CN102206659A

CN102206659A - 基于易错pcr技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法

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Publication number: CN102206659A
Application number: CN2011100891036A
Authority: CN
Inventors: 陈惠�; 姚友旭; 廖�燕; 吴琦; 李春梅; 李雨霏; 阮景军
Original assignee: Sichuan Agricultural University
Current assignee: Sichuan Agricultural University
Priority date: 2011-04-11
Filing date: 2011-04-11
Publication date: 2011-10-05
Anticipated expiration: 2031-04-11
Also published as: CN102206659B

Abstract

本发明公开了基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，包括以下步骤：A1，获得突变内切葡聚糖酶基因；A2，内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建；A3，高酶活菌株的筛选；A4，高酶活菌株突变基因的分析；实现了对来源于枯草芽孢杆菌C-36的内切葡聚糖酶基因进行体外定向进化，并在大肠杆菌中构建突变体库，筛选出一株酶活显著提高的菌株，为碱性内切葡聚糖酶的工业应用奠定了基础。

Description

基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法

技术领域

本发明提供一种基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，属于生物工程技术领域。

背景技术

资源和环境问题是人类在21世纪面临的最主要的挑战。而纤维素是地球上最丰富、最廉价的可再生资源。纤维素这一巨大可再生资源的有效利用对解决环境污染、食品短缺、能源危机具有重大现实意义，利用微生物产生的纤维素酶来分解和转化纤维素则是纤维素利用的有效途径。但目前纤维素酶的高成本和低酶活，影响了纤维素酶的工业化生产和广泛应用。因此通过基因工程和蛋白质工程技术对内切葡聚糖酶进行改造具有重要的科学和实用价值。

芽孢杆菌能产生中性或偏碱性内切葡聚糖酶，它不同于以往绝大多数的真菌产生的酸性内切葡聚糖酶，能够应用于棉纺织品水洗整理工艺及洗涤剂工业中，对其的研究是目前的热点。然而，自然界筛选出来的菌株都有酶活较低，且表达量不太稳定。

易错PCR技术是定向进化研究最早采用的一种构建基因文库的方法。首次提出易错PCR是Leung等人。易错PCR是指通过改变PCR的反应条件，如：调整反应体系中4种dNTP的浓度、增加Mg²⁺的浓度、加入Mn²⁺或使用低保真度Taq酶等，使碱基在一定程度上随机错配而引入多点突变，构建突变库，筛选出所需的突变体。易错PCR的关键是控制DNA的突变频率。如果DNA的突变频率太高，产生的绝大多数酶将失去活性；如果突变频率太低，野生型的背景太高，样品的多样性则较少。对于每一DNA序列来说，合理的碱基突变数是1-3个。理想的碱基置换率和易错PCR的最佳条件则依赖于随机突变的目标DNA片段的片段长度。在该方法中，遗传变化只发生在单一分子内部，所以属于无性进化。由于它较为费力、耗时，一般多用于较小基因片段(＜800bp)的改造。在通常情况下，经一轮的易错PCR、定向筛选，很难获得令人满意的结果，由此发展出了连续易错PCR(sequential error-prone PCR)，该方法是将一次PCR扩增得到的有益突变基因作为下一次PCR扩增的模板，连续反复进行随机诱变，使得每一次获得的少量突变累积而产生重要的有益突变。

发明内容

本发明的目的是针对目前碱性内切葡聚糖酶酶活低、难以满足工业生产需要的缺点，对来源于枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因进行定向进化，筛选出酶活显著提高的突变体，为内切葡聚糖酶工业应用奠定基础。本发明的具体实施步骤如下：

1、获得突变内切葡聚糖酶基因

(1)接种一环含有pMD19-T-Cen质粒的大肠杆菌DH5α于10mL LB(Amp)液体培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pMD19-T-Cen质粒。提取的质粒通过Bgl II，Sph I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板。

(2)调整反应参数和反应体系，通过引物

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P2：5’TAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3’

进行易错PCR。反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收。

2、内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建

(1)将回收的易错PCR突变的内切葡聚糖酶基因库经EcoR I，NotI双酶切后，连入同样经过EcoR I，NotI双酶切的含有T7lac启动子和氨苄青霉素抗性基因的表达载体pET-32a(+)中。

(2)大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备方法为：将E.coli BL21划线接种LB平板，37℃培养直至长出单菌落；挑取一个单菌落，接种至含有10mL LB培养基的50mL三角瓶中，37℃，170rpm培养过夜；将上述培养液按1％接种量接种到50mL LB液体培养基中，37℃，170rpm振荡培养1.5-2小时；将培养后的菌液置冰浴中，使培养物冷却到0℃，10min后转移到无菌的50mL离心管中，4℃，4300rpm离心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL无菌预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液重新悬浮菌体，4℃，4300rpm离心8min，去掉上清液；向管中加入2mL无菌预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重新悬浮菌体；

(3)取一支装有100μL E.coli BL21感受态细胞，置冰浴中解冻；将过夜连接产物全部加入到上述Ep管中，并用加样器轻轻混合均匀；将Ep管冰浴30min；将Ep管放入42℃恒温水浴中热击90-120秒；迅速将Ep管置冰浴中静置5min；向Ep管中加入800μL LB液体培养基置37℃摇床培养60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；取培养后的菌液200μL用玻棒涂布在LB(Amp)平板上，将平板置37℃恒温培养箱培养直至液体被吸收后，将平板倒置继续培养12-16h后直至单个菌落出现，即为含有突变内切葡聚糖酶基因Cen^ep的突变体库。

3、高酶活菌株的筛选

(1)将LB(Amp)平板上长出的菌落(构建好的突变体库，平板上每个菌落就是一个克隆子)一一对应转入LB(Amp)平板和LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，转板后将平板置37℃恒温培养箱培养，LB(Amp)平板培养8h后取出放入4℃冰箱保存，LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板继续培养36h，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有内切葡聚糖酶基因的空载体作为阳性和阴性对照。看水解圈的大小筛选出目的菌株，再对应从氨苄青霉素平板上找出目的克隆菌株。

(2)将初步筛选得到的酶活性提高的阳性克隆子接种10mL LB(Amp)液体培养基，37℃、170rpm培养过夜，再以1％的接种量接种到20mL LB(Amp)液体培养基中，37℃，170rpm振摇培养至对数生长期(OD值0.6～0.8)，补加终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养4～6h，破碎细胞测其上清液酶活。

4、高酶活菌株突变基因的分析

复筛出来的酶活提高的菌株用质粒提取试剂盒提取质粒后转入大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证导入基因的正确性，并挑取阳性菌株送Invitrogen公司测序。对测序结果进行分析，找出突变碱基位点和氨基酸位点，并对催化结构域三级结构进行预测和比较。SDS-PAGE分析表达量的变化。

本发明利用易错PCR技术和常规的突变体库构建技术，对来源于枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因进行体外定向进化，并在大肠杆菌中构建突变体库，筛选出一株酶活显著提高的菌株，为碱性内切葡聚糖酶的工业应用奠定了基础。

附图说明

图1a：pMD19-T-Cen质粒酶切电泳检测：泳道2、3依次为，Bgl II、Sph I双酶切后回收的pMD19-T载体，目的基因片段；

图1b：易错PCR扩增产物电泳检测：泳道1为易错PCR后回收的目的基因片段。

图2：易错PCR产物、pET32a(+)质粒酶切电泳检测：泳道1-2依次为易错PCR产物双酶切后回收，pET32a(+)质粒双酶切后回收；

图3：目的克隆菌株：8号为原始菌株，12号为筛选出来的突变菌株；

图4a：突变菌株质粒酶切电泳检测：泳道1、2依次为，EcoR I、NotI，双酶切，EcoR I单酶切；

图4b：突变前后核苷酸序列比对：突变位点用黑色方框标出

图4c：突变前后氨基酸序列比对：突变位点用黑色方框标出

图4d：突变酶和原始酶三级结构比对：突变酶212位天冬氨酸(ASP)突变为缬氨酸(VAL)

图4e：SDS-PAGE分析：泳道1，2，3，4依次为：转入pET32a(+)空质粒不含内切葡聚糖酶基因的BL21菌株破壁产物，原始酶，突变酶。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明做进一步阐述，但实施例不限制本发明的保护范围。

下述实施例中，所用的试验材料及其来源包括：

1、菌株和质粒；

大肠杆菌DH5α和BL21(DE3)均为本实验室保存，含Cen基因的克隆载体pMD19-T-Cen由本实验室构建，大肠杆菌表达载体pET32a(+)购自Invitrogen公司，内切葡聚糖酶大肠杆菌工程菌pET-C36(原始酶表达菌株)由本实验室构建。

2、化学试剂和酶制剂；

Bgl II、Sph I、EcoR I、Not I、氨苄青霉素、T4 DNA Ligase、Taq DNA Polymerase、dNTP购自Takara Biotechnology，DNA Maker购自天根生化科技有限公司，质粒提取试剂盒、凝胶回收试剂盒购自OMEGA。

NaCl、NaOH、HCl、K₂HPO₄·3H₂O、KH₂PO₄、MgCl₂、MnCl₂、冰乙酸、蛋白胨、酵母抽提物、葡萄糖、琼脂粉、甘油、琼脂糖、乙二胺四乙酸(EDTA)、Tris、十二烷基硫酸钠(SDS)、考马斯亮蓝R250、丙烯酰胺、甲叉双丙烯酰胺、过硫酸铵、N，N，N’N’-四甲基乙二胺(TEMED)等。

3、引物合成；

本发明涉及的引物由Invitrogen公司合成。

下述实施例中常规的基因操作方法参照《分子克隆实验指南》(第三版)。

实施例1：突变内切葡聚糖酶基因的获得；

(一)实验方法

1、突变模板的准备

接种一环含有pMD19-T-Cen质粒的大肠杆菌DH5α于10mL LB(Amp)液体培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pMD19-T-Cen质粒。提取的质粒通过BglII，Sph I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板。

2、易错PCR方法

易错PCR体系中Mg²⁺浓度为7mmol/L，Mn²⁺浓度为0.1mmol/L；dCTP，dTTP和dATP，dGTP的比例为5∶1。加样完毕后混匀，然后进入PCR循环。

3、易错PCR突变，以pMD19-T-Cen质粒作为模板，以

P1：5’TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3’和

P2：5’-FAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3’

作为引物进行易错PCR，得到长度为1.4Kb左右的内切葡聚糖酶基因扩增产物。PCR反应参数为：94℃预变性4min，94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min。反应结束后，扩增产物进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收，取1μL回收产物进行1％琼脂糖电泳检测其含量。

(二)实验结果

1、培养含pMD19-T-Cen质粒的大肠杆菌DH5α并提取质粒，通过Bgl II，Sph I双酶切对其进行了检测，证明该质粒含有内切葡聚糖酶基因，可以作为内切葡聚糖酶定向进化的模板(图1a)。

2、PCR循环完成后，进行琼脂糖凝胶电泳，使用凝胶纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收，1％琼脂糖凝胶电泳鉴定回收产物，得到大小约为1.4Kb的片段，此片段即为经易错PCR突变后得到的内切葡聚糖酶基因(图1b)。

实施例2：内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建

(一)实验方法

1、突变内切葡聚糖酶基因pET-32a(+)表达载体的构建

1)质粒载体pET-32a(+)的准备

pET-32a(+)带有T7lac启动子和氨苄青霉素抗性基因，培养含有pET-32a(+)质粒的大肠杆菌DH5α于10mL LB(Amp)液体培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明书提取pET-32a(+)质粒。

2)易错PCR产物、pET-32a(+)质粒的双酶切处理

分别取上述易错PCR产物(内切葡聚糖酶基因)、pET-32a(+)质粒进行EcoR I、Not I双酶切，酶切方法如下：

37℃酶切过夜。使用胶回收试剂盒回收纯化，内切葡聚糖酶突变基因回收1.4Kb左右片段，pET-32a(+)质粒回收5.9Kb左右片段后，分别取1μL回收产物进行1％琼脂糖电泳检测其含量。

3)大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备

参照《分子克隆实验指南》(第三版)，采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。具体方法如下：

(1)挑取一环E.coli BL21菌株在LB平板上划线37℃培养后，直至长出单菌落；挑取一个单菌落，接种至含有10mL LB培养基的50mL三角瓶中，37℃，170rpm培养过夜。

(2)将上述培养液按1％接种量接种到50mL LB液体培养基中，37℃，170rpm振荡培养1.5～2小时(OD值约0.35～0.5)。

(3)将培养后的菌液置冰浴中，使培养物冷却到0℃，10min后转移到无菌的50mL离心管中，4℃4300rpm离心5min，倒掉上清液；

(4)向管中加入30mL无菌预冷的0.1mol/L CaCl₂-MgCl₂溶液重新悬浮菌体，4℃，4300rpm离心8min，去掉上清液。

(5)向管中加入2mL无菌预冷的0.1mol/LCaCl₂溶液重新悬浮菌体，得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

(6)刚做的感受态细胞可直接用于转化试验，也可将剩余的感受态细胞加入终浓度为15％的甘油分装于1.5mL Ep管(100μL/管)置-70℃保存。

4)易错PCR产物、pET-32a(+)质粒的连接与转化

取酶切回收后的易错PCR产物、酶切回收后的pET-32a(+)质粒，按下列反应方法进行连接：

16℃连接过夜。

2、内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建

(1)取一支装有100μL E.coli BL21(DE3)感受态细胞的Ep管，置冰浴中解冻；

(2)将上述过夜连接产物全部加入到上述Ep管中，并用加样器轻轻混合均匀；将Ep管冰浴30min；

(3)将Ep管放入42℃恒温水浴中热击90-120秒；迅速将Ep管置冰浴中静置5min；

(4)向Ep管中加入800μL LB液体培养基置37℃摇床培养60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；

(5)取培养后的菌液200μL用玻棒涂布在LB(Amp)平板上，将平板置37℃恒温培养箱培养直至液体被吸收后，将平板倒置继续培养12-16h后直至单个菌落出现，即为含有突变内切葡聚糖酶基因Cen^ep的突变体库。

(二)实验结果

1、采用1％琼脂糖电泳鉴定双酶切后回收的突变内切葡聚糖酶基因片段和表达载体质粒，得到1.4Kb的目的基因片段和5.9Kb的载体片段(图2)。

2、将回收的易错PCR产物、pET-32a(+)质粒用T4DNA Ligase进行连接，转化大肠杆BL21(DE3)，得到突变体库。

实施例3高酶活菌株的筛选

(一)实验方法

1、将LB(Amp)平板上长出的菌落(构建好的突变体库，平板上每个菌落就是一个克隆子)一一对应转入LB(Amp)平板和LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，转板后将平板置37℃恒温培养箱培养，LB(Amp)平板培养8h后取出放入4℃冰箱保存，LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板继续培养至36h，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有内切葡聚糖酶基因的空载体作为阳性和阴性对照。根据水解圈的大小筛选出目的菌株，再对应从LB(Amp)平板上找出目的克隆菌株。

2、将初步筛选得到的酶活性提高的阳性克隆子接种10mL LB(Amp)液体培养基，37℃、170rpm培养过夜，再以1％的接种量接种到20mL LB(Amp)液体培养基中，37℃，170rpm振摇培养至对数生长期(OD值0.6～0.8)，补加终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养4～6h，培养后的菌液4000rpm离心10min，用1/15mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液1mL悬浮，用超声波细胞破碎仪裂解细胞，裂解液8000rpm离心10min，取上清液作为粗酶液测定酶活提高倍数。

内切葡聚糖酶酶活性单位定义为：取25mL菌液，以1mL 1％的羧甲基纤维素钠(用1/15mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液配制)为底物，加入0.1mL粗酶液，50℃水浴反应30min后，加入2.5mL DNS显色液，沸水浴煮10min，取出后在流水下迅速冷却后定容至5.0mL摇匀，此条件下，1mL酶液每分钟产生1μg还原糖的酶量作为1个酶活单位。

(二)实验结果

1、经过构建突变体库，筛选2000个克隆，初筛出一株酶活显著提高的突变子，此即为目的克隆菌株。(图3)

2、初筛出来一株酶活提高的克隆子经复筛后，接种于10ml LB(Amp)摇过夜作为种子液，再接入50ml LB(Amp)培养基经IPTG诱导后，测定酶活提高倍数为5.2倍。测定数据经统计学分析表明，CV差异不显著(P＞0.05)。结果见表2。

表2误差分析表

实施例4高酶活菌株突变基因的分析

(一)实验方法

1、复筛出来的酶活提高的菌株用质粒提取试剂盒提取质粒后转入大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证导入基因的正确性，

挑取阳性菌株送Invitrogen公司测序。测序结果经blast比对分析后找出突变碱基位点，突变DNA序列使用Primer Premier 5软件翻译出氨基酸序列，并对比出氨基酸序列，找出突变位点。突变氨基酸序列通过在线网站(http://expasy.org/tools/)对突变酶的等电点等理化性质进行预测。

2、同时突变序列提交丹麦技术大学生物序列分析中心CPHmodels服务器在线网站(http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/)对突变内切葡聚糖酶成熟蛋白的催化结构域(CD)三级结构进行预测，并用Swiss-PdbViewer软件分析突变酶催化结构域三级结构的变化。

3、SDS-PAGE分析表达量的差异。将初步筛选得到的酶活性提高的阳性克隆子、导入pET-32a(+)质粒的BL21菌株、和亲本菌株，接种10mL LB(Amp)液体培养基，37℃、170rpm培养过夜，再以1％的接种量接种到20mL LB(Amp)液体培养基中，37℃，170rpm振摇培养至对数生长期(OD值0.6-0.8)，补加终浓度为1mmol/L的IPTG诱导培养4～6h，培养后的菌液4000rpm离心10min，用1/15mol/L pH6.8磷酸盐缓冲液1mL悬浮，用超声波细胞破碎仪裂解细胞，裂解液8000rpm离心10min，取100μL上清液加入等量2x SDS-PAGE上样缓冲液，分析表达产物。

(二)实验结果

1、酶切验证及测序结果

(1)高酶活菌株质粒转入大肠杆菌DH5α，提取质粒后经EcoR I、Not I双酶切，酶切后出现两条带，分别是1.4K和5.9K，证明基因插入到载体中了。酶切验证导入基因的真确性。(图4a)

(2)测序结果显示突变酶基因发生5个碱基突变，分别是A635T，A684G，A831G，A919T，A1251T(图4b)。其中三个为无义突变，未导致氨基酸序列发生变化，其中A635T和A919T的两个突变导致氨基酸序列发生突变，分别是D212V，T307S(图4c)，并通过在线网站http://expasy.org/tools/对突变酶的性质进行了预测，预测等电点由未突变前的6.85变为7.28，分子大小由52240.08Da减小为52210.09Da。

2、突变酶三级结构预测及与原始酶的比较分析，

(1)用丹麦技术大学生物序列分析中心CPHmodels服务器在线网站http://www.cbs.dtu.dk/services/CPHmodels/对突变内切葡聚糖酶成熟蛋白的催化结构域(CD)三级结构进行预测，并用Swiss-PdbViewer软件分析突变位点氨基酸突变后催化结构域三级结构的变化(图4d)

(2)氨基酸突变对酶三级结构和酶活性的影响

来自枯草芽孢杆菌的内切葡聚糖酶基因氨基酸序列生物信息分析表明，该酶结构与大多纤维素酶相似，该酶蛋白的活性部位由一个长82aa的底物结合结构域(CBD)和一个长253aa的催化结构域(CD)组成，中间有55aa连接肽(Linker)的连接区。对比发现，氨基酸的突变位点分别位于成熟蛋白的催化结构域(CD)212位和连接区。对催化结构域三级结构的分析表明，在212位形成的氢键减少，增加了催化结构域的柔性，因此而增加了催化效率，提高了酶活。T307S(苏氨酸-丝氨酸)突变发生在连接区，此突变氨基酸侧链并未发生太大变化，减少一个甲基，此变化有可能增加连接区蛋白的柔性，使酶的结合结构域和催化结构域更容易靠近，使酶的催化效率提高。

3、SDS-PAGE分析表明突变酶表达量有显著提高，表现为条带增粗(图4e)。这可从密码子优化来阐明，枯草芽孢杆菌编码甘氨酸时GGA为偏爱密码子，而大肠杆菌中GGA则为稀有密码子，所以两个无义突变(277GGA-GGG、417GGA-GGT)使大肠杆菌中表达枯草芽孢杆菌内切葡聚糖酶基因稀有密码子突变，利于此基因在大肠杆菌中的表达，最终导致表达量的变化，表现为酶活的提高。

应当理解的是，对本领域普通技术人员来说，可以根据上述说明加以改进或变换，而所有这些改进和变换都应属于本发明所附权利要求的保护范围。

Claims

1.基于易错PCR技术提高内切葡聚糖酶的活性的方法，其特征在于，包含以下步骤：

A1，获得突变内切葡聚糖酶基因；突变模板的准备：接种一环含有pMD19-T-Cen(构建载体酶切位点为Bgl II，Sph I)质粒的大肠杆菌DH5α于10mL LB(Amp)液体培养基中37℃培养过夜，使用质粒提取试剂盒按说明提取pMD19-T-Cen质粒；提取的质粒通过Bgl II，Sph I双酶切对其进行检测，检测正确后作为易错PCR的模板；通过引物P1：5’-TAATCCAACCCGGAATTCGCAGAGACAAAAACGCCAGTAGC-3’P2：5’-TAGGAAAGGAAAAAAGCGGCCGCCTAATTTGGTTCTGTTCCCCAAA-3’进行易错PCR；反应结束后进行琼脂糖凝胶电泳，使用纯化试剂盒对易错PCR产物进行纯化回收；

A2，内切葡聚糖酶大肠杆菌突变体库的构建；将步骤A1回收的所述易错PCR产物经EcoR I、NotI双酶切后，连接入经过同样EcoR I、NotI双酶切的含有T7lac启动子和氨苄青霉素抗性基因的表达载体pET-32a(+)中；使用化学热击转化的方法，将含有突变的内切葡聚糖酶基因库的表达载体质粒转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞，涂布至LB(Amp)平板，即得构建好的突变体库；

A3，高酶活菌株的筛选；将LB(Amp)平板上长出的菌落一一对应转入的LB(Amp)平板和LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板上，转板后将平板置37℃恒温培养箱培养，LB(Amp)平板培养8h后取出放入4℃冰箱保存，LB(Amp、IPTG、CMC-Na)平板继续培养36h，然后采用刚果红染色法观察水解圈的大小，同时每个平板分别以原始菌和不含有内切葡聚糖酶基因的空载体作为阳性和阴性对照；根据水解圈的大小筛选出目的菌株，再对应从LB(Amp)平板上找出目的克隆菌株；初筛出来的阳性克隆子，通过扩大诱导培养，破壁后测定酶活。

A4，高酶活菌株突变基因的分析：复筛出来的酶活提高的菌株用质粒提取试剂盒提取质粒后转入大肠杆菌DH5α，用质粒提取试剂盒提取质粒，酶切验证导入基因的正确性，并挑取阳性菌株送Invitrogen公司测序；对测序结果进行分析，找出突变碱基位点和氨基酸位点，并对催化结构域三级结构进行预测和比较；SDS-PAGE分析表达量的变化。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A1中的PCR反应参数为：94℃预变性4min，94℃变性1min，51℃退火1min，72℃延伸2min，30个循环后，72℃延伸10min。

3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中的酶切方法如下：

37℃酶切过夜。

4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞的制备方法为：将E.coli BL21划线接种LB平板，37℃培养直至长出单菌落；挑取一个单菌落，接种至含有10mL LB培养基的50mL三角瓶中，37℃，170rpm培养过夜；将上述培养液按1％接种量接种到50mL LB液体培养基中，37℃，170rpm振荡培养1.5-2小时；将培养后的菌液置冰浴中，使培养物冷却到0℃，10min后转移到无菌的50mL离心管中，4℃，4300rpm离心5min，倒掉上清液；向管中加入30mL无菌预冷的0.1mol/L CaCl2-MgCl2溶液重新悬浮菌体，4℃，4300rpm离心8min，去掉上清液；向管中加入2mL无菌预冷的0.1mol/LCaCl2溶液重新悬浮菌体，得到大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞。

5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤A2中所述化学热击转化的方法为：取一支装有100μL E.coli BL21感受态细胞的Ep管，置冰浴中解冻；将所述过夜连接产物全部加入到上述Ep管中，并用加样器轻轻混合均匀；将Ep管冰浴30min；将Ep管放入42℃恒温水浴中热击90-120秒；迅速将Ep管置冰浴中静置5min；向Ep管中加入800μL LB液体培养基置37℃摇床培养60min，使细菌复苏并表达质粒编码的抗生素抗性标记基因；取培养后的菌液200μL用玻棒涂布在LB(Amp)平板上，将平板置37℃恒温培养箱培养直至液体被吸收后，将平板倒置继续培养12-16h后直至单个菌落出现，即为含有突变内切葡聚糖酶基因Cen^ep的突变体库。