表1所示。
表1.不同反应温度的拆分效果
a为100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液
b为100mM的TriS-HCl缓冲液
从表1可以看出，反应4h后，在40℃下酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯的底物转化率、对映体过量值和和对映体选择率均比其他温度下要高，故酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适温度为40℃，而当反应温度达到60℃时，拆分效果很差。
(2)不同pH缓冲液中酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响分析
用不同pH值的缓冲液配制一定量终浓度为50mM的(±)-乙酸苏合香酯(100mM的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液pH分别为6.0、7.0和8.0；100mM的TriS-HCl缓冲液pH分别为8.0、9.0和10.0)。每种pH按0.5ml每管的体积分装到2个EP管中，其中一个加入20μg酯酶BSE01281后置于40℃的恒温装置下反应，另外一个不加酶做对照，反应4h后加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物，然后加入500μl正己烷进行萃取，取上层有机相用气相色谱进行检测，不同pH条件下的拆分效果如表1所示。
从表1可以看出，在不同pH值的缓冲液条件下，酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯差别不是很大，当pH＝8.0时，各种拆分参数最好，所以酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯的最适缓冲液为pH＝8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或者pH＝8.0的TriS-HCl缓冲液。
(3)不同反应时间酯酶BSE01281水解拆分(±)-乙酸苏合香酯的影响分析
用pH值等于8.0的磷酸盐缓冲液配制一定量终浓度为50mM的(±)-乙酸苏合香酯，按0.5ml每管的体积分别分装到10个EP管中(其中5个加入20μg酯酶BSE01281)，分成5组并置于40℃的恒温装置下反应，每组反应不同时间(1h、2h、4h、8h、16h)后，取出加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物，然后加入500μl正己烷进行萃取，取上层有机相用气相色谱进行检测，不同反应时间对拆分效果的影响如图6所示。当反应8h时，底物转化率达到49％，(S)-乙酸苏合香酯的对映体过量值为95％，(R)-1-苯乙醇的过量值为>99％。而当反应时间继续延长时，(R)-1-苯乙醇的过量值有所下降(反应16h时为96％)。
5、酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇的影响分析
酯酶BSE01281催化(±)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯酯化反应的过程方程式如图4(b)所示。
(1)不同反应介质对酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇的影响分析
分别用正己烷、二甲苯、二氯甲烷等(表2中所示的反应介质)作为反应介质，加入终浓度为50mM的(±)-1-苯乙醇和500mM的乙酸乙烯酯，再加入20g/L酯酶BSE01281酶粉形成反应体积为5ml的反应混合液，然后置于50℃、200转/分钟的摇床中反应24h。反应结束后，加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物并离心除去酶粉，取上清用气相色谱进行检测，检测条件和各种参数的计算方法同实施例4，其中底物转化率用c(T)表示，底物(S)-1-苯乙醇的对映体过量值用ees(T)表示，产物(R)-乙酸苏合香的对映体过量值用eep(T)表示，对映体选择率用E(H)表示。酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇得到(S)-1-苯乙醇和(R)-乙酸苏合香酯，如图5所示。不同反应介质下，酯酶BSE01281对拆分(±)-1-苯乙醇的效果如表2所示。从表中可以看出，反应特定时间时以丙酮为反应介质酯酶BSE01281对(±)-1-苯乙醇的拆分效果最好，转化率为23％，(S)-1-苯乙醇的ees(T)为30％，产物(R)-乙酸苏合香的eep(T)值>99％，对映体选择率E(H)>266。
表2.不同反应介质的拆分结果
“-”表示没有活性
(2)不同温度中酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇的影响分析
用丙酮作为反应介质，加入终浓度为50mM的(±)-1-苯乙醇和500mM的乙酸乙烯酯，再加入20g/L酯酶BSE01281酶粉形成反应体积为5ml的反应混合液，然后分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃条件下，200转/分钟，反应24h。反应结束后，加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物并离心除去酶粉，取上清用气相色谱进行检测，结果如图7所示。从图中可以看出，在50℃条件下酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇的效果最好。当反应温度高于60℃时，转化率、产物(R)-乙酸苏合香的eep(T)值等均迅速下降。
(3)不同底物摩尔比对酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇的影响分析
用丙酮作为反应介质，加入固定量终浓度为50mM的(±)-1-苯乙醇和不同浓度的乙酸乙烯酯(摩尔比从1:1～1:40)，再分别加入20g/L酯酶BSE01281酶粉形成反应体积为5ml的反应混合液，然后置于50℃条件下，200转/分钟，反应24h。反应结束后，加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物并离心除去酶粉，取上清用气相色谱进行检测，结果如图8所示。从图中可以看出，当底物摩尔比达到1:10时，酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇的效果达到最佳。
(4)不同反应时间对酯酶BSE01281转酯化拆分(±)-1-苯乙醇的影响分析
用丙酮作为反应介质，加入终浓度为50mM的(±)-1-苯乙醇和500mM的乙酸乙烯酯(摩尔比为1:10)，再分别加入20g/L酯酶BSE01281酶粉形成反应体积为5ml的反应混合液，然后置于50℃条件下，200转/分钟，分别反应12～96h。反应不同时间后，加入终浓度为5mM的十二烷作为内标物并离心除去酶粉，取上清用气相色谱进行检测，结果如图9所示。从图中可以看出，反应进行到72h时，各种参数达到最佳值，转化率为41％，(S)-1-苯乙醇的eeS(T)为70％，产物(R)-乙酸苏合香的eep(T)值>99％。
以上所述实施方式是为了更好的解释本发明，而不应该被解释为限制本发明，所述内容属于本发明的主要内容，但并不仅仅限于这些内容。有些可以显而易见地扩展的内容虽然并未在说明书中出现，但也应属于本发明的专利请求范围。

Claims (14)

1.一种酯酶BSE01281，其特征在于，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
2.一种编码权利要求1所述的酯酶BSE01281的基因，其特征在于，其核苷酸序列如SEQ IDNO.1所示。
3.权利要求1所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用。
4.权利要求1所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用。
5.根据权利要求3所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用，其特征在于，酯酶BSE01281经冷冻干燥制成酶粉，在酯酶BSE01281酶粉存在的情况下，在有机相中对(±)-1-苯乙醇进行转酯，酯酶BSE01281催化(R)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯发生转酯反应生成(R)-乙酸苏合香酯，然后再将(R)-乙酸苏合香酯和(S)-1-苯乙醇进行分离，所述的酯酶BSE01281，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
6.根据权利要求5所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用，其特征在于，具体步骤为：往反应器中加入反应介质，再加入(±)-1-苯乙醇、乙酸乙烯酯和酯酶BSE01281酶粉形成转酯反应体系，在适当温度和转速下，酯酶BSE01281酶粉催化(R)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯生成(R)-乙酸苏合香酯，最终得到(R)-乙酸苏合香酯和(S)-1-苯乙醇。
7.根据权利要求6所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用，其特征在于，在转酯反应体系中，(±)-1-苯乙醇的初始反应浓度为50mM，(±)-1-苯乙醇与乙酸乙烯酯的浓度比为1:1～1:40，酯酶BSE01281酶粉用量为20g/L，反应温度为30～70℃，反应摇床转速为200转/分钟，反应时间为12～96小时。
8.根据权利要求6所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-1-苯乙醇中的应用，其特征在于，所述的反应介质为丙酮、正己烷、二甲苯、二氯甲烷、甲苯、三氯甲烷、1,4-二氧六环、乙酸乙烯酯、乙酸异丙烯酯、异丙醇、异辛烷和乙腈。
9.根据权利要求4所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用，其特征在于，在酯酶BSE01281存在的情况下，在水相中对(±)-乙酸苏合香酯进行水解，酯酶BSE01281催化(R)-乙酸苏合香酯生成(R)-1-苯乙醇，然后再将(S)-乙酸苏合香酯和(R)-1-苯乙醇进行分离，所述的酯酶BSE01281，其氨基酸序列如SEQ ID NO.2所示。
10.根据权利要求9所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用，其特征在于，具体步骤为：往反应器中加入反应缓冲液，再加入(±)-乙酸苏合香酯和酯酶BSE01281形成水解反应体系，在适当温度下，酯酶BSE01281催化(R)-乙酸苏合香酯生成(R)-1-苯乙醇，然后用正己烷进行萃取，从有机相中得到(S)-乙酸苏合香酯和(R)-1-苯乙醇。
11.根据权利要求10所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用，其特征在于，在水解反应体系中，反应缓冲液的pH值为6～9，(±)-乙酸苏合香酯的初始反应浓度为50mM，酯酶BSE01281用量为40mg/L，反应温度为20～60℃，反应时间为1～16小时。
12.根据权利要求10所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-乙酸苏合香酯中的应用，其特征在于，所述的反应缓冲液为100mM、pH分别为6.0、7.0和8.0的磷酸氢二钠-磷酸二氢钠缓冲液或100mM、pH分别为8.0、9.0和10.0的TriS-HCl缓冲液。
13.权利要求1所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-乙酸苏合香酯获得光学纯(R)-1-苯乙醇和光学纯(S)-乙酸苏合香酯中的应用。
14.权利要求1所述的酯酶BSE01281在拆分(±)-1-苯乙醇获得光学纯(S)-1-苯乙醇和光学纯(R)-乙酸苏合香酯中的应用。
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