CN104561161A - 一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶 - Google Patents

一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶 Download PDF

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Abstract

一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶，属于生物法不对称合成手性化合物技术领域。本发明筛选得到亮氨酸脱氢酶来源于柴油食烷菌(Alcanivorax？dieselolei)，经过菌株培养，基因克隆，构建工程菌，细胞制备，在加入氨基供体和辅助底物情况下，细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化得到产物手性叔亮氨酸。本发明确定了基于该酶所构建工程菌的全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化的反应体系和反应条件。本发明操作方便，设备简单，在生物催化制备手性叔亮氨酸领域具有较好的工业应用前景，对于今后生物催化专用酶源的开发和手性化合物合成方法的研究具有较为重要的意义。

Description

一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法及酶
技术领域
本发明涉及一种海洋酶催化三甲基丙酮酸立体选择性制备L-叔亮氨酸的方法。
背景技术
手性氨基酸(天然L-氨基酸和非天然D-氨基酸)是合成手性药物、手性农药和手性食品添加剂等精细化工品的关键中间体。许多新药(如蛋白酶抑制剂类、抗艾滋病药等)的制备需要使用人工合成的非天然手性氨基酸。而众多手性氨基酸的合成离不开氧化还原酶的催化，因此寻找高选择性的氧化还原酶成为手性氨基酸研究的热点。
叔亮氨酸是一种非蛋白原的手性氨基酸，广泛应用于抗艾滋病药物阿扎那韦和达卢那韦、丙肝治疗药物特拉波维和博赛波维以及生物抑制剂等的合成。目前中国使用的抗HIV药物全部为进口药，主要由默沙东与施贵宝两家公司生产，价格昂贵。美国药品及医疗保健品市场调研公司Decision Resources称，中国的丙肝药物市场价值将从2010年的1.37亿美元增至2015年的2.47亿美元。因此获得制备广泛用于抗艾滋病药、抗肿瘤药物合成的L-叔亮氨酸的自主产权显得尤为重要。海洋微生物来源的脱氢酶将比陆地微生物来源的脱氢酶在极端条件下更具优势，能在极端环境中保持较高的活性和较好的稳定性。通过对海洋微生物及其氧化还原酶系的挖掘、催化机制研究和改造，降低手性氨基酸的生产成本很有必要。
Bommarius等报道了甲酸脱氢酶与亮氨酸脱氢酶的偶联系统，利用甲酸脱氢酶为亮氨酸脱氢酶提供必要的还原型辅酶NADH。该方法受到底物浓度低、辅酶投入量大以及生产过程复杂导致成本过高等因素的制约。中国专利CN1934264也采用类似的全细胞催化剂转化酮酸为L-叔亮氨酸，其优选的最大稳定底物浓度小于0.4M，由于其产物浓度仍然较低，不利于工业化生产。叔亮氨酸的制备方法通常有两种，即化学合成法和微生物发酵法。化学合成法的收率较低；需使用剧毒的氰化物，污染环境；副反应较多；工艺路线长等缺点。而微生物发酵法具有环境友好，节能绿色等优点，缺点是发酵产物浓度低，生产周期长，工艺管理要求严格。全细胞催化[1]三甲基丙酮酸不对称还原胺化获得手性叔亮氨酸，具有反应路线简洁，易实现辅酶再生等优点。因此，筛选含有催化不对称还原胺化高活性高选择性的亮氨酸脱氢酶是实现手性叔亮氨酸有效制备的关键。来源于海洋微生物的氧化还原酶具有一些陆地酶所不具有的特性，如广泛的底物谱、耐盐性、耐有机溶剂等特性，使得其受到更多的关注。
发明内容
本发明从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的亮氨酸脱氢酶的不同以往报道的新酶。本发明还考察了底物浓度、反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该酶所构建的工程菌全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化制备L-叔亮氨酸的反应体系和反应条件。
本发明所述的工程菌全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化制备L-叔亮氨酸，是利用全细胞中亮氨酸脱氢酶的高度对映体选择性，催化三甲基丙酮酸的不对称还原胺化，获得L-叔亮氨酸，葡萄糖等辅助底物加入用于辅酶NADH的循环再生。其以葡萄糖为辅助底物的化学反应式如下：
所述海洋酶为来源于一种海洋菌柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)的亮氨酸脱氢酶，该菌株中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏中心登记入册编号为MCCC1A00858。该菌株可以通过商业购买方式得到。
所述亮氨酸脱氢酶的工程菌全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化制备L-叔亮氨酸包括以下步骤：
1)细胞液制备：以柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)总DNA为模板，用引物F-Ad-Leu和R-Ad-Leu进行PCR扩增，得到如附录1所示的亮氨酸脱氢酶基因序列，其中PCR反应体系为：22μL H2O，1μL F-Ad-Leu，1μL R-Ad-Leu，1μL总DNA，25μLPrimeSTAR Max Premix；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性10s，54℃复性10s，72℃延伸6s，循环30次，72℃延伸10min；用NdeI和HindIII分别双酶切亮氨酸脱氢酶基因及pET28a质粒，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌E.coli DH5α，然后提取质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)构建亮氨酸脱氢酶基因的E.coli工程菌。将亮氨酸脱氢酶的工程菌接入LB(含卡纳青霉素)培养基中培养。所得发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配制成细胞液。
2)全细胞催化反应：在步骤1)的细胞液中，加入三甲基丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化得到含有产物L-叔亮氨酸的反应液。
3)分离与检测：反应液离心去除沉淀，上清液加入等量的甲醇，震荡混合均匀，离心去除沉淀(蛋白质)，上清液稀释后进行测定。产物L-苯丙氨酸的浓度和对映体过量值用高效液相色谱测定。
在步骤1)中，所述的海洋酶催化不对称还原制备L-叔亮氨酸的方法，海洋酶为来源于一种海洋菌柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)的亮氨酸脱氢酶。
在步骤1)中，所述的菌种接种量为1％；所述的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/L,酵母浸膏1.0～10.0g/L,NaCl5.0～15.0g/L，调节pH7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150ug/mL；所述培养条件为37℃，150～250rpm培养1.5～3h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养4～6h。
所述离心条件为，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用PBS缓冲液(pH 6.5～8.0)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次。所述的配置细胞液浓度为0.025～100g/L。
在步骤2)中，所述的氨基供体浓度为：0.002～1mol/L的氨水、NH4Cl、NH4NO3、甲酸铵等中的一种。优选氨水和NH4Cl。所述的辅助底物为0.001～1mol/L的葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、异丙醇等中的至少一种，其中优选葡萄糖和甘油。所述缓冲液为浓度0.01～0.2mol/L pH为7～13的NH4Cl-氨水、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾等中至少一种，优选pH 8的NH4Cl-氨水。所述的反应条件是pH 7～13，反应温度20～50℃下，震荡速率100-300rpm，反应时间30～150h。
在步骤3)中所述的分离条件为反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀，离心弃掉沉淀(蛋白质)，分离出的上清液稀释后备用。所述的产物叔亮氨酸的浓度和对映体过量值(e.e.值)，采用高效液相色谱检测，色谱柱为手性柱Chirex3126柱，检测波长254nm。
产物L-叔亮氨酸用高效液相色谱检测，色谱柱为Chirex 3126，检测波长254nm(附图1、2)。其检测条件为：流动性为含有2mM的CuSO4的95/5的水/异丙醇溶液；柱温为35℃；流速为1ml/min。
本发明的有益效果如下：
本发明从海洋微生物筛选获得含有依赖NADH的亮氨酸脱氢酶的不同以往报道的新酶。本发明还考察了底物浓度、反应缓冲液、pH、温度等影响，优化了该酶工程菌全细胞催化三甲基丙酮酸不对称还原胺化制备L-叔亮氨酸的反应体系和反应条件。
所获产物手性叔亮氨酸的光学纯度达到90％以上。本发明操作方便，具有产品光学纯度高、收率高，设备简单等优点，在生物催化制备手性叔亮氨酸领域具有较好的工业应用前景。
附图说明
图1为产物L-叔亮氨酸的手性色谱分析图。
图2为L-叔亮氨酸和D-叔亮氨酸的手性色谱分析图。
具体实施方式
下面通过实施例对本发明做详细说明
实施例1
(1)海洋菌柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)的培养及细菌总DNA的提取：所述的菌种接种量为1％-10％；所述2216L培养基组成为1-15.0g/L蛋白胨,1-10.0g/L酵母粉,0.1-1g/L牛肉膏,0.1-2g/L柠檬酸钠,0.1-1g/L NH4NO3,0.1-2g/L乙酸钠，用海水配置；所述的培养条件为：起始pH 6.5-8.0，装液量体积分数为5％-15％，培养温度20-40℃，摇床转速150-250rpm，培养时间12-48h，Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提总DNA。
(2)基因克隆及工程菌的制备：以柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)总DNA为模板，用引物F-Ad-Leu和R-Ad-Leu(这两条引物的具体序列为F-Ad-ADH-1:GGAATTCCATATGGTGTTCCATGCCATCGATAACC；R-Ad-ADH-1:CCCAAGCTTTCAGTGATTGAGGATCAGCGTT)进行PCR扩增，得到如附录1SEQ ID NO 1所示的亮氨酸脱氢酶基因序列，其中PCR反应体系为：22μL H2O，1μL F-Ad-Leu，1μL R-Ad-Leu，1μL总DNA，25μL PrimeSTAR Max Premix；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性10s，54℃复性10s，72℃延伸6s，循环30次，72℃延伸10min；用NdeI和HindIII分别双酶切亮氨酸脱氢酶基因及pET28a质粒，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌E.coli DH5α，然后提取质粒转化大肠杆菌E.coli BL21(DE3)构建亮氨酸脱氢酶基因的E.coli工程菌。
(3)细胞的制备：所述的菌种接种量为1％；所述的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/L,酵母浸膏1.0～10.0g/L,NaCl5.0～15.0g/L，调节pH7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150ug/mL；所述培养条件为37℃，150～250rpm培养1.5～3h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养4～6h。培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心(4℃，8000rpm，15min)获得细胞，弃上清液，沉淀用PBS缓冲液(pH 7.5)重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次获得细胞。
(4)全细胞催化反应：反应体系为0.025mol/L三甲基丙酮酸，1mol/L NH4Cl-NH3缓冲体系，0.05mL 1mM的NADH，pH 8.0，130g/L的细胞，反应体积20mL，在37℃反应温度下，150rpm震荡反应反应时间27小时。
(5)分离与检测：反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀，离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物L-叔亮氨酸的收率为48.65％，e.e.值大于99.0％。结果见图1和图2。
实施例2
(1)步骤(1)至步骤(3)同实施例1，步骤(4)如下
(4)全细胞催化反应：反应体系为0.05mol/L三甲基丙酮酸，1mol/L NH4Cl-NH3缓冲体系，0.05mL 1mM的NADH，pH 8.0，130g/L的细胞，反应体积20mL，在37℃反应温度下，150rpm震荡反应反应时间48小时。
(3)分离与检测：反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀，离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物L-叔亮氨酸的收率为55.07％，e.e.值大于99.0％。
实施例3
(1)步骤(1)至步骤(3)同实施例1，步骤(4)如下
(4)全细胞催化反应：反应体系为0.1mol/L三甲基丙酮酸，1mol/L NH4Cl-NH3缓冲体系，0.05mL 1mM的NADH，pH 8.0，130g/L的细胞，反应体积20mL，在37℃反应温度下，150rpm震荡反应反应时间72小时。
(3)分离与检测：反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀，离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物L-叔亮氨酸的收率为52.89％，e.e.值大于99.0％。
实施例4
(1)步骤(1)至步骤(3)同实施例1，步骤(4)如下
(4)全细胞催化反应：反应体系为0.2mol/L三甲基丙酮酸，1mol/L NH4Cl-NH3缓冲体系，0.05mL 4mM的NADH，pH 8.0，130g/L的细胞，反应体积20mL，在37℃反应温度下，150rpm震荡反应反应时间96小时。
(3)分离与检测：反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀，离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物L-叔亮氨酸的收率为46.03％，e.e.值大于99.0％。
实施例5
(1)步骤(1)至步骤(3)同实施例1，步骤(4)如下
(4)全细胞催化反应：反应体系为0.3mol/L三甲基丙酮酸，1mol/L NH4Cl-NH3缓冲体系，0.05mL 4mM的NADH，pH 8.0，130g/L的细胞，反应体积20mL，在37℃反应温度下，150rpm震荡反应反应时间120小时。
(3)分离与检测：反应液离心去除沉淀，上清液加入等体积的甲醇，混合震荡均匀，离心弃掉沉淀，上清液稀释备用。用高效液相色谱检测，计算产物L-叔亮氨酸的收率为41.03％，e.e.值大于99.0％。

Claims (10)

1.一种海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于包括以下步骤：
1)基因组DNA的提取：将菌种接入2216L液体培养基中培养，抽提细菌基因组DNA；所述菌种为柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)，该菌株保藏于中国海洋微生物菌种保藏管理中心，保藏号为MCCC编号1A02288；
2)基因克隆及工程菌的制备：以基因组DNA为模板扩增目的基因，并装载到pET28a载体上，转入大肠杆菌DE3中即得到需要的工程菌；
3)细胞液制备：将工程菌接入含卡那霉素的LB液体培养基中培养，培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心获得细胞，用缓冲液重悬、洗涤，配置成细胞液；
4)全细胞催化反应：在步骤3)的细胞液中，加入三甲基丙酮酸和氨基供体作为底物，加入辅助底物用于辅酶循环再生，利用全细胞催化不对称还原胺化得到产物手性叔亮氨酸。
2.如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于在步骤1)中所述模板DNA制备方法为：所述的菌种接种量为1％-10％；所述2216L培养基组成为1-15.0g/L蛋白胨,1-10.0g/L酵母粉,0.1-1g/L牛肉膏,0.1-2g/L柠檬酸钠,0.1-1g/L NH4NO3,0.1-2g/L乙酸钠，用海水配置；所述的培养条件为：起始pH 6.5-8.0，装液量体积分数为5％-15％，培养温度20-40℃，摇床转速150-250rpm，培养时间12-48h，Ezup柱式细菌基因组DNA抽提试剂盒抽提总DNA。
3.如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于在步骤2)中所述基因克隆及工程菌的制备方法为：以柴油食烷菌(Alcanivorax dieselolei)总DNA为模板，用引物F-Ad-Leu和R-Ad-Leu进行PCR扩增，得到如附录1所示的亮氨酸脱氢酶基因序列，其中PCR反应体系为：22μLH2O，1μL F-Ad-Leu，1μL R-Ad-Leu，1μL总DNA，25μL PrimeSTAR Max Premix；PCR反应条件为：94℃预变性5min，94℃变性10s，54℃复性10s，72℃延伸6s，循环30次，72℃延伸10min；用NdeI和HindIII分别双酶切亮氨酸脱氢酶基因及pET28a质粒，用T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌E.coli DH5α，然后提取质粒转化大肠杆菌E.coli BL21DE3构建亮氨酸脱氢酶基因的E.coli工程菌。
4.如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于在步骤3)中所述将细胞液制备方法为：所述的LB培养基的组成为：胰蛋白胨5.0～15.0g/L,酵母浸膏1.0～10.0g/L,NaCl5.0～15.0g/L，调节pH7.0～7.5，接种前添加卡那霉素使其终浓度为50～150ug/mL；所述培养条件为37℃，150～250rpm培养1.5～3h后加入诱导剂IPTG，使其终浓度为5～15mg/ml，继续在25～30℃，150～250rpm下培养4～6h。
5.如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于在步骤4)中培养结束获得的发酵液，在冷冻离心机中离心，4℃，8000rpm，15min，获得细胞，弃上清液，沉淀用pH 6.5-8.0的PBS缓冲液重悬，充分洗涤后离心，重复操作3次，所述的配置细胞液浓度为0.025～100g/L。
6.如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于在步骤4)中，所述的氨基供体为：0.002～1mol/L的氨水、NH4Cl、NH4NO3和甲酸铵。
7.如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性胺的方法，其特征在于步骤4)中，所述的辅助底物为0.001～1mol/L的葡萄糖、甘油、木糖、半乳糖、异丙醇中的一种或多种。
8.如权利要求1所述的所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于步骤4)中所述缓冲液为0.01-0.2mol/L的pH为7～13的NH4Cl-氨水，Tris-盐酸、乙酸钠、碳酸钠、磷酸钾中的一种或几种。
9.如权利要求1所述的海洋酶催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的方法，其特征在于步骤4)中所述的反应条件是pH 7～13，反应温度20℃～50℃下，震荡速率100-300rpm，反应时间30～150小时。
10.一种用于催化不对称还原制备手性叔亮氨酸的海洋酶，其特征在于：编码该海洋酶的DNA序列如SEQ ID NO 1所示。
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