CN101781650B - 一种利用微小rna高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种利用微小RNA(microRNA，miRNA)高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法，属于基因工程的技术领域，是借助根癌农杆菌介导的双元载体转化系统把水稻miRNA169d基因前体(precusor)反义表达载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus xmedia)细胞中。利用优化的转化方法获得了转基因细胞。结果显示：转空载体的对照细胞褐化严重、细胞停止生长，而转水稻miRNA169d基因前体(precusor)反义表达载体的曼地亚红豆杉细胞则不发生褐化，细胞生长正常。本发明高效地阻止了曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后的褐化现象，解决了曼地亚红豆杉细胞在根癌农杆菌转化后停止生长的难题，为顺利获得曼地亚红豆杉转基因细胞系提供一种新方法。
Description
技术领域
本发明创造涉及一种利用微小RNA(microRNA，miRNA)高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法。它属于上世纪80年代在植物细胞培养的基础上发展起来的基因工程的技术领域。植物细胞悬浮培养技术作为一种新兴的生物技术，能够在大型的生物反应器内大规模生产出有用的药物，具有重要的应用价值。
背景技术
紫杉醇(taxol)是Wall等首次从短叶红豆杉(Taxus Brevifolia)树皮中分离得到的一种重要的二萜类植物次生代谢产物。它在临床已用于治疗卵巢癌、肺癌、膀胱癌、子宫癌及AIDS相关的Karposis肉瘤等的治疗，是目前应用最广泛的天然抗癌药物之一。然而，目前紫杉醇主要从红豆杉植物树皮中提取，生产1kg的紫杉醇就需要2000-3000棵红豆杉的2000磅重的树皮。由于乱砍滥伐，红豆杉野生资源遭受到了严重破坏。为解决这一危机，国内外在人工栽培、紫杉醇化学半合成与全合成、内生真菌、红豆杉细胞培养等领域进行了探索。其中红豆杉细胞培养法被认为是最有发展前途的途径之一。同时，随着紫杉醇生物合成途径的逐步阐明及越来越多的关键酶和相关酶的基因的克隆和功能重组表达，利用基因工程方法对红豆杉细胞从基因水平上进行改造或对产紫杉醇的内生真菌菌种进行改造已有可能。已有以大肠杆菌为宿主菌组合紫杉烯合成酶等4种酶的基因产生紫杉烯的报道，且产率达到1.3mg/L，为天然产物生物合成基因的应用提供了借鉴。如果能将细胞培养与基因工程法结合，则很有可能成为解决紫杉醇资源短缺的有效途径。红豆杉紫杉醇生物合成全过程约20步酶促反应，其中紫杉二烯合酶、紫杉二烯-5a-羟化酶、紫杉烷10β-羟化酶、紫杉烷-3a-羟化酶、紫杉二烯-5a-乙酰转移酶、紫杉烷-2a-苯甲酰转移酶、10-去乙酰巴卡亭III-10β-乙酰转移酶、3-氨基-3-苯基丙酰转移酶和3-N-去苯甲酰-2-脱氧紫杉醇苯甲酰转移酶等主要的相关酶基因已成功克隆与表达。其中，紫杉烷14β-羟基化酶(简称14OH)存在于包括紫杉醇在内的各种C-13氧取代的紫杉烷生物合成分支途径中，对该基因表达进行抑制，则有可能阻断中间产物流向C-14氧取代的紫杉烷，而改向生成包括紫杉醇在内的C-13氧取代的紫杉烷的途径，从而大幅度提高后者的产量。经文献检索：Kim等，Journal of Microbiology and Biotechnology，2000，10(1)：91-94，Ketchum等，Plant Cell Reports，2007，26(7)：1025-1033和国际专利：WO2007/081772，分别利用红豆杉的细胞悬浮培养系进行了外源基因的转化试验。根癌农杆菌与红豆杉细胞共培养后，往往发生褐化现象，细胞停止生长。在利用微小RNA(microRNA，miRNA)高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象、保持根癌农杆菌侵染后的曼地亚红豆杉细胞的正常生长方面，国内外均还未见有报道。
发明内容
本发明提供一种利用微小RNA(microRNA，miRNA)高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法，其特征在于：采用根癌农杆菌介导的双元载体转化系统，将水稻微小RNA基因前体(precusor)反义表达载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus x media)愈伤组织细胞中培养。
本发明所述方法，其中所述水稻微小RNA基因前体为水稻miRNA169d基因前体。
本发明所述方法，其中载体质粒为pEGAD，含有绿色荧光基因，载体宿主菌为根癌农杆菌GV3101，曼地亚红豆杉细胞生长和转化所采用的培养基为6，7-V培养基。
本发明的目的是提供一种利用微小RNA高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法，是根癌农杆菌介导的双元载体转化系统，它是在植物细胞培养的基础上发展起来的基因工程领域的新技术内容。在无菌的条件下，将水稻miRNA169d基因前体(precusor)反义表达载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus x media)培养细胞中。转水稻miRNA169d基因前体(precusor)反义表达载体的曼地亚红豆杉细胞则不发生褐化，细胞生长正常。而转空载体的对照细胞褐化严重、细胞停止生长。本发明高效地阻止了曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后的褐化现象，解决了曼地亚红豆杉细胞在根癌农杆菌转化后停止生长的难题，为顺利获得曼地亚红豆杉转基因细胞系提供一种新方法。
附图说明
图1pEG169d(miRNA169d反义载体)构建流程
图2转基因细胞GFP活性检测
图3转空载体的对照组曼地亚红豆杉愈伤组织细胞生长图
图4转水稻miRNA169d基因前体反义表达载体的曼地亚红豆杉细胞生长图
具体实施方式
下面结合实施例进一步说明，但是本发明的保护范围并不局限于此，本技术领域的普通技术人员通过以上内容也能实现本发明的方案都在本发明保护范围之内。
实施例1：用本发明的利用微小RNA高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法，在完成水稻miRNA169d基因前体(precusor)反义表达载体构建的基础上，将水稻miRNA169d基因前体(precusor)反义表达载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus x media)培养细胞中。通过优化的转化方法，使曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后的褐化现象得到显著地抑制，解决了曼地亚红豆杉细胞在根癌农杆菌转化后停止生长的难题。
实验材料：选用本实验室培养的生长状态较好的曼地亚红豆杉细胞系进行转化试验，采用6，7-V培养基(附加0.2mg/L 6-BA，1.5mg/L 2，4-D和2mg/L IAA)对红豆杉愈伤组织细胞进行培养。本试验采用根癌农杆菌GV3101，该菌株具有利福平(rifampicin)抗性，利用该抗性可对其进行筛选。pEGAD载体由中国农科院傅永福赠送。卡那霉素、乙酰丁香酮、利福平、头孢霉素、潮霉素，巯基乙醇，PVP购自sigma公司，RNA抽提试剂，逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)试剂均购自鼎国生物技术有限公司，引物合成、DNA测序由鼎国生物技术有限公司完成。乙腈为色谱纯，其他试剂均为国产分析纯试剂。PCR仪(Gene Amp PCR system 4700)；冷冻干燥机(北京博医康FD-1)；细胞超声破碎仪(宁波新芝JY92-II)；高效液相色谱仪(Waters 2487)；色谱柱(SunFireTM)；HPLC分析软件(Empower)。
具体步骤：
(1)双元载体的构建：根据Sanger microRNA数据库(miRBase)中水稻miRNA 169d基因前体的序列设计其反义引物P1和P2。P1：5’-CGCGGATCCATTTATCGTGTAGCC-3’；P2：5’-CCGGAATTCGGCAAACATGTAGC-3’。同样，为便于构建水稻miRNA169d植物表达载体，分别在P1和P2的5’端设计了BamH I和EcoRI酶切位点。
以纯化后的水稻基因组DNA为模板，用P1和P2进行PCR反应，反应条件为：95℃预变性5min，95℃30s，56℃30s，72℃30s，35个循环，72℃延伸5min。获得的PCR产物胶回收后连接到pGM-T载体上，转化大肠杆菌DH5α，经蓝白斑筛选和质粒酶切鉴定正确后再经过测序验证，以水稻DNA为模板，用引物P1和P2进行PCR反应，获得预期103bp大小的目的片段。利用DNA快速纯化回收试剂盒回收PCR扩增产物，将扩增产物与pGM-T载体连接，经蓝白斑筛选和质粒酶切鉴定正确后送上海生工进行测序。测序结果表明产物为103bp的DNA片段，序列为ATTTATCGTGTAGCCAAGGATGAATTGCCGGCG TTTCACGCTGTTGATGGTGCGTGCATATATAAGTTGGCGCCGGCAAGTCATTTCAGGCTACATGTTTGCC，它与Sanger microRNA数据库(miRBase)中水稻miRNA 169d基因前体的核甘酸排列顺序完全一致，说明miRNA 169d基因克隆成功，获得了克隆载体pT169d。将植物表达载体pEGAD和克隆质粒pT169d分别以BamH I+EcoRI双酶切，回收目的片段并将其反向克隆到pEGAD中，转化大肠杆菌DH5α，将回收的pT169小片段和载体pEGAD进行反向连接，将连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态。取200μl连接产物涂在附加有50mg/L kan的LB琼脂平板上，37℃过夜培养后，平板上长出白色的单菌落。随机挑取三个处理平板上的单菌落进行菌落PCR鉴定。鉴定获得二个阳性克隆，它们均特异地扩增出103bp的目的片段。从鉴定出的阳性克隆提取质粒，经BamH I和EcoRI双酶切后电泳检测，也切出了103bp目的片段。酶切结果与预期结果完全一致，说明水稻miRNA 169d基因反义植物表达载体pEG169d构建成功。构建过程如图1所示。
(2)工程根癌农杆菌的获得：采用电击转化法将pEG169d转入到感受态根癌农杆菌GV3101。在筛选培养基LB+卡那霉素(kan)50mg/L+利福平(Rif)50mg/L上获得菌落。从长有转化根癌农杆菌菌落的平板上各随机挑取几个分隔良好的单菌落，利用菌落PCR方法鉴定出阳性单菌落，从而获得有关工程农杆菌菌株。
(3)农杆菌的活化：首先，在LB+50mg/L卡那霉素+50mg/L利福平的培养基上筛选携带外源基因的农杆菌GV3101。然后，挑取该单菌落置于2ml LB液体培养基中(含50mg/L卡那霉素)，28℃，250rpm条件下培养两天。取培养后的菌液250ul放入25ml LB液体培养基中(含50mg/L卡那霉素，50uM乙酰丁香酮)，28℃，250rpm条件下培养过夜，摇至OD值为1.0-1.2。
(4)细胞的培养：红豆杉细胞生长大周期呈S型，可将其划分为：延迟期(0-15d左右)，对数生长期(15-30d)，静止期(30-35d)。选取处于不同生长期的的红豆杉细胞4g左右，放入12ml6，7-V液体培养基中，24℃，125rpm条件下于悬浮培养液中分别进行1天，3天，9天，14天的振荡培养。
(5)转化：将2.5ml活化好的农杆菌3000g离心15min，去除上清液，在沉淀中加入一定体积的6，7-V液体培养基进行稀释。分别加入2.5ml 6，7-V液体培养基、稀释1倍(加入5ml 6，7-V液体培养基)、稀释2倍(加入10ml 6，7-V液体培养基)的菌液，比较它们的转化效果。取稀释好的菌液500ul放入悬浮培养的细胞体系中，超声30s后，24℃，125rpm条件下共培养。在共培养1-3天后，用含300mg/L头孢霉素的新鲜6，7-V液体培养基清洗细胞3-4遍。每次加入培养基后，于24℃，125rpm条件下摇15min，然后用5ml移液枪吸净液体，再重复上述操作。之后，将细胞转移至含300mg/L头孢霉素的6，7-V固体培养基上。室温条件下生长两周后再将细胞转移至含300mg/L头孢霉素和2.5mg/L Bastar的培养基上。
曼地亚红豆杉细胞转化方法的优化：(1)细胞培养周期中不同时间转化对转化效率的影响.选用不同生长时期的细胞进行转化，其转化效率大不相同。如果在对数生长期的稳定期(21天左右)进行转化，细胞转化率可高达100％；而在对数生长期的初期(15天左右)转化，则很有可能转化失败；若在对数生长期末期(30天左右)、延迟期或静止期转化，细胞转化率仅在30％-40％左右。(2)共转化时间对转化的影响。红豆杉细胞与农杆菌共培养时间在2-3天为宜，如果超过3天，细胞很容易褐化死亡。(3)细胞悬浮天数对转化的影响。我们采用悬浮培养14天，9天，3天，1天的细胞分别进行转化，发现悬浮培养14天，9天的细胞极易褐化死亡而直接导致转化失败；悬浮3天的细胞转化后生长状态明显差于悬浮培养1天的细胞。(4)农杆菌的浓度对转化的影响。农杆菌的浓度对转化也有一定的影响。如果农杆菌在共培养的培养液中浓度过低(稀释倍数2倍)，则红豆杉的细胞转化效率会大大下降；若农杆菌浓度过高，则会抑制细胞的生长，甚至导致细胞死亡，在本实验中农杆菌稀释倍数为1倍时(OD值0.5-0.6)实验效果最佳。在对报告基因的荧光显微镜检测中，经过抗性筛选的转化细胞GFP表达，呈现绿色荧光(图2)。
结果与分析：利用上述方法进行曼地亚红豆杉细胞转化结果显示：转空载体的对照细胞褐化严重、细胞停止生长(图3)，而转水稻miRNA169d基因前体(precusor)反义表达载体的曼地亚红豆杉细胞则不发生褐化，细胞生长正常(图4)。因此，本发明高效地阻止了曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后的褐化现象，解决了曼地亚红豆杉细胞在根癌农杆菌转化后停止生长的难题，为顺利获得曼地亚红豆杉转基因细胞系提供一种新方法。
本发明创造有如下优点：1.能够高效地阻止了曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后的褐化现象。2.有效地解决了曼地亚红豆杉细胞在根癌农杆菌转化后停止生长的难题，从而为顺利获得曼地亚红豆杉转基因细胞系提供了一条新途径。
Claims (3)
1.一种利用微小RNA(microRNA，miRNA)高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法，其特征在于：采用根癌农杆菌介导的双元载体转化系统，将水稻miRNA169d基因前体反义表达载体导入到曼地亚红豆杉(Taxus×media)愈伤组织细胞中。
2.根据权利要求1所述的高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法，其特征在于：载体质粒为pEGAD，含有绿色荧光基因，载体宿主菌为根癌农杆菌GV3101。
3.根据权利要求1所述的高效抑制曼地亚红豆杉细胞根癌农杆菌转化后褐化现象的方法，其特征在于：曼地亚红豆杉细胞生长和转化所采用的培养基为6，7-V培养基。
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