CN109097383A - 一种高通量筛选l-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法 - Google Patents

一种高通量筛选l-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法 Download PDF

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Abstract

本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种高通量筛选L‑氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法，包括如下步骤：1.重组菌构建：全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L‑氨基酸脱氨酶（L‑amino acid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1），构建质粒LAAD，转化构建重组菌PMLAAD；2.易错PCR；3.突变文库的建立；4.发酵；5.酶催化反应及显色；6.酶标仪检测；7.筛选突变子发酵和筛选；8.突变株发酵和筛选。通过高通量筛选系统结合易错PCR，大大节约了时间和成本，并提高了筛选效率，提高了获得正突变菌株的几率。

Description

一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法
技术领域
本发明属于酶的基因工程技术领域，具体涉及一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法。
背景技术
L-氨基酸脱氨酶，存在于真菌、放线菌、细菌中，是一类FAD依赖型黄素酶，在有氧条件下，直接氧化L-氨基酸产生对应的酮酸和氨。在日用化学品、医药合成、食品加工等领域广泛使用。用L-氨基酸脱氨酶催化合成相应的酮酸，能够使氧化过程在相对温和的条件下高效地合成，避免高温、高压、强酸催化过程，同时还能在不使用或少使用诱导剂的情况下，实现高效的表达。整个过程高效，产品质量稳定。更为重要的是，酶法所生产的酮酸产品，不含有毒有害的强酸、重金属等成分，产生生物安全性好，可用于化妆品、医药等高附加值的领域。但目前L-氨基酸脱氨酶的酶比活较低，而且热稳定性比较差，酶使用大且使用周期短，影响其工业化运用。
发明内容
本发明解决的技术问题是提供一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法。通过高通量筛选系统结合易错PCR，大大节约了时间和成本，并提高了筛选效率，提高了获得正突变菌株的几率。
对来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶（L-aminoaciddeaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1）进行易错PCR突变，建立突变库。并采用24孔进行发酵、反应和显色，采用96孔板进行酶标仪检测筛选。
本发明采用的技术方案如下：
一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法，包括如下步骤：
1.重组菌构建
全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶（L-aminoacid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1），NdeⅠ和HindⅢ连入pET24a，构建质粒LAAD，转化至E.Coli BL21(DE3)，构建重组菌PMLAAD。
2.易错PCR
提取重组菌PMLAAD的质粒LAAD，以LAAD质粒为模板，增加PCR体系dTTP和dCTP浓度，并加入一定浓度的Mg2+和Mn2+。回收PCR产物。
易错PCR体系：
易错PCR条件：
3.突变文库的建立
PCR产物L-氨基酸脱氨酶基因片段经PCR清洁试剂盒清洁后，再经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切。用胶回收试剂盒回收酶切片段。回收片段连接于pET24a载体。将连接产物转化E.coli BL21(DE3)，涂布卡那霉素抗性（50mg/L）的平板，37℃培养16h。
4. 24深孔板发酵
以24深孔板为发酵容器，每孔装TB培养基2ml，盖带气孔的胶垫，覆盖滤膜，再盖上铁盖，121℃灭菌25min。
在超净台内，用无菌的10微升移液枪头挑取步骤3中平板上的单菌落投入装TB培养基的24孔板孔内，一个板接种2个对照菌株，22株突变菌株。37℃、220rpm培养至OD600为2-6，取200微升至对应的无菌24孔板，加200微升50%甘油，加盖后-80℃冰箱保存。再取100微升的菌液移种至对应的装有TB培养基的24孔板，37℃、220rpm培养至OD600为2-6，加IPTG至终浓度为0.1-0.6mmol/L，降温至23-28℃继续培养16h。整个孔板配平后采用带孔板吊篮的离心机离心4000rpm，30min，倒出上清液，沉淀菌体连同孔板置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。
5. 24深孔板酶催化反应及显色
取出孔板室温解冻，加1ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加1ml的底物氨基酸溶液（15-30g/L）,35℃,250rpm，反应1h，离心，采用移液排枪取1ml上清至对应位置的空24孔板孔内，加0.5ml的氯化铁溶液（0.1-2g/L），震荡反应5min。酶催化反应产生的α-酮酸和铁离子产生颜色反应，颜色深浅与α-酮酸的浓度成正比。
6.96孔板酶标仪检测
移液排枪取显色反应液至96孔检测板，进酶标仪210nm下扫描检测吸光值。
7.筛选突变子进行100ml的摇瓶发酵和筛选
根据酶标仪数据，挑选吸光值大的对应保存的甘油菌种活化至Kan抗性LB固体平板，37℃，培养16h。挑取菌体接种至装20ml的TB培养基的100ml摇瓶中，37℃,220rpm培养至OD600为2-6，加IPTG至终浓度为0.1-0.6mmol/L，降温至23-28℃继续培养16h。发酵液转移至50ml离心管，离心4000rpm，30min，菌体连管置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。冷冻菌取出室温解冻，加5ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加5ml的底物氨基酸溶液（15-30g/L）,35℃,250rpm，反应1h，离心，采用移液排枪取1ml上清至对应位置的空24孔板孔内，加0.5ml的氯化铁溶液（0.1-2g/L），震荡反应5min。酶催化反应产生的α-酮酸和铁离子产生颜色反应，颜色深浅与α-酮酸的浓度成正比。
8.突变株500ml摇瓶发酵和筛选
根据酶标仪数据，挑选吸光值大的对应菌落的LB固体平板。挑取菌体接种至装200ml的TB培养基的1000ml摇瓶中，37℃,220rpm培养至OD600为2-6，加IPTG至终浓度为0.1-0.6mmol/L，降温至23-28℃继续培养16h。发酵液转移至400ml离心杯，离心4000rpm，30min，菌体挖出装塑料袋置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。称取冷冻菌2g，加8ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加10ml的底物氨基酸溶液（15-30g/L）,35℃,250rpm，反应1h，筛选。
上述用到的培养基：
(1)LB：
(2)TB(g/L)：
具体实施方式
实施例1：
一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法，包括如下步骤：
1.重组菌构建
全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶（L-aminoacid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1），NdeⅠ和HindⅢ连入pET24a，构建质粒LAAD，转化至E.Coli BL21(DE3)，构建重组菌PMLAAD。
2.易错PCR
提取重组菌PMLAAD的质粒LAAD，以LAAD质粒为模板，增加PCR体系dTTP和dCTP浓度，并加入一定浓度的Mg2+和Mn2+。回收PCR产物。
易错PCR体系：
易错PCR条件：
3. 突变文库的建立
PCR产物L-氨基酸脱氨酶基因片段经PCR清洁试剂盒清洁后，再经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切。用胶回收试剂盒回收酶切片段。回收片段连接于pET24a载体。将连接产物转化E.coli BL21(DE3)，涂布卡那霉素抗性（50mg/L）的平板，37℃培养16h。
4. 24深孔板发酵
以24深孔板为发酵容器，每孔装TB培养基2ml，盖带气孔的胶垫，覆盖滤膜，再盖上铁盖，121℃灭菌25min。
在超净台内，用无菌的10微升移液枪头挑取步骤3中平板上的单菌落投入装TB培养基的24孔板孔内，一个板接种2个对照菌株，22株突变菌株。37℃、220rpm培养至OD600为4，取200微升至对应的无菌24孔板，加200微升50%甘油，加盖后-80℃冰箱保存。再取100微升的菌液移种至对应的装有TB培养基的24孔板，37℃、220rpm培养至OD600为4，加IPTG至终浓度为0.6mmol/L，降温至28℃继续培养16h。整个孔板配平后采用带孔板吊篮的离心机离心4000rpm，30min，倒出上清液，沉淀菌体连同孔板置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。
5. 24深孔板酶催化反应及显色
取出孔板室温解冻，加1ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加1ml的底物氨基酸溶液（15g/L）,35℃,250rpm，反应1h，离心，采用移液排枪取1ml上清至对应位置的空24孔板孔内，加0.5ml的氯化铁溶液（2g/L），震荡反应5min。酶催化反应产生的α-酮酸和铁离子产生颜色反应，颜色深浅与α-酮酸的浓度成正比。
6.96孔板酶标仪检测
移液排枪取显色反应液至96孔检测板，进酶标仪210nm下扫描检测吸光值。
7. 筛选突变子进行100ml的摇瓶发酵和筛选
根据酶标仪数据，挑选吸光值大的对应保存的甘油菌种活化至Kan抗性LB固体平板，37℃，培养16h。挑取菌体接种至装20ml的TB培养基的100ml摇瓶中，37℃,220rpm培养至OD600为6，加IPTG至终浓度0.6mmol/L，降温至23℃继续培养16h。发酵液转移至50ml离心管，离心4000rpm，30min，菌体连管置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。冷冻菌取出室温解冻，加5ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加5ml的底物氨基酸溶液（15g/L）,35℃,250rpm，反应1h，离心，采用移液排枪取1ml上清至对应位置的空24孔板孔内，加0.5ml的氯化铁溶液（2g/L），震荡反应5min。酶催化反应产生的α-酮酸和铁离子产生颜色反应，颜色深浅与α-酮酸的浓度成正比。
8.突变株500ml摇瓶发酵和筛选
根据酶标仪数据，挑选吸光值大的对应菌落的LB固体平板。挑取菌体接种至装200ml的TB培养基的1000ml摇瓶中，37℃,220rpm培养至OD600为4，加IPTG至终浓度为0.6mmol/L，降温至23-28℃继续培养16h。发酵液转移至400ml离心杯，离心4000rpm，30min，菌体挖出装塑料袋置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。称取冷冻菌2g，加8ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加10ml的底物氨基酸溶液（15g/L）,35℃,250rpm，反应1h，筛选。
实施例2：
一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法，包括如下步骤：
1.重组菌构建
全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶（L-aminoacid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1），NdeⅠ和HindⅢ连入pET24a，构建质粒LAAD，转化至E.Coli BL21(DE3)，构建重组菌PMLAAD。
2.易错PCR
提取重组菌PMLAAD的质粒LAAD，以LAAD质粒为模板，增加PCR体系dTTP和dCTP浓度，并加入一定浓度的Mg2+和Mn2+。回收PCR产物。
易错PCR体系：
易错PCR条件：
3. 突变文库的建立
PCR产物L-氨基酸脱氨酶基因片段经PCR清洁试剂盒清洁后，再经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切。用胶回收试剂盒回收酶切片段。回收片段连接于pET24a载体。将连接产物转化E.coli BL21(DE3)，涂布卡那霉素抗性（50mg/L）的平板，37℃培养16h。
4. 24深孔板发酵
以24深孔板为发酵容器，每孔装TB培养基2ml，盖带气孔的胶垫，覆盖滤膜，再盖上铁盖，121℃灭菌25min。
在超净台内，用无菌的10微升移液枪头挑取步骤3中平板上的单菌落投入装TB培养基的24孔板孔内，一个板接种2个对照菌株，22株突变菌株。37℃、220rpm培养至OD600为2，取200微升至对应的无菌24孔板，加200微升50%甘油，加盖后-80℃冰箱保存。再取100微升的菌液移种至对应的装有TB培养基的24孔板，37℃、220rpm培养至OD600为2，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，降温至23-28℃继续培养16h。整个孔板配平后采用带孔板吊篮的离心机离心4000rpm，30min，倒出上清液，沉淀菌体连同孔板置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。
5. 24深孔板酶催化反应及显色
取出孔板室温解冻，加1ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加1ml的底物氨基酸溶液（30g/L）,35℃,250rpm，反应1h，离心，采用移液排枪取1ml上清至对应位置的空24孔板孔内，加0.5ml的氯化铁溶液（2g/L），震荡反应5min。酶催化反应产生的α-酮酸和铁离子产生颜色反应，颜色深浅与α-酮酸的浓度成正比。
6.96孔板酶标仪检测
移液排枪取显色反应液至96孔检测板，进酶标仪210nm下扫描检测吸光值。
7. 筛选突变子进行100ml的摇瓶发酵和筛选
根据酶标仪数据，挑选吸光值大的对应保存的甘油菌种活化至Kan抗性LB固体平板，37℃，培养16h。挑取菌体接种至装20ml的TB培养基的100ml摇瓶中，37℃,220rpm培养至OD600为6，加IPTG至终浓度为0.6mmol/L，降温至23℃继续培养16h。发酵液转移至50ml离心管，离心4000rpm，30min，菌体连管置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。冷冻菌取出室温解冻，加5ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加5ml的底物氨基酸溶液（30g/L）,35℃,250rpm，反应1h，离心，采用移液排枪取1ml上清至对应位置的空24孔板孔内，加0.5ml的氯化铁溶液（2g/L），震荡反应5min。酶催化反应产生的α-酮酸和铁离子产生颜色反应，颜色深浅与α-酮酸的浓度成正比。
8.突变株500ml摇瓶发酵和筛选
根据酶标仪数据，挑选吸光值大的对应菌落的LB固体平板。挑取菌体接种至装200ml的TB培养基的1000ml摇瓶中，37℃,220rpm培养至OD600为6，加IPTG至终浓度为0.1mmol/L，降温至23-28℃继续培养16h。发酵液转移至400ml离心杯，离心4000rpm，30min，菌体挖出装塑料袋置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上。称取冷冻菌2g，加8ml的磷酸钾缓冲液（pH6.5,100mmol/L）重悬菌体，加10ml的底物氨基酸溶液（30g/L）,35℃,250rpm，反应1h，筛选。
HPLC检测条件：
流动相A：磷酸盐缓冲液（10mmol/L的磷酸二氢钾溶液，用磷酸调节pH值至3.5）；
流动相B：甲醇；
检测柱：C18，250*4.6mm*4.5μm；
检测波长：210nm；
流速：1ml/min；
柱温：35℃；
进样量：10μL；
梯度洗脱程序：
结果：筛选4400株突变菌，获得正突变菌株20株，其中有3株相对出发菌株的单位菌体酶活分别提高了67%、86%、178%。

Claims (7)

1.一种高通量筛选L-氨基酸脱氨酶突变重组菌株的方法，其特征在于，包括如下步骤：1. 重组菌构建：全基因合成来源于奇异变形杆菌(Proteus mirabilis)L-氨基酸脱氨酶（L-amino acid deaminase，LAAD）基因（genbank登录号EU669819.1），构建质粒LAAD，转化构建重组菌PMLAAD；2. 易错PCR；3. 突变文库的建立；4. 发酵；5. 酶催化反应及显色；6.酶标仪检测；7. 筛选突变子发酵和筛选；8. 突变株发酵和筛选。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1中的表达载体采用pET24a、表达菌株采用E.Coli BL21(DE3)。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：易错PCR体系：LAAD质粒0.5 μL、Taq DNA聚合酶1 μL、引物1 μL、dATP/dGTP（10 mmol·L-1） 1 μL、dTTP/dCTP（10 mmol·L-1）5 μL、10×PCR Buffer 5 μL、MgCl2（25 mmol·L-1） 10 μL、MnCl2（10 mmol·L-1）2 μL、ddH2O24.5 μL。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：易错PCR条件：95℃预变性3min；95℃变性30s，55℃退火30s，72℃延伸1min 30s，共25个循环；72℃再延伸5min。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3突变文库的建立的方法为：
步骤2所得的PCR产物L-氨基酸脱氨酶基因片段经纯化后，再经限制性内切酶NdeⅠ和HindⅢ双酶切，回收酶切片段，回收片段连接于pET24a载体，将连接产物转化E.coli BL21(DE3)，涂布卡那霉素抗性（50mg/L）的平板，37℃培养16h。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤8 突变株发酵和筛选的具体操作步骤为：根据酶标仪数据，挑选吸光值大的对应菌落的LB固体平板；挑取菌体接种至摇瓶中，37℃,220rpm培养至OD600为2-6，加IPTG至终浓度为0.1-0.6mmol/L，降温至23-28℃继续培养16h；发酵液转移至离心杯，离心4000rpm，30min，菌体置-20℃以下的冰箱冷冻24h以上；称取冷冻菌2g，加磷酸钾缓冲液（pH6.5，100mmol/L）重悬菌体，加底物氨基酸溶液，35℃，250rpm，反应1h，筛选。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于：底物氨基酸溶液的添加量为15-30g/L。
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