CN110923182A - 一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用 - Google Patents

一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于酒糟降解技术领域，具体为一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用。该菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019856。该菌株用于酒糟纤维素的降解。该工程菌的重组内切葡聚糖酶对底物耐酸性强，转化效率高，可提高底物利用率，节约工艺成本。该方法构建的工程菌，缩短了菌株生长周期，可使内切葡聚糖酶的表达量及酶活性大大提高，其较强的耐酸性质，适用于酒糟这种酸性环境，有利于酒糟的腐熟，达到资源的可持续发展，解决酒糟对环境的污染问题。

Description

一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用
技术领域
本发明属于酒糟降解技术领域，具体为一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用。
背景技术
酒糟以其独特的固态发酵方式和固态白酒蒸馏生产而出现，而我国酒糟年产量达数千万吨。酒糟中含有粗蛋白质、粗淀粉、粗脂肪、粗纤维(包括木质素、纤维素和半纤维素)、灰分和无氮提取物，除此之外，酒糟中还含有多种酶、有机酸和大量菌体自溶产生的嘌呤、嘧啶和类脂化合物。研究表明，利用酒糟生产生物有机肥，以其独特的优势，可以为农业废弃物和农作物生产搭建一座桥梁，开辟以“酒糟－生物有机肥－农作物”为循环模式的可持续发展道路。然而，传统腐熟剂中的菌株存在生长周期长，酶活性低等问题，影响酒糟腐熟。由于酒糟酸度高，酒糟粗纤维难以降解，造成酒糟腐熟周期长、腐熟不彻底等问题，导致酒糟利用率低。这不仅是对资源的极大浪费，更会严重污染环境，无法实现对资源的可持续无污染利用。
国内外学者围绕这一重大课题开展了大量的研究发现，利用微生物产生的纤维素酶可将酒糟降解为可利用的资源，提高酒糟的利用率，实现资源的可持续和无污染利用，也使酒糟具有一定的商业推广价值。纤维素酶是天然降解纤维素的一系列糖苷水解酶的总称，是降解过程中起协同作用的多组分酶。
酒糟属于特殊的酸性环境，耐酸性差也是当前工程菌在酒糟降解和应用方面的瓶颈，因此有必要构建一株热稳定性高且耐酸性好的工程菌应用于酒糟降解腐熟方面，解决酒糟腐熟周期长、腐熟不彻底等问题，提高酒糟利用率。
发明内容
本发明的目的是针对上述技术问题，提出一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌。该菌株是利用酒糟这种特殊环境中的内源微生物构建的工程菌，在保留该菌特性的同时，达到提高内切葡聚糖酶酶活及表达量的目的。该菌通过单因素实验和响应面优化后，再次提高工程菌的酶活及表达量。经过Ni－NTA琼脂糖树脂纯化后得到重组内切葡聚糖酶纯酶，该酶在其最适温度45℃的条件下，可保持最高酶活的83％以上；在其最适pH4.5条件下，可保持最高酶活的89％以上。本发明的基因工程菌对底物的转化效率高，适用于酒糟这种酸性环境的底物，有利于酒糟的腐熟，达到资源的可持续发展，解决酒糟对环境的污染问题。
为了实现上述目的，本发明的具体技术方案为：
一株基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，该菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019856，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，邮编：430072，命名为Escherichia col iBL21－P7。
该菌株用于酒糟纤维素的降解，纤维素的降解率为34.22％。
以上所述基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌的应用，其包括以下步骤：
1)称取一定量白酒生产企业的废弃物酒糟，并向酒糟中添加花生壳，搅拌均匀；酒糟与花生壳的质量比为0.5－1.5：2－4。
作为优选，酒糟与花生壳的质量比为1：3。
2)制备大肠杆菌BL21－P7上清液，并将该上清液与步骤1)中的酒糟与花生壳混合物搅拌均匀。
作为优选，大肠杆菌BL21－P7上清液的添加量为花生壳与酒糟总质量的4％。
3)向步骤2)的混合物中喷洒水、尿素和酒糟灰后进行发酵即实现对酒糟中纤维的降解。发酵时间视季节定，夏季发酵时间为10－15天，冬季发酵时间为25－30d；其余季节15－25d。
作为优选，尿素的添加量为花生壳与酒糟总质量的0.3％；酒糟灰的添加量为使混合物的pH值为5.0－8.0，水的添加量为使混合物的含水量为45wt％。
大肠杆菌BL21－P7上清液的制备步骤为：按2％接种量将大肠杆菌BL21－P7种子液接种至500mlLB液体培养基(含氨苄终浓度100μg/mL)，37℃，180r/min培养至OD600约0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)后在30℃，140r/min条件下过夜诱导12h。在8000rpm/min，10℃条件下离心2min收菌，菌体重悬于6ml PBS缓冲液中，在300W的功率下超声波破碎20min后(冰浴环境)，8000rpm/min，10℃离心30min，吸取上清液。
一株基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，其命名为Escherichia coliBL21－P7，该菌株的16S rDNA序列如下：
Figure BDA0002305953250000031
Figure BDA0002305953250000041
上述16S rDNA序列全长1500个核苷酸。
以上所述基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌的实现方法，包括以下步骤：将酒糟中筛选出的内源野生枯草芽孢杆菌P7中编码内切葡聚糖酶的基因克隆出来，通过载体pET－32a(+)构建重组质粒pET－32a－P7，导入大肠杆菌BL21感受态细胞中构建工程菌BL21－P7。
一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：
通过将酒糟中筛选出的内源野生枯草芽孢杆菌P7中编码内切葡聚糖酶的基因克隆出来，通过载体pET－32a(+)构建重组质粒pET－32a－P7，导入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中构建工程菌BL21－P7。
利用酒糟这种特殊环境中的内源微生物构建工程菌，在保留该菌特性的同时，达到提高内切葡聚糖酶酶活及表达量的目的。该菌通过单因素实验和响应面优化后，再次提高工程菌的酶活及表达量。经过Ni－NTA琼脂糖树脂纯化后得到重组内切葡聚糖酶纯酶，该酶在其最适温度45℃的条件下，可保持最高酶活的83％以上；在其最适pH4.5条件下，可保持最高酶活的89％以上。
以上所述工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：
重组质粒的构建
1、设计引物。
采用Primer Premier 5引物设计软件，根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)上已登录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，HM036060.1))的内切葡聚糖酶基因序列设计上游引物
(5’－GCGAATTCATGAAACGGTCAATTTCTATTTT－3’)和下游引物
(5’－GCAAGCTTCTAATTGGGTTCTGTTCCCCAAA－3’)；其中，上游引物添加酶切位点EcoRⅠ，下游引物添加酶切位点HindⅢ。
2、提取野生枯草芽孢杆菌P7基因组(所用试剂均来自细菌基因组DNA快速提取试剂盒)
1)取1mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
2)加入200μl缓冲液RB重悬，10000rpm，离心30s，弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μl缓冲液RB中。
3)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立即涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。
4)平衡液预处理：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。
5)冷却后加入100μl异丙醇，立即涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
6)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。
7)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。
8)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
9)重复步骤8)。
10)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
11)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl双蒸水(DD水)，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置3－5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
3、PCR扩增内切葡聚糖酶基因(所用试剂均来自PCR产物纯化回收试剂盒)
用高保真FastPfu DNA聚合酶(购自近岸蛋白质科技有限公司)扩增，采用标准反应体系：FastPfu DNA聚合酶25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，所提取的P7基因组DNA 1μl，DD水22μl。
扩增程序为：30个循环，每个循环包含94℃变性3.3min，55℃退火30s，72℃延伸90s。
4、电泳
1)制备1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖凝胶，加入100ml 1×TAE，微波炉加热至溶液澄清并保持加热3min，冷却到65℃加入10μl核酸染料。
2)胶板制备：将上述琼脂糖倒入安置好的有机制胶槽内，室温下静置直至凝胶凝固，小心拨出取下凝胶块。
3)点样：在琼脂糖凝胶块第一个孔中点入3μl D L2000Maker，其余孔中点入上述PCR产物5μl。
4)电泳：120V下电泳20min，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察，显示1500bp处有明显条带，证明内切葡聚糖酶基因PCR成功。将PCR产物送至擎科测序公司进行测序。
5、PCR产物酶切(所用试剂均来自PCR产物纯化回收试剂盒)
5)将PCR产物取出，每100μlPCR扩增体系加入500μl结合液BB，充分混匀。
6)将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1min，12000rpm离心30－60s，倒掉收集管中的废液。
7)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
8)重复步骤3)。
9)将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
10)取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl双蒸水(DD水)，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置2min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
采用标准目的基因酶切反应体系：10×Buffer 5μl，EcoRⅠ0.5μl，HindⅢ0.5μl，PCR纯化产物30μl，DD水14μl。
在37℃下双酶切目的基因90min，取出酶切产物，用PCR产物纯化回收试剂盒对酶切产物进行纯化。
6、质粒pET－32a(+)酶切(所用试剂均来自琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒)
采用标准质粒酶切反应体系：10×Buffer 5μl，EcoRⅠ0.5μl，HindⅢ0.5μl，质粒pET－32a(+)7μl，DD水37μl。
在37℃下双酶切质粒120min，取出酶切产物，上样电泳，割下对应条带的胶，采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒对切下的胶内的条带进行胶回收。
1)将切下的含有质粒酶切条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。
2)加3倍体积熔胶液DD。
3)56℃水浴放置10min(或直至胶完全溶解)。酶2－3min涡旋震荡一次帮助加速溶解。
4)将上一步所得溶液加入吸附柱EC中，室温放置1min，12000rpm离心30－60s，倒掉收集管中的废液。
5)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
6)重复上一步骤。
7)将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
8)取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl DD水，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置2min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
7、T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET－32a－P7
10×Buffer 1μl，双酶切并胶回收的质粒2.5μl，双酶切并纯化的目的基因6μl，T4DNA连接酶0.5μl混合，16℃下连接15h。
二、重组质粒导入大肠杆菌Trans－T1
1)取25μl冰浴上融化感受态细胞Trans－T1，加入连接产物1μl，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
2)42℃水浴热激30s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
3)向每个离心管中加入500μl无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1h，使细菌复苏。
4)取出复苏后的大肠杆菌混合物，4000rpm离心2min，吸弃200μl上清，剩余菌液混匀后，吸取100μl已转化的感受态细胞涂布到含终浓度为100μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基上，涂三个平行。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。
挑取平板上的单克隆菌落，接入8ml LB液体培养基中(氨苄抗生素终浓度为100μg/mL)，37℃，180rpm/min培养12h，利用PCR体系扩增菌液，经电泳验证，出现1500bp条带证明重组质粒连接成功。
三、提取菌液中的重组质粒pET－32a－P7(所用试剂均来自质粒小量快速提取试剂盒)
1)取2ml过夜培养的菌液，12000rpm离心30s，尽可能的倒干上清，收集菌体。
2)用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。
3)加250μl溶液P2，温和地上下翻转6－8次，使菌体充分裂解，室温放置4min。
4)加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6－8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13000rpm离心10min，小心取上清。
5)将上一步所得上清加入吸附柱AC中，12000rpm离心30－60s，倒掉收集管中的废液。
6)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
7)重复上述步骤。
8)将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
9)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl DD水，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置2min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
将提取出的重组质粒进行双酶切，上样电泳验证，出现两条大小符合的条带则证明重组质粒连接成功。
四、工程菌BL21－P7的构建
将验证后的重组质粒pET－32a－P7导入大肠杆菌BL21(DE3)
1)取25μl冰浴上融化感受态细胞BL21(DE3)，加入重组质粒1μl，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
2)42℃水浴热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
3)向每个离心管中加入500μl无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1h，使细菌复苏。
4)取出复苏后的菌液，4000rpm离心2min，吸弃200μl上清，剩余菌液混匀后，吸取100μl已导入重组质粒的感受态细胞涂布到含终浓度为100μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基上，涂三个平行。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。
五、工程菌BL21－P7的表达
挑取平板上的单克隆菌落，接入8ml LB液体培养基中(氨苄抗生素终浓度为100μg/mL)，37℃，180rpm/min培养12h，制成种子液，按2％接种量接种至50ml LB液体培养基(含氨苄终浓度100μg/mL)，37℃，180r/min培养至OD600约0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)后在30℃，140r/min条件下过夜诱导12h。在8000rpm/min，10℃条件下离心2min收菌，菌体重悬于500μlPBS缓冲液中，在300W的功率下超声波破碎20min后(冰浴环境)，8000rpm/min，10℃离心30min，取上清进行SDS－PAGE电泳检测工程菌的蛋白表达情况。
本发明的积极效果体现在：
(一)、该工程菌可用于工业化降解酒糟中纤维素，酒糟中纤维素降解率高，当采用BL21－P7破碎后的上清液用于酒糟纤维素降解时，纤维素的降解率为34.22％；当采用BL21－P7未破碎的菌液用于酒糟纤维素降解时，纤维素的降解率为32.21％。
(二)、重组内切葡聚糖酶对底物耐酸性强，转化效率高，可提高底物利用率，节约工艺成本。
(三)、该工程菌缩短了菌株生长周期，可使内切葡聚糖酶的表达量及酶活性大大提高，其较强的耐酸性质，适用于酒糟这种酸性环境，有利于酒糟的腐熟，达到资源的可持续发展，解决酒糟对环境的污染问题。
附图说明：
图1为BL21－P7工程菌内切葡聚糖酶扩增电泳图
图2为BL21－P7工程菌重组质粒双酶切电泳图
图3为BL21－P7工程菌表达蛋白质电泳图
图4为BL21－P7工程菌纯化的重组内切葡聚糖酶电泳图
具体实施方式
为了使申请的发明目的、技术方案及优点更加清楚明白，下面结合具体实施方式对本发明作进一步的详细描述，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于下述实施例。
一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌的构建方法，具体包括以下步骤：
重组质粒的构建
1、设计引物。
采用Primer Premier 5引物设计软件，根据美国国立生物技术信息中心(NCBI)上已登录的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis，HM036060.1))的内切葡聚糖酶基因序列设计上游引物
(5’－GCGAATTCATGAAACGGTCAATTTCTATTTT－3’)和下游引物
(5’－GCAAGCTTCTAATTGGGTTCTGTTCCCCAAA－3’)；其中，上游引物添加酶切位点EcoRⅠ，下游引物添加酶切位点HindⅢ。
2、提取野生枯草芽孢杆菌P7基因组(所用试剂均来自细菌基因组DNA快速提取试剂盒)
12)取1mL培养菌液，10000rpm，离心30s，尽可能的吸弃上清，收集菌体。
13)加入200μl缓冲液RB重悬，10000rpm，离心30s，弃上清。将细胞振荡或者吹打充分重悬于180μl缓冲液RB中。
14)加入20μl蛋白酶K(20mg/ml)溶液，充分混匀，再加入200μl结合液CB，立即涡旋振荡充分混匀，在70℃放置10min。
15)平衡液预处理：取一个新的硅胶膜吸附柱子装在收集管中，吸取100μl的平衡液至柱子中。13000rpm离心1min，倒掉收集管中废液，将吸附柱子重新放回收集管。
16)冷却后加入100μl异丙醇，立即涡旋振荡充分混匀，此时可能会出现絮状沉淀。
17)将上一步混合物(包括可能有的沉淀)加入一个吸附柱AC中，(吸附柱放入收集管中)13000rpm离心60s，倒掉收集管中的废液。
18)加入500μl抑制物去除液IR，12000rpm离心30s，弃废液。
19)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
20)重复步骤8)。
21)将吸附柱AC放回空收集管中，13000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
22)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl双蒸水(DD水)，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置3－5min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
3、PCR扩增内切葡聚糖酶基因(所用试剂均来自PCR产物纯化回收试剂盒)
用高保真FastPfu DNA聚合酶(购自近岸蛋白质科技有限公司)扩增，采用标准反应体系：FastPfu DNA聚合酶25μl，上游引物1μl，下游引物1μl，所提取的P7基因组DNA 1μl，DD水22μl。
扩增程序为：30个循环，每个循环包含94℃变性3.3min，55℃退火30s，72℃延伸90s。
4、电泳
11)制备1％琼脂糖凝胶：称取1g琼脂糖凝胶，加入100ml 1×TAE，微波炉加热至溶液澄清并保持加热3min，，冷却到65℃加入10μl核酸染料。
12)胶板制备：将上述琼脂糖倒入安置好的有机制胶槽内，室温下静置直至凝胶凝固，小心拨出取下凝胶块。
13)点样：在琼脂糖凝胶块第一个孔中点入3μl D L2000Maker，其余孔中点入上述PCR产物5μl。
14)电泳：120V下电泳20min，取出凝胶，在凝胶成像仪中观察，显示1500bp处有明显条带，证明内切葡聚糖酶基因PCR成功。将PCR产物送至擎科测序公司进行测序。
5、PCR产物酶切(所用试剂均来自PCR产物纯化回收试剂盒)
15)将PCR产物取出，每100μlPCR扩增体系加入500μl结合液BB，充分混匀。
16)将上一步所得溶液加入吸附柱EC中(吸附柱放入收集管中)，室温放置1min，12000rpm离心30－60s，倒掉收集管中的废液。
17)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
18)重复步骤3)。
19)将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
20)取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl双蒸水(DD水)，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置2min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
采用标准目的基因酶切反应体系：10×Buffer 5μl，EcoRⅠ0.5μl，HindⅢ0.5μl，PCR纯化产物30μl，DD水14μl。
在37℃下双酶切目的基因90min，取出酶切产物，用PCR产物纯化回收试剂盒对酶切产物进行纯化。
6、质粒pET－32a(+)酶切(所用试剂均来自琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒)
采用标准质粒酶切反应体系：10×Buffer 5μl，EcoRⅠ0.5μl，HindⅢ0.5μl，质粒pET－32a(+)7μl，DD水37μl。
在37℃下双酶切质粒120min，取出酶切产物，上样电泳，割下对应条带的胶，采用琼脂糖凝胶纯化回收试剂盒对切下的胶内的条带进行胶回收。
9)将切下的含有质粒酶切条带凝胶放入1.5ml离心管，称重。
10)加3倍体积熔胶液DD。
11)56℃水浴放置10min(或直至胶完全溶解)。酶2－3min涡旋震荡一次帮助加速溶解。
12)将上一步所得溶液加入吸附柱EC中，室温放置1min，12000rpm离心30－60s，倒掉收集管中的废液。
13)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
14)重复上一步骤。
15)将吸附柱EC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
16)取出吸附柱EC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加30μl DD水，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置2min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
7、T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET－32a－P7
10×Buffer 1μl，双酶切胶回收的质粒2.5μl，双酶切纯化的目的基因6μl，T4DNA连接酶0.5μl混合，16℃下连接15h。
二、重组质粒导入大肠杆菌Trans－T1
5)取25μl冰浴上融化感受态细胞Trans－T1，加入连接产物1μl，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
6)42℃水浴热激30s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
7)向每个离心管中加入500μl无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1h，使细菌复苏。
8)取出复苏后的大肠杆菌混合物，4000rpm离心2min，吸弃200μl上清，剩余菌液混匀后，吸取100μl已转化的感受态细胞涂布到含终浓度为100μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基上，涂三个平行。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。
挑取平板上的单克隆菌落，接入8ml LB液体培养基中(氨苄抗生素终浓度为100μg/mL)，37℃，180rpm/min培养12h，利用PCR体系扩增菌液，经电泳验证，出现1500bp条带证明重组质粒连接成功。
三、提取菌液中的重组质粒pET－32a－P7(所用试剂均来自质粒小量快速提取试剂盒)
10)取2ml过夜培养的菌液，12000rpm离心30s，尽可能的倒干上清，收集菌体。
11)用250μl溶液P1重悬菌体沉淀，涡旋震荡至彻底悬浮。
12)加250μl溶液P2，温和地上下翻转6－8次，使菌体充分裂解，室温放置4min。
13)加350μl溶液P3，立即温和的上下翻转6－8次，充分混匀时会出现白色絮状沉淀。13000rpm离心10min，小心取上清。
14)将上一步所得上清加入吸附柱AC中，12000rpm离心30－60s，倒掉收集管中的废液。
15)加入600μl漂洗液WB，12000rpm离心30s，弃掉废液。
16)重复上述步骤。
17)将吸附柱AC放回空收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，以免漂洗液中残留乙醇抑制下游反应。
18)取出吸附柱AC，放入一个干净的离心管中，在吸附膜的中间部位加50μl DD水，DD水事先在65－70℃水浴中预热，室温放置2min，12000rpm离心1min。将得到的溶液重新加入离心吸附柱中，室温放置2min，12000rpm离心1min。
将提取出的重组质粒进行双酶切，上样电泳验证，出现两条大小符合的条带则证明重组质粒连接成功。
四、工程菌BL21－P7的构建
将验证后的重组质粒pET－32a－P7导入大肠杆菌BL21(DE3)
5)取25μl冰浴上融化感受态细胞BL21(DE3)，加入重组质粒1μl，轻轻混匀，在冰浴中放置30min。
6)42℃水浴热激45s，然后快速将管转移到冰浴中2min，该过程不要摇动离心管。
7)向每个离心管中加入500μl无菌的LB液体培养基(不含抗生素)，混匀后置于37℃，200rpm培养1h，使细菌复苏。
8)取出复苏后的菌液，4000rpm离心2min，吸弃200μl上清，剩余菌液混匀后，吸取100μl已导入重组质粒的感受态细胞涂布到含终浓度为100μg/mL氨苄抗生素的LB琼脂培养基上，涂三个平行。将平板置于37℃至液体被吸收，倒置平板，37℃过夜培养。
五、工程菌BL21－P7的表达
挑取平板上的单克隆菌落，接入8ml LB液体培养基中(氨苄抗生素终浓度为100μg/mL)，37℃，180rpm/min培养12h，制成种子液，按2％接种量接种至50mlLB液体培养基(含氨苄终浓度100μg/mL)，37℃，180r/min培养至OD600约0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)后在30℃，140r/min条件下过夜诱导12h。在8000rpm/min，10℃条件下离心2min收菌，菌体重悬于500μlPBS缓冲液中，在300W的功率下超声波破碎20min后(冰浴环境)，8000rpm/min，10℃离心30min，取上清进行SDS－PAGE电泳检测工程菌的蛋白表达情况。
六、单因素实验和响应面优化
1、单因素实验
通过单因素实验探究了诱导温度、时间、速度和IPTG浓度对BL21－P7酶产生条件的影响。以SDS－PAGE结果中上清液的酶活力和蛋白面积作为评价不同参数的指标。为了选择合适的产酶条件，在其它条件不变的情况下，在1mmol/L IPTG，诱导转速140rpm/min，诱导时间14h的条件下，诱导温度为15～35℃。同样，分别研究了诱导速度(100～180rpm/min)、IPTG浓度(0.6～1.4mmol/L)以及诱导时间(4～16h)对BL21－P7酶产生条件的影响。
2、响应面优化
根据单因素实验结果和相关文献，诱导温度、转速和IPTG浓度对工程菌产酶条件影响较大。因此，根据Box－Behnken设计的中心组合设计原理，在单因素实验的基础上，选择诱导温度(X1)、诱导转速(X2)、IPTG浓度(X3)为自变量，酶活性(Y1)和蛋白面积(Y2)为响应值。得出最适诱导条件：诱导温度26℃，诱导转速120rpm/min，IPTG浓度1.4mmol/L，诱导时间14h。
七、重组内切葡聚糖酶的纯化
1、纯化
将工程菌悬液扩至500ml，超声破碎后上清液，加入已滴掉保护液的1ml Ni－NTA琼脂糖树脂，在4℃，75rpm/min条件下孵育20h后全部加入层析柱，滴掉溶液，吸取8ml浓度分别为10、20、50mmol/L的咪唑缓冲液洗脱树脂三次，收集洗脱液，将所有洗脱液分次装入浓缩管中，在4000rpm/min，4℃条件下离心1.5h至终体积为6ml，得到单一的重组内切葡聚糖酶纯酶。采用超微量分光光度计测定纯化后的蛋白质浓度。
2、重组内切葡聚糖酶的酶学性质探究
1)温度对酶活力及稳定性的影响
将0.2mL超声破碎后的上清液与提前在50℃条件下预热2min的1mL 1％CMC－Na充分混合后，分别在25、30、35、40、45、50、55、60、65℃条件下水浴30min，加入2.5ml DNS试剂，充分混匀并沸水浴10min，加蒸馏水定容至25ml，在540nm处测定吸光度并确定最适反应温度。将上清液分别放置在40、45、50℃水浴锅中，每隔半小时分别测定酶活，以初始酶活为100％，目的是为了探究重组内切葡聚糖酶的温度稳定性。
2)pH对酶活力及稳定性的影响
分别用pH3.5、4.0、4.4(自然pH)、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0醋酸－醋酸钠缓冲液配制1％CMC－Na底物，取1mL不同pH的1％CMC－Na(提前在45℃条件下预热2min)与0.2mL超声破碎后的上清液充分混合，在50℃条件下水浴30min，加入2.5ml DNS试剂，充分混匀并沸水浴10min，加蒸馏水定容至25ml，在540nm处测定吸光度并确定最适反应pH。将pH4.0、4.4、4.5、5.0醋酸－醋酸钠缓冲液配制的1％CMC－Na底物放置4℃冰箱，每隔24h测定上清液酶活，以初始酶活为100％，目的是为了探究重组内切葡聚糖酶的pH稳定性。
3)化合物对酶活力的影响
在标准酶反应体系中分别加入BaCl2，MnCl2，LiCl，MgCl2，NaCl，CoCl2，EDTA(乙二胺四乙酸)，FeCl3，ZnCl2，SDS(十二烷基硫酸钠)，使其终浓度分别为1mmol/L和5mmol/L。以不添加任何化合物作为对照，测得的酶活力为100％来计算相对酶活力，以此来探究不同化合物对酶活力的影响。该重组内切葡聚糖酶已纯化出来，此酶可应用于酸性环境应用方面的酶制剂开发。
以上方法构建得到的菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2019856。
实验部分：
鲜酒糟与干酒糟的成分对比
鲜酒糟初始pH3.52，如表1所示，鲜酒糟中主要含有水分、无氮浸出物和粗纤维等，干酒糟中主要含有无氮浸出物、粗纤维、粗蛋白、粗淀粉等。
表1鲜酒糟与干酒糟的成分对比
Figure BDA0002305953250000201
2、优化后的工程菌与野生菌的酶活对比
工程菌优化前后，温度和转速有所降低，减少了能源消耗，诱导剂IPTG浓度和诱导时间有所增加，如表2所示：
表2优化前后工程菌诱导条件对比
Figure BDA0002305953250000202
表3优化前后工程菌酶活及蛋白面积对比
Figure BDA0002305953250000203
Figure BDA0002305953250000211
由表3可以看出，将构建并优化的工程菌与野生枯草芽孢杆菌P7、商业菌株芽孢杆菌(Bacillus sp.10829)和商业菌株里氏木霉(Trichoderm a reesei 40358)相比，工程菌比野生菌的酶活提高了6.77倍，比芽孢杆菌提高了24倍，比里氏木霉提高了4.71倍；优化后的工程菌酶活比未优化工程菌提高了1.17倍，比野生菌的酶活提高了7.89倍，比芽孢杆菌提高了27.97倍，比里氏木霉提高了5.49倍。
3、纯化后的重组内切葡聚糖酶实验数据比较
如表3所示，构建的工程菌所产的重组内切葡聚糖酶的酶活力比野生菌提高了18.92倍，比粗酶酶活力提高了2.4倍。如表4所示，在40、45和50℃保温3h后，重组内切葡聚糖酶的剩余酶活分别为77.45％、83.51％和64.66％，表明重组内切葡聚糖酶在40～50℃范围内具有良好的稳定性，其中重组内切葡聚糖酶在45℃的稳定性最好。如表5所示，在pH 4、4.4、4.5和5条件下冷藏7d后，重组内切葡聚糖酶的残留量分别为82.74％、84.79％、89.76％和75.35％。表明重组内切葡聚糖酶在pH 4.0～5.0范围内具有良好的稳定性，其中pH4.5时稳定性最好，pH4.4和pH4.0次之，pH 5.0时稳定性最低。如表6所示，只有氯化钡才能激活重组内切葡聚糖酶的活性，并且活性随着浓度的增加而增加。SDS对内切葡聚糖酶有较强的抑制作用。高浓度氯化钠、氯化钴、EDTA、三氯化铁和氯化锌对重组内切葡聚糖酶有抑制作用，尤以三氯化钴和三氯化铁的抑制作用最为明显(P＜0.05)。其它化合物如氯化锰、氯化锂和氯化镁对酶的催化活性没有显著影响。
表4纯化前后内切葡聚糖酶酶活对比
Figure BDA0002305953250000221
表5重组内切葡聚糖酶纯酶温度稳定性对比
Figure BDA0002305953250000222
表6重组内切葡聚糖酶纯酶pH稳定性对比
Figure BDA0002305953250000223
表7重组内切葡聚糖酶纯酶对化合物耐受性对比
Figure BDA0002305953250000224
Figure BDA0002305953250000231
实施例1：
酒糟制备：将湿酒糟干燥至恒重，粉碎，过80目筛子备用。
酒糟培养基：酒糟9g，麸皮1g，豆粕4g，硫酸铵1g，磷酸二氢钾0.2g，七水硫酸镁0.015g，硫酸锌0.02g，pH5.0，100ml水。酒糟培养基的初始纤维素含量为33.11mg/ml。
试验方法：将IPTG诱导后的BL21－P7进行超声破碎，离心后吸取上清液，按3％的接种量接入50ml酒糟培养基中(三个平行)，同时，按3％接种量将培养好的BL21－P7未破碎的菌液及商业芽孢杆菌菌液分别接入50ml酒糟培养基中(三个平行)，在37℃，180rpm/min下发酵72h后，将发酵后的酒糟培养基过滤出来干燥至恒重，稀释一定梯度后进行蒽酮－硫酸硫酸蒽酮比色法测定。
硫酸蒽酮溶液：0.1g蒽酮溶解到100ml80％硫酸中。
葡萄糖标曲：称取干燥至恒重的葡萄糖0.1g定容到1000ml容量瓶中，配制成0.1mg/ml的葡萄糖标准液。取七只试管标上1－7号，在1号试管中加入2ml蒸馏水，在2－7号中分别加入0.1mg/ml葡萄糖标准液0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2ml，再分别加入蒸馏水至终体积2ml，向7支试管中快速加入6ml硫酸蒽酮溶液，沸水浴15min后取出冷却，在620nm处测定吸光度。
样品测定：吸取样品2ml，快速加入6ml硫酸蒽酮溶液后沸水浴15min，冷却后在620nm处测定吸光度。
数据分析：
纤维素转化率＝[初始培养基中纤维素含量(mg/ml)－发酵后培养基中纤维素含量(mg/ml)]/初始培养基中纤维素含量(mg/ml)×100％
实验组 纤维素降解率
空白对照(清水) 0.69％
BL21－P7破碎后的上清液 34.22％
BL21－P7未破碎的菌液 32.21％
野生菌 22.1％
商业芽孢杆菌 24.14％
实施例2：
XX白酒生产企业于2017年6月，将大肠杆菌BL21－P7用于酒糟中纤维素的降解，包括以下步骤：
1)称取一定量白酒生产企业的废弃物酒糟，并向酒糟中添加花生壳，搅拌均匀。其中酒糟与花生壳的质量比为1：3。
2)制备大肠杆菌BL21－P7上清液，按2％接种量将大肠杆菌BL21－P7种子液接种至500ml LB液体培养基(含氨苄终浓度100μg/mL)，37℃，180r/min培养至OD600约0.6～0.8，加入IPTG(终浓度为1mmol/L)后在30℃，140r/min条件下过夜诱导12h。在8000rpm/min，10℃条件下离心2min收菌，菌体重悬于6ml PBS缓冲液中，在300W的功率下超声波破碎20min后(冰浴环境)，8000rpm/min，10℃离心30min，吸取上清液，并将该上清液与步骤1)中的酒糟与花生壳混合物搅拌均匀。大肠杆菌BL21－P7上清液的添加量为花生壳与酒糟总质量的4％。
3)向步骤2)的混合物中喷洒水、尿素和酒糟灰后进行发酵15d。尿素的添加量为花生壳与酒糟总质量的0.3％；酒糟灰的添加量为使混合物的pH值为5.0，水的添加量为使混合物的含水量为45wt％。该酒糟中纤维素的降解率为33.68％。
实施例3：
2017年12月，与实施例2相同的白酒生产企业将大肠杆菌BL21－P7用于酒糟中纤维素的降解，采用与实施例2同样的原料和方法进行操作，仅改变步骤3)中的发酵时间，其发酵时间为25d。该酒糟中纤维素的降解率为30.48％。
实施例4：
采用与实施例2同样的操作进行酒糟纤维素的降解，仅改变步骤3)，酒糟灰的添加量为使混合物的pH值为8.0，其余步骤和参数完全相同。该酒糟中纤维素的降解率为32.59％。
以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
SEQUENCE LISTING
<110>四川轻化工大学
<120>一种基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌及应用
<130>2019
<160>1
<170> PatentIn version 3 .5
<210>1
<211>1500
<212>DNA
<213>大肠杆菌
<400>1
atgaaacggtcaatttctatttttattatgtgtttattgattgcggtattgacaatgggc 60
ggcttgctgacttcaccggcatctgcagcagggacaaaaacgccagtagccaagaatggt 120
cagcctagcataaaaggtacacagctcgtaaaccgcgacggcaaaacggtacaactgaaa 180
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tcaggaacattcgtaagagaaaacattcgcggctacaaagattcaacgaaagaacgccct 1020
gaaacgccagcacaagataaccccacacaggaaaaaggtatttctgtacaatacaaagca 1080
ggggatgggcgtgtgaacagcaatcaaatccgcccgcagcttcacataaaaaataacggc 1140
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ggaacgctgtcaccgggagcaagcacagggaatattcagcttcgtcttcacaatgatgac 1380
tggagcaattatgcacaaagcggcgattattcctttttccaatcaaatacgtttaaaaca 1440
acgaaaaaaatcacattatatcatcaaggaaaactgatttggggaacagaacccaattag 1500

Claims (10)

1.一株基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，其特征在于：该菌株为大肠杆菌BL21－P7，于2019年10月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2019856。
2.如权利要求1所述工程菌的应用，其特征在于：该菌株用于酒糟纤维素的降解。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于包括以下步骤：
1)称取一定量白酒生产企业的废弃物酒糟，并向酒糟中添加花生壳，搅拌均匀；
2)制备大肠杆菌BL21－P7上清液，并将该上清液与步骤1)中的酒糟与花生壳混合物搅拌均匀；
3)向步骤2)的混合物中喷洒水、尿素和酒糟灰后进行发酵即实现对酒糟中纤维的降解。
4.如权利要求3所述的应用，其特征在于：步骤1)中酒糟与花生壳的质量比为0.5－1.5：2－4；大肠杆菌BL21－P7上清液的添加量为花生壳与酒糟总质量的3％－4％。
5.如权利要求3所述的应用，其特征在于：尿素的添加量为花生壳与酒糟总质量的0.3％；酒糟灰的添加量为使混合物的pH值为5.0－8.0，水的添加量为使混合物的含水量为45wt％。
6.如权利要求3所述的应用，其特征在于：大肠杆菌BL21－P7上清液的制备步骤为：按2％接种量将大肠杆菌BL21－P7的种子液接种至500ml LB液体培养基，在37℃，180r/min的条件下培养至OD600为0.6～0.8，加入IPTG后在30℃，140r/min条件下过夜诱导12h；在8000rpm/min，10℃条件下离心2min收菌，菌体重悬于6ml PBS缓冲液中，在300W的功率下超声波破碎20min后，在8000rpm/min，10℃的条件下离心30min，吸取上清液。
7.如权利要求3所述的应用，其特征在于：发酵时间视季节定，夏季发酵时间为10－15天，冬季发酵时间为25－30d；其余季节15－25d。
8.如权利要求1所述基于酒糟的高效耐酸内切葡聚糖酶工程菌，其特征在于：命名为EscherichiacoliBL21－P7，该菌株的16SrDNA序列如下：
Figure FDA0002305953240000021
Figure FDA0002305953240000031
上述16SrDNA序列全长1500个核苷酸。
9.如权利要求8所述工程菌的实现方法，其特征在于包括以下步骤：将酒糟中筛选出的内源野生枯草芽孢杆菌P7中编码内切葡聚糖酶的基因克隆出来，通过载体pET－32a(+)构建重组质粒pET－32a－P7，导入大肠杆菌BL21感受态细胞中构建工程菌BL21－P7。
10.如权利要求5所述工程菌的实现方法，其特征在于包括以下具体步骤：
1)设计上游引物(5’－GCGAATTCATGAAACGGTCAATTTCTATTTT－3’)，下游引物(5’－GCAAGCTTCTAATTGGGTTCTGTTCCCCAAA－3’)；其中，上游引物添加酶切位点EcoRⅠ，下游引物添加酶切位点HindⅢ；提取野生枯草芽孢杆菌P7基因组；PCR扩增内切葡聚糖酶基因；PCR产物电泳检测并双酶切回收；质粒pET－32a(+)双酶切回收；T4DNA连接酶连接，构建重组质粒pET－32a－P7；
2)重组质粒导入大肠杆菌Trans－T1；
3)提取阳性克隆子中的重组质粒pET－32a－P7；
4)工程菌BL21－P7的构建：将验证后的重组质粒pET－32a－P7导入大肠杆菌BL21；
5)工程菌BL21－P7的表达；
6)重组内切葡聚糖酶的纯化，得到单一的重组内切葡聚糖酶纯酶。
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