WO2019104759A1 - 一种热稳定性提高的l-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法 - Google Patents

一种热稳定性提高的l-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于生物技术领域，提供了热稳定性提高的L-氨基酸脱氨酶的突变体D340N、L363N及构建方法。所述突变体D340N、L363N的Vmax和t1/2较野生型提高，所述突变体可用于催化L-氨基酸脱氨合成相应的α-酮酸，以及作为手性拆分的氨基酸及其衍生物的催化剂实现D\L-氨基酸对映体分离等。

Description

一种热稳定性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法 技术领域
本发明涉及一种热稳定性提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法，属于生物技术领域。
背景技术
L-氨基酸脱氨酶是一类以FAD为辅酶的黄素蛋白，能够催化L-氨基酸脱氨形成相应α-酮酸和氨。不同来源的L-氨基酸脱氨酶底物特异性差异巨大，一部分L-氨基酸脱氨酶能够利用多种L-氨基酸及氨基酸衍生物，然而有一些L-氨基酸脱氨酶的底物范围较小，甚至只能催化一种氨基酸，这时多数氨基酸脱氨酶会以底物的脱氨作用命名(如甘氨酸脱氨酶)。来自Proteus vulgaris的L-氨基酸脱氨酶可以利用多种氨基酸为底物，一般主要氧化具有长的脂肪族侧链或者芳香族的氨基酸。
L-氨基酸脱氨酶的应用广泛，可以催化L-氨基酸脱氨，形成相应的α-酮酸，不仅产量高，底物转化率高，而且转化过程易控制，目前已用于多种α-酮酸的生产。L-氨基酸脱氨酶可以用于从D\L-氨基酸混合物中，特异性催化L-氨基酸，实现D\L-氨基酸对映体分离。因此，通过分子改造来提高L-氨基酸脱氨酶的热稳定性以提高酶学性质更适合工业化应用的突变酶是目前的研究热点。
发明内容
本发明目的是为了提供一种酶活与热稳定性同时提高的L-氨基酸脱氨酶突变体及其构建方法，提高L-氨基酸脱氨酶的热稳定性，扩展了应用范围。
所述酶活与热稳定性同时提高的L-氨基酸脱氨酶突变体，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2所示的的氨基酸序列。
所述酶活与热稳定性同时提高的L-氨基酸脱氨酶突变体的构建方法，包括如下步骤：
(1)来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的突变位点确定：将L-氨基酸脱氨酶自N端的340的谷氨酸和363位亮氨酸作为饱和突变位点。
(2)L-氨基酸脱氨酶突变体库的建立和突变体筛选：以携带编码所述来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的基因的重组质粒为模板，在第340和363位的密码子用NNK替代，设计兼并引物，进行全质粒PCR反应，构建2个定点饱和突变体库，Dpn I消化模板，纯化后产物直接转入大肠杆菌，将转化后的大肠杆菌涂布于含有50μg/mL的卡纳抗生素平板上，37℃培养16h，得到饱和突变体库。
(3)取2个饱和突变体库的菌落接种到含有卡纳的LB培养基的96孔板中，于37℃过夜培养，得到突变体库的种子液，以2％接种量转接到2块含有600μLTB培养基的96孔深孔板中，于37℃和900rpm的多孔板摇床上培养1.5h，加入终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG，37℃诱导4h后离心收集菌体。
(4)将步骤(3)培养获得的菌体，接种于含有卡纳抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，以2％的接种量接种到TB培养基中，培养到OD600为0.6～0.8时，加0.4mM IPTG诱导，离心收集菌体，采用磷酸盐缓冲液悬浮菌体后，超声破碎，采用1％的曲拉通X-100装配膜蛋白，上清液通过Ni-NTA亲和柱纯化，透析去除咪唑，即可得到纯的L-氨基酸脱氨酶。
进一步的，步骤(2)中大肠杆菌为E.coli BL21(DE3)。
进一步的，步骤(2)所述的重组质粒为pET28a-lad。
进一步的，步骤(2)中全质粒PCR的条件为：98℃2min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共计25个循环；最后72℃10min。
与野生型L-氨基酸脱氨酶相比，本发明的L-氨基酸脱氨酶突变体的热稳定性获得了提高，以37℃的Vmax和半衰期t1/2表示热稳定性提高，本发明的L-氨基酸脱氨酶的酶学性质如表1所示：
表1 L-氨基酸脱氨酶突变体的酶学性质
Figure PCTCN2017116184-appb-000001
本发明采用半理性设计的方法，对来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶进行多轮定点饱和突变，获得L-氨基酸脱氨酶的突变体，突变体D340N、L363N的Vmax和t1/2都有提高。L-氨基酸脱氨酶目前在多个领域有着广泛的应用，如在医药领域，可以作为手性拆分的氨基酸及其衍生物的催化剂，实现D\L-氨基酸对映体分离。也可以催化L-氨基酸脱氨合成相应的α-酮酸。这些物质能在食品化工生物技术等领域都有重要的用途。本发明提高的L-氨基酸脱氨酶突变体能够在如上领域更好的应用。
附图说明
图1本发明实施例1中的分子动力学模拟结果
图2本发明实施例2中的筛选结果
图3本发明实施例3中的失活动力学图
具体实施方式
材料与方法
实施例1饱和突变位点的确定
对L-氨基酸脱氨酶的(如图1)进行分子动力学模拟，结合结构信息，确定如下2个点为饱和突变位点。其中，野生型L-AAD的氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
突变位点的选择具体过程为，将对接后的LAD-Leu复合物结构为初始结构，底物和FAD的结构使用Sybyl优化后，用Gaussian09生成FAD的电荷文件，蛋白的力场参数文件采用Amber16的内置力场参数文件。随后将蛋白-配体复合物放在TIP3P的水盒子中，水盒子半径为12.0，添加Na+离子平衡体系电荷数进行分子动力学模拟。利用Amber16模拟10ns下分子的运动情况，以模拟前的结构为基准，计算蛋白在模拟中的RMSD值。选取RMSF值较大的D340和L363位点，为改造热稳定性的关键位点。
实施例2L-氨基酸脱氨酶突变体文库的建立和突变体筛选
通过实施例1，确定D340和L363位点，为改造热稳定性的关键位点。用如下方法构建L-氨基酸脱氨酶的突变体文库，具体构建方法如下：
(1)以携带编码所述来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的基因的重组质粒pET28a-lad为模板，以如下引物为引物，分别进行全质粒PCR，全质粒PCR的条件为：98℃2min；然后98℃10s，55℃5s，72℃90s，共计25个循环；最后72℃10min。
D340-F：AGCATTACCTNNKTTCCCTGTGCATATTTCT
D340-D：AATAATGGCAGATATTTATAGCCATAAGTGAAGGATTC
L363-F：NNKGATGAAGTTTCTCCGTTTGAGCAATTCAGAAATATG
L363-D：GTTCCAATGCGTTGATTGCATAAATGAATTGA
将PCR后的产物经过DpnI消化后，转入大肠杆菌，并将转化后的大肠杆菌涂布于含有50μg/mL的卡纳抗生素平板上，37℃培养16h，得到饱和突变体库。
(2)突变体的筛选人工序列
将转化后的突变体随机选取88个到含有600μL LB培养基的96孔深孔板中，挑取4个野生菌到同一个96孔板中作为对照菌，余下4孔不挑菌用做阴性对照。37℃培养10h后转接2次，保证种子液的菌体浓度一致。将种子液以2％接种量转接到2块含有600μL TB培养基的96孔深孔板中，于37℃和900rpm的多孔板摇床上培养1.5h，加入终浓度为0.4mmol·L-1的IPTG，37℃诱导4h后离心收集菌体。余下的种子液添加同等体积的30％甘油，-80℃保藏。
初始催化活力的筛选：为了筛选获得高催化活力的突变体，将收集后的菌体中，添加1mL含有100mmol·L-1L-亮氨酸的缓冲液，悬浮菌体，于37℃、900rpm高通量摇床上反应30min，在4℃、4000rpm离心10min，取上清，通过2,4-二硝基苯肼显色法测定α-酮异己酸含量。以野生型菌的催化活力为0点计算其他菌的相对催化活力。
高热稳定性突变体的筛选：将另一块96孔板的菌体中添加1mL不含有底物的缓冲液，悬浮菌体后，于37℃、900rpm下培养8h，再离心收集菌体。添加1mL含有100mmol·L-1L-亮氨酸的缓冲液，悬浮菌体，于37℃、900rpm下反应30min，在4℃、4000rpm离心10min，取上清，通过显色法测定α-酮异己酸含量。以野生型菌的催化活力为原点计算其他菌的相对催化活力。
实施例3酶的催化性质的测定
将实施例2中筛选获得的突变体，接种于含有卡纳抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，以2％的接种量接种到TB培养基中，培养到OD600为0.6～0.8时，加0.4mM IPTG诱导，离心收集菌体，采用磷酸盐缓冲液悬浮菌体后，超声波破碎，采用1％的曲拉通X-100装配膜蛋白，上清液通过Ni-NTA亲和柱纯化，透析去除咪唑，即可得到纯的L-氨基酸脱氨酶。
将携带编码所述来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的基因的重组质粒pET28a-lad经过DpnI消化后，转入大肠杆菌，并将转化后的大肠杆菌涂布于含有50μg/mL的卡纳抗生素平板上，37℃培养16h，再接种于含有卡纳抗生素的LB液体培养基中，37℃过夜培养，以2％的接种量接种到TB培养基中，培养到OD600为0.6～0.8时，加0.4mM IPTG诱导，离心收集菌体，采用磷酸盐缓冲液悬浮菌体后，超声波破碎，采用1％的曲拉通X-100装配膜蛋白，上清液通过Ni-NTA亲和柱纯化，透析去除咪唑，即可得到野生型L-氨基酸脱氨酶。
酶活测定方法：在1mL的反应体系中，以100mmol·L-1L-亮氨酸为底物，分别加入0.1mg·mL-1的野生型L-氨基酸脱氨酶或L-氨基酸脱氨酶突变体D340N或L-氨基酸脱氨酶突变体L363N的酶液，37℃震荡反应半小时，通过HPLC检测α-酮异己酸浓度。酶活计算方法为公式(1)所示，ν是比酶活(μmol·min-1·mg-1)，C1是α-酮异己酸浓度(μmol·L-1)，C2是酶浓度(mg·L-1)，反应时间T是30min。
Figure PCTCN2017116184-appb-000002
HPLC测定α-酮异己酸的方法：利用Agilent 1200液相色谱仪，采用ZORBAX SB-Aq(4.6×250mm，5μm)色谱柱，流动相为0.01mol·L-1的磷酸氢二铵溶液(pH 2.50)-甲醇溶液(90:10，v/v)，流速为0.6mL·min-1，柱温为35℃，在紫外检测波长203nm下检测。
失活动力学测定方法，在37℃条件下，每4h取样一次，以100mM L-亮氨酸为底物，加入50μL野生型L-氨基酸脱氨酶或L-氨基酸脱氨酶突变体D340N或L-氨基酸脱氨酶突变体L363N，在37℃反应30min，测定催化效率。结果如图3所示，突变体D340N的热稳定性最好，在37℃下，半衰期是野生菌的1.42倍(野生菌为8h，D340N为11.4h)。其次为L363N，突变体的半衰期是野生菌的1.12倍(突变体L363N为8.9h)。
虽然本发明已以较佳实施例公开如上，但其并非用以限定本发明，任何熟悉此技术的人，在不脱离本发明的精神和范围内，都可做各种的改动与修饰，因此本发明的保护范围应该以权利要求书所界定的为准。
Figure PCTCN2017116184-appb-000003
Figure PCTCN2017116184-appb-000004
Figure PCTCN2017116184-appb-000005
Figure PCTCN2017116184-appb-000006
Figure PCTCN2017116184-appb-000007
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Figure PCTCN2017116184-appb-000009
Figure PCTCN2017116184-appb-000010
Figure PCTCN2017116184-appb-000011
Figure PCTCN2017116184-appb-000012
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Figure PCTCN2017116184-appb-000016
Figure PCTCN2017116184-appb-000017

Claims (8)

  1. 一种L-氨基酸脱氨酶突变体，其特征在于，具有SEQ ID NO.1或SEQ ID NO.2任一所示的氨基酸序列。
  2. 编码权利要求1所述L-氨基酸脱氨酶突变体的基因。
  3. 携带权利要求2所述基因的细胞。
  4. 根据权利要求3所述的细胞，其特征在于，是大肠杆菌。
  5. 携带权利要求2所述基因的质粒。
  6. 一种构建权利要求1所述的L-氨基酸脱氨酶突变体的方法，其特征在于，包括如下步骤：
    (1)来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的突变位点确定：将L-氨基酸脱氨酶自N端的340的谷氨酸和363位亮氨酸作为饱和突变位点；
    (2)L-氨基酸脱氨酶突变体库的建立和突变体筛选：以携带编码所述来自普通变形杆菌的L-氨基酸脱氨酶的基因的重组质粒为模板，设计兼并引物，进行全质粒PCR反应，构建2个定点饱和突变体库，转入大肠杆菌，得到饱和突变体库；
    (3)从突变体库中筛选得到目标L-氨基酸脱氨酶突变体。
  7. 权利要求1所述L-氨基酸脱氨酶突变体在食品、制药、保健品、饲料、造纸、污水处理中的应用。
  8. 权利要求1所述L-氨基酸脱氨酶突变体催化L-氨基酸脱氨，形成相应的α-酮酸中的应用。
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