CN108342423A - L-草铵膦的生物合成制备方法 - Google Patents

L-草铵膦的生物合成制备方法 Download PDF

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CN108342423A CN201810051250.6A CN201810051250A CN108342423A CN 108342423 A CN108342423 A CN 108342423A CN 201810051250 A CN201810051250 A CN 201810051250A CN 108342423 A CN108342423 A CN 108342423A
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Abstract

本发明公开了一种L‑草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：步骤1：以2‑氨基‑4‑(R氧基甲基瞵酰基)‑丁酰胺为底物与溶剂构成反应体系，再向所述反应体系中加入催化剂进行生物转化反应，得到含有L‑2‑氨基‑4‑(R基甲基瞵酰基)‑丁酸的转化液；步骤2：L‑2‑氨基‑4‑(R基甲基瞵酰基)‑丁酸脱保护基，得到L‑2‑氨基‑4‑(羟基甲基瞵酰基)‑丁酸，即为L‑草铵膦。其工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产。

Description

L-草铵膦的生物合成制备方法
技术领域
本发明涉及农药的制备方法，具体地指一种L-草铵膦的生物合成制备方法。
背景技术
草铵膦，化学名称为4-[羟基(甲基)膦酰基]-DL-高丙氨酸，由赫斯特公司(现德国拜耳公司)于上个世纪80年代开发生产，属膦酸类除草剂，是谷氨酰胺合成抑制剂，非选择性触杀型除草剂，其作为除草剂获得登记使用是1984年。2004年我国才有草铵膦原药登记，2005年我国才有产品登记。
草甘膦自广泛应用以来，抗草甘膦杂草不断增加，危害逐步加重。百草枯是一种强烈的杀灭杂草除莠剂，对人畜有很强的毒性作用。2014年7月1日，我国撤销百草枯水剂登记和生产许可、停止生产；2016年7月1日停止水剂在国内销售和使用。草铵膦是世界大吨位农药品种，也是世界第二大转基因作物耐受除草剂。草铵膦毒性低，较为安全，在土壤中易于降解，对作物安全，不易飘移，除草谱广，活性高，用量少，环境压力小，杀草迅速，能快速杀死100种以上的禾本科和阔叶杂草，可用水做基剂，使用安全方便，这些是该品优于其他除草剂的特点，所以这个产品在出现了众多高效超高效的产品后，依然可以畅销。
目前国内外草铵膦的合成技术路线较多，严海昌等(《农药》，2002，41(9)，46-48)做过综述报道，但各路线普遍存在反应步骤多，生产成本高的问题。拜尔公司在专利US4521348及US6359162中提出了以合成二氯甲基膦再合成甲基亚磷酸酯，经过一系列反应合成草铵膦的方法。该路线收率高、成本低，但起始路线二氯甲基膦合成原料、产物物化性质活泼，易燃易爆。合成过程处于500～600℃，如控制不稳定，容易产生极易自然的黄磷和磷化氢，危险性很大。另外，物料具有强腐蚀性，对反应设备材质选择及其加工制造工艺要求苛刻，目前国内加工制造水平难以满足生产要求。
这些方法都是制备草铵膦的方法，草铵膦为L/D混合型，其中起主要作用的是L型；L-草铵膦可在土壤中经微生物降解，而D-型草铵膦较难降解，最终可导致土壤板结。因此，L-草铵膦比较传统草铵膦更加高效、更低成本、更加安全。
因此，研发一种能提高原料利用率、降低生产成本同时避免工业化过程中的危险性的L-草铵膦的生物合成制备方法显得十分必要。
发明内容
本发明所要解决的问题就是要克服背景技术的不足，提供一种L-草铵膦的生物合成制备方法，能提高原料利用率、降低生产成本，并且适合工业化生产。
本发明提供了式II化合物L-2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁酸的生物合成制备方法，由式IV化合物2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁酰胺在酶的作用下反应制备，
其中，R选自烷基、硅烷基、硅醚保护基、苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、C2-C10直链或支链烯烷基、C2-C10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、Ar(CH2)n-基团中的一种，Ar代表芳基、杂芳基，n取1-6，所述酶包括生物酶和辅酶。
优选地，生物酶包括酰胺消旋酶和L-酰胺水解酶，所述辅酶为磷酸吡哆醛。
进一步地，式IV化合物2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁酰胺由式I化合物2-氨基-4-(R基甲基膦酰基)-丁腈在腈水合酶的的作用下反应制备，
其中，R选I自烷基、硅烷基、硅醚保护基、IV苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、C2-C10直链或支链烯烷基、C2-C10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、Ar(CH2)n-基团中的一种，Ar代表芳基、杂芳基，n取1-6。
进一步地，式II化合物由式I化合物在酶的的作用下经一锅法反应制备，R的定义如上所述，所述酶包括生物酶和辅酶。其中，生物酶包括腈水合酶、酰胺消旋酶和L-酰胺水解酶，辅酶为磷酸吡哆醛。反应式如下：
本发明还提供了L-草铵膦的生物合成制备方法，当用上述方法制备好式II化合物后，由式II化合物脱保护基得到，
其中，R的定义如上所述。
优选地，R为乙基，控制反应体系的pH为5-8。
进一步地，腈水合酶基因包括但不限于来源于Rhodococcus rhodochrous，Pseudomonas chlororaphis，Brevibacterium，Agrohaeteriwn tumefadens，Myrothcciumverrucaria，Corynehacterium，Pseudomonas putida，Pseudomonas fluorescens，Nocardia simplex，Rhodococcus sp，Nocardia brasiliensis，Pichia pastoris，Escherichia coli；酰胺消旋酶基因包括但不限于来源于Achromobacter obae，CRYPTOCOCCUS LAURENTII，Cryptococcus sp，Pseudomonas sp，Candida humicola，Achromobacter，Alcaligenes faecalis，Flavobacterium arborescens Trichosporoncutaneum，Escherichia coli；L-酰胺水解酶基因包括但不限于来源于Brevundimonasdiminuta，Ochrobactrum anthropi，Streptomyces，Bacillus cereus，Comamonasacidovorans，Rhodococcus rhodochrous，Mycobacterium tuberculosis，Brevibacteriumsp，Delftia acidovorans，Brevibacillus borstelensis，Variovorax paradoxus，Escherichia coli。
进一步地，腈水合酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有腈水合酶活性的蛋白质，或与SEQ IDNO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有腈水合酶活性的蛋白质；所述酰胺消旋酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质，或SEQ ID NO：2经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有酰胺消旋酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺消旋酶活性的蛋白质；所述L-酰胺水解酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQ ID NO：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质。
进一步地，腈水合酶、酰胺消旋酶、L-酰胺水解酶的投量比控制为1︰0.8-2︰0.8-3，优选为1︰1︰1。
进一步地，酶转化反应体系中加入CoCl2。
更进一步地，酶转化在溶剂中进行，溶剂为缓冲溶液，缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、硼酸盐缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
腈水合酶、酰胺消旋酶、L-酰胺水解酶均可为基因工程菌全细胞、破碎酶液、冻干粉或固定化酶或固定化细胞。
本发明生物转化过程中利用HPLC-MS和HPLC进行监控，直至底物完全利用。
本发明的优点主要体现在如下几方面：
其一，本发明工艺流程简单，对设备无特殊要求，适用于工业化生产；
其二，本发明底物利用率高，纯化后L-草铵膦晶体纯度达到95％以上，光学纯度为99％以上；
其三，本发明催化剂包括腈水合酶、酰胺消旋酶、L-酰胺水解酶，三种酶共同作用，催化效果好，用量少，专一高效。
附图说明
图1为本发明实施例1制备的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的液相图。
图2为L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸标准品的液相图。
具体实施方式
以下结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，但该实施例不应该理解为对本发明的限制。
实施例1
1、腈水合酶的制备
重组腈水合酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和XhoI酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组腈水合酶的重组腈水合酶基因工程菌。
将重组腈水合酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
所得腈水合酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质。
2、酰胺消旋酶的制备
重组酰胺消旋酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组酰胺消旋酶的重组酰胺消旋酶基因工程菌。
将重组酰胺消旋酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
所得酰胺消旋酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质。
3、L-酰胺水解酶的制备
重组L-酰胺水解酶基因工程菌，具体制备方法是：选择来源于Brevundimonasdiminuta的L-酰胺水解酶的基因序列，进行人工设计，将人工设计后的序列通过全基因合成(委托金斯瑞生物科技有限公司合成)，克隆入表达载体pET28a的Nde I和Xho I酶切位点，转化宿主菌E.coli BL21(DE3)感受态细胞；挑取阳性转化子并测序鉴定后，得到重组表达载体；将重组表达载体转入E.coli BL21(DE3)菌株中，获得可以诱导表达重组L-酰胺水解酶的重组L-酰胺水解酶基因工程菌。
将重组L-酰胺水解酶基因工程菌接种到含有卡那霉素的LB培养基中，于37℃过夜培养，得到种子培养液；将种子培养液接种到含卡那霉素的TB培养基中，接种量为含卡那霉素的TB培养基体积的1％；然后置于37℃下培养2-5h，加入无菌的IPTG诱导，使IPTG终浓度达到0.1mM，置于25℃下继续培养20h。最后通过高速离心得到来源于Brevundimonasdiminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞。
采用超声破碎方法对得到的基因工程菌全细胞进行超声破碎，得到来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞的破碎酶液。
所得L-酰胺水解酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质。
实施例2
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液为溶剂重悬3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、3g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、3g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。转化时间为16h，转化率为99.1％。对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。反应式如下：
步骤2：向装有纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％(质量分数)的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦的ee值为99.7％。1H NMR(400MHz，D2O)1.267(s，3H)，1.603～1.742(m，2H)，1.989～2.080(m，2H)，3.876～3.905(m，1H)，11.013～11.106(1H)。MS(ESI)：m/z 182.05[M+H]+反应式如下：
实施例3
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在500mL摇瓶中进行，以20g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用200mL磷酸盐缓冲溶液重悬2g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞，控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min，转化至底物完全消耗完，纯化得到2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酰胺。MS(ESI)：m/z 209.11[M+H]+反应式如下：
步骤2：反应在500mL摇瓶中进行，以10g纯化后的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁酰胺为底物，用200mL磷酸盐缓冲溶液重悬1.6g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、6g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为5mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为0.5mM，控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min，转化率为88.4％。反应式如下：
步骤3：向含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.3％。反应式如下：
实施例4
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在500mL摇瓶中进行，以20g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用200mL磷酸盐缓冲溶液重悬2g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、1.6g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、6g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为5mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为0.5mM，控制转化体系的pH值为8，控制转化体系的温度为40℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为180r/min。
转化时间为18.5h，转化率为91.3％。
步骤2：向含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.5％。
反应式如实施例2。
实施例5
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL柠檬酸-柠檬酸钠缓冲溶液重悬10g/L的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶的基因工程菌全细胞、10g/L的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶的基因工程菌全细胞、20g/L的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为5，控制转化体系的温度为30℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为150r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为15.3h，转化率为98.6％。
对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向装有纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.6％。
反应式如实施例2。
实施例6
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在5L烧杯中进行，以200g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用2L磷酸盐缓冲溶液重悬20g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、30g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、16g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向烧杯中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向烧杯中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6，控制转化体系的温度为35℃；机械搅拌转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为17.8h，转化率为97.8％。
对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦ee值为99.6％。
反应式如实施例2。
实施例7
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞、6g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞、4.5g的来源于Brevundimonasdiminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为7，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为20.7h，转化率为97.2％。
对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦晶体纯度达到96.1％，光学纯度为99.5％。
反应式如实施例2。
实施例8
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，以300mL MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶基因工程菌全细胞破碎酶液、3g的来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶基因工程菌全细胞破碎酶液、3g的来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶基因工程菌全细胞破碎酶液，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为17.9h，转化率为97.3％。
对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦晶体纯度达到95.3％，光学纯度为99.5％。
反应式如实施例2。
实施例9
L-草铵膦的生物合成制备方法，包括如下步骤：
步骤1：反应在1L摇瓶中进行，以30g的2-氨基-4-(乙氧基甲基膦酰基)-丁腈为底物，用300mL MOPS缓冲溶液(以3-吗啉丙磺酸和Na2PO4为缓冲对的生理盐溶液)为溶剂，以3g的来源于Rhodococcus.rhodochrous的腈水合酶、来源于Achromobacter obae的酰胺消旋酶、来源于Brevundimonas diminuta的L-酰胺水解酶共表达的基因工程菌全细胞，向摇瓶中投入磷酸吡哆醛，磷酸吡哆醛的投入浓度为10mM，再向摇瓶中加入CoCl2，CoCl2的投入浓度为1mM，控制转化体系的pH值为6.5，控制转化体系的温度为35℃；转化反应在摇床中进行，摇床的转速控制为200r/min，得到含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液。
转化时间为18.4h，转化率为92.8％。
对含有L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的转化液进行纯化。
步骤2：向装有纯化后的L-2-氨基-4-(乙基甲基膦酰基)-丁酸的烧杯中加入60g浓度为10％-37％的盐酸，搅拌，去保护基，得到含有L-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酸(即L-草铵膦)的溶液，纯化，得到L-草铵膦晶体，所得L-草铵膦晶体纯度达到95.9％，光学纯度为99.5％。
反应式如实施例2。
本说明书中未作详细描述的内容，属于本专业技术人员公知的现有技术。
序列表
<110> 武汉茵茂特生物技术有限公司
<120> L-草铵膦的生物合成制备方法
<150> 2017100597054
<151> 2017-01-24
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 601
<212> PRT
<213> Rhodococcus rhodochrous
<400> 1
Met Asp Gly Ile His Asp Leu Gly Gly Arg Ala Gly Leu Gly Pro Val
1 5 10 15
Lys Pro Glu Ser Asp Glu Pro Val Phe His Ser Asp Trp Glu Arg Ser
20 25 30
Val Leu Thr Met Phe Pro Ala Leu Ala Ile Ala Gly Ala Phe Asn Leu
35 40 45
Asp Gln Phe Arg Gly Ala Met Glu Gln Ile Pro Pro His Asp Tyr Leu
50 55 60
Met Ser Gln Tyr Tyr Glu His Trp Met His Ala Met Ile His His Gly
65 70 75 80
Ile Glu Ala Gly Ile Phe Asp Ser Asp Glu Leu Asp Arg Arg Thr Gln
85 90 95
Tyr Tyr Met Asp His Pro Asp Asp Thr Thr Pro Val Arg Gln Asp Pro
100 105 110
Gln Leu Val Glu Ile Ile Ser Gln Leu Ile Thr His Gly Ala Asp Tyr
115 120 125
Arg Arg Pro Thr Asp Thr Glu Ala Ala Tyr Ala Val Gly Asp Lys Val
130 135 140
Ile Ile Arg Ser Asp Ala Ser Pro Asn Thr His Thr Arg Arg Ala Gly
145 150 155 160
Tyr Val Arg Gly Cys Val Gly Glu Val Val Ala Thr His Gly Ala Tyr
165 170 175
Val Phe Pro Asp Thr Asn Ala Leu Gly Ala Gly Glu Ser Pro Glu His
180 185 190
Leu Tyr Thr Val Arg Phe Ser Ala Thr Glu Leu Trp Gly Glu Pro Ala
195 200 205
Ala Pro Asn Val Val Asn His Ile Asp Val Phe Glu Pro Tyr Leu Leu
210 215 220
Pro Ala Pro Gly His Pro Val His Pro Ala Arg Arg Pro Phe Thr Thr
225 230 235 240
Asp Arg Asn Glu Pro Thr Pro Met Thr Asp His Asn Pro Val Gln Gly
245 250 255
Thr Leu Pro Arg Ser Ser Glu Glu Ile Ala Ala Arg Val Lys Ala Met
260 265 270
Glu Ala Ile Leu Val Asp Lys Gly Leu Ile Ser Thr Asp Ala Ile Asp
275 280 285
His Met Ser Ser Val Tyr Glu Asn Glu Val Gly Pro Gln Leu Gly Ala
290 295 300
Lys Ile Val Ala Arg Ala Trp Val Asp Pro Glu Phe Lys Gln Arg Leu
305 310 315 320
Leu Val Asp Ala Thr Ser Ala Cys Arg Glu Met Gly Val Gly Gly Met
325 330 335
Gln Gly Glu Glu Met Val Val Leu Glu Asn Thr Gly Thr Val His Asn
340 345 350
Met Val Val Cys Thr Leu Cys Ser Cys Tyr Pro Trp Pro Val Leu Gly
355 360 365
Leu Pro Pro Asn Trp Tyr Lys Tyr Pro Ala Tyr Arg Ala Arg Ala Val
370 375 380
Arg Asp Pro Arg Gly Val Leu Ala Glu Phe Gly Tyr Thr Pro Asp Pro
385 390 395 400
Asp Val Glu Ile Arg Ile Trp Asp Ser Ser Ala Glu Leu Arg Tyr Trp
405 410 415
Val Leu Pro Gln Arg Pro Ala Gly Thr Glu Asn Phe Thr Glu Glu Gln
420 425 430
Leu Ala Asp Leu Val Thr Arg Asp Ser Leu Ile Gly Val Ser Val Thr
435 440 445
Thr Ala Pro Ser Lys Ala His Ala Pro Thr Gln Arg Thr Thr Pro Pro
450 455 460
Gly Ser Arg Ser Gln Pro Arg Arg Pro Gly Thr Glu Ser Ala Val Gln
465 470 475 480
Arg Thr Asn Pro Pro Pro Leu Arg Arg Gly Arg Leu Arg Ser Gly Leu
485 490 495
Gly Asp Pro Arg Leu Gln His Cys His Arg Ile Ala Trp Pro Gly Pro
500 505 510
Ile Arg Met Gly Arg Ile Pro Val Pro Pro Asp Arg Val Asp Gln Thr
515 520 525
Val Gly Ser Arg Thr Arg His His Arg Ala Val Glu Leu Leu Arg Ala
530 535 540
Leu Asp Ala Arg Thr Arg Arg Ala Ala Ala Arg Gln Gly Ile Cys Arg
545 550 555 560
Arg Arg Gly Thr Arg Ala Pro Tyr Arg Ala Gly Ala Gly Asn Ala Arg
565 570 575
Arg Arg Pro Ser Pro Ala Arg Arg Ala Ser His Arg Arg Ala Arg His
580 585 590
Arg His Thr His His Leu Arg Arg Val
595 600
<210> 2
<211> 368
<212> PRT
<213> Achromobacter obae
<400> 2
Met Lys Leu Thr Gly Val Glu Leu Arg Arg Val Arg Met Pro Leu Val
1 5 10 15
Ala Pro Phe Arg Thr Ser Phe Gly Thr Gln Ala Ala Arg Glu Leu Leu
20 25 30
Leu Leu Arg Ala Val Thr Pro Ala Gly Glu Gly Trp Gly Glu Cys Gly
35 40 45
Thr Met Glu Ala Pro Leu Tyr Ser Ser Glu Tyr Asn Asp Gly Ala Glu
50 55 60
His Val Leu Arg Asn His Leu Ile Pro Ala Leu Leu Ala Ala Arg Asp
65 70 75 80
Val Thr Ala His Lys Val Thr Pro Leu Leu Ala Lys Phe Lys Gly His
85 90 95
Arg Met Ala Lys Ser Ala Leu Glu Met Ala Val Leu Asp Ala Glu Leu
100 105 110
Thr Ala His Asp Arg Ser Phe Ala Ala Glu Leu Gly Ser Val His Asp
115 120 125
Ser Val Ala Cys Gly Val Ser Val Gly Ile Met Asp Ser Ile Pro His
130 135 140
Leu Leu Asp Val Val Gly Gly Tyr Leu Asp Glu Gly Tyr Gln Arg Ile
145 150 155 160
Lys Leu Lys Ile Glu Pro Gly Trp Asp Val Leu Pro Val Arg Gln Val
165 170 175
Arg Glu Arg Phe Gly Asp Asp Val Leu Leu Gln Val Asp Ala Asn Thr
180 185 190
Ala Tyr Thr Leu Gly Asp Ala Pro Leu Leu Ser Arg Leu Asp Pro Phe
195 200 205
Asp Leu Leu Leu Ile Glu Gln Pro Leu Glu Glu Glu Asp Val Leu Gly
210 215 220
His Ala Glu Leu Ala Lys Arg Ile Arg Thr Pro Ile Cys Leu Asp Glu
225 230 235 240
Ser Ile Val Ser Ala Lys Ala Ala Ala Ala Ala Ile Lys Leu Gly Ala
245 250 255
Cys Gln Ile Val Asn Ile Lys Pro Gly Arg Val Gly Gly Tyr Leu Glu
260 265 270
Ala Arg Arg Val His Asp Val Cys Ala Ala His Gly Ile Ala Pro Trp
275 280 285
Cys Gly Gly Met Ile Glu Thr Gly Leu Gly Arg Ala Ala Asn Val Ala
290 295 300
Leu Ala Ser Leu Pro Gly Cys Thr Leu Pro Gly Asp Thr Ser Ala Ser
305 310 315 320
Gly Arg Phe Tyr Arg Thr Asp Ile Thr Glu Pro Phe Val Leu Asp Asp
325 330 335
Gly His Leu Pro Val Pro Thr Gly Pro Gly Leu Gly Val Thr Pro Ile
340 345 350
Pro Asp Leu Leu Asp Glu Val Thr Thr Glu Lys Ala Trp Ile Gly Ser
355 360 365
<210> 3
<211> 493
<212> PRT
<213> Brevundimonas diminuta
<400> 3
Met Gly Met Lys Ile Glu Phe Val Ala Ala Ser Gly Ala Ala Glu Ile
1 5 10 15
Leu Ala Leu Leu Val His Glu Asp Arg Ala Leu Ala Gly Thr Gly Pro
20 25 30
Ala Leu Asp Ala Ala Ala Ser Gly Ala Leu Val Lys Ala Met Lys Lys
35 40 45
Ser Arg Phe Val Gly Ala Ala Ser Ser Ser Leu Asn Val Ala Ala Pro
50 55 60
Ser Gly Ile Asp Ala Asn Ala Val Leu Leu Val Gly Ala Gly Ala Ala
65 70 75 80
Asp Lys Leu Asp Asp Leu Ala Val Glu Thr Phe Gly Ala Ala Ala Val
85 90 95
Gln Ala Thr Lys Leu Ser Gly Ala Glu Val Leu Thr Ile Asp Val Ser
100 105 110
Gly Leu Ser Pro Glu Leu Ala Ala Arg Ala Gly Phe Ala Ala Arg Leu
115 120 125
Ala Ala Tyr Arg Phe Ala Lys Tyr Leu Thr Lys Gln Lys Ala Asp Lys
130 135 140
Ile Pro Ser Val Thr Ala Val Arg Val Val Thr Ser Asp Val Lys Ala
145 150 155 160
Ala Glu Ala Ala Leu Gln Pro Leu Ser Ala Val Ala Asp Ala Val Leu
165 170 175
Phe Ala Arg Asp Leu Val Ser Glu Pro Ala Asn Ile Leu Tyr Pro Ala
180 185 190
Glu Phe Ala Arg Arg Val Lys Glu Leu Glu Ala Leu Gly Ala Lys Val
195 200 205
Glu Ile Leu Gly Glu Ala Glu Met Gln Lys Leu Gly Met Gly Ser Leu
210 215 220
Leu Gly Val Gly Gln Gly Ser Val Arg Glu Ser Gln Leu Ala Val Ile
225 230 235 240
Gln Trp Asn Gly Gly Glu Glu Gly Glu Ala Pro Ile Ala Phe Val Gly
245 250 255
Lys Gly Val Cys Phe Asp Thr Gly Gly Ile Ser Leu Lys Ala Ala Asp
260 265 270
Gly Met Glu Glu Met Lys Trp Asp Met Gly Gly Ala Ala Ala Val Thr
275 280 285
Gly Leu Met His Ala Leu Val Gly Arg Lys Ala Lys Val Asn Val Val
290 295 300
Gly Val Leu Gly Leu Val Glu Asn Met Pro Asp Gly Asn Ala Gln Arg
305 310 315 320
Pro Gly Asp Val Val Thr Ser Met Ser Gly Gln Thr Val Glu Val Leu
325 330 335
Asn Thr Asp Ala Glu Gly Arg Leu Val Leu Ala Asp Ala Leu Trp Tyr
340 345 350
Thr Gln Gln Arg Phe Lys Pro Lys Phe Met Ile Asp Leu Ala Thr Leu
355 360 365
Thr Gly Ala Met Ile Ile Ser Leu Gly Leu Glu Tyr Ala Gly Val Phe
370 375 380
Thr Asn Ser Asp Ala Leu Ala Ala Asn Ile Ala Asp Ala Gly Pro Lys
385 390 395 400
Val Gly Glu Asn Ser Trp Arg Met Pro Ile Pro Ala Glu Tyr Asp Gln
405 410 415
His Ile Asp Ser Pro Ile Ala Asp Val Lys Asn Met Gly Asn Gly Arg
420 425 430
Ala Gly Gly Ser Ile Thr Ala Ala Leu Phe Leu Gln Arg Phe Thr Asn
435 440 445
Gly Thr Pro Trp Ala His Ile Asp Ile Ala Pro Thr Ala Trp Val Lys
450 455 460
Asp Ser Lys Asn Pro Thr Val Pro Asp Gly Gly Val Gly Tyr Gly Val
465 470 475 480
Arg Leu Leu Asp Arg Met Val Ala Asp His Tyr Glu Gly
485 490

Claims (10)

1.一种式II化合物的生物合成制备方法，其特征在于，由式IV化合物在酶的作用下反应制备，反应式如下：
其中，R选自烷基、硅烷基、硅醚保护基、苄醚保护基、烷氧基甲基、烷氧基取代甲基、C2-C10直链或支链烯烷基、C2-C10直链或支链炔烷基、3-8元脂环族基团、芳基、杂芳基、Ar(CH2)n-基团中的一种，Ar代表芳基、杂芳基，n取1-6，所述酶包括生物酶和辅酶。
2.根据权利要求1所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述生物酶包括酰胺消旋酶和L-酰胺水解酶，所述辅酶为磷酸吡哆醛。
3.根据权利要求2所述的生物合成制备方法，其特征在于，式IV化合物由式I化合物在腈水合酶的的作用下反应制备，反应式如下：
其中，R的定义与权利要求1中相同。
4.一种式II化合物的生物合成制备方法，其特征在于，由式I化合物在酶的的作用下经一锅法反应制备，反应式如下：
其中，R的定义与权利要求1中相同，所述酶包括生物酶和辅酶，所述生物酶包括腈水合酶、酰胺消旋酶和L-酰胺水解酶，辅酶为磷酸吡哆醛。
5.根据权利要求1-4任一项所述的生物合成制备方法，其特征在于，L-草铵膦的生物合成制备方法，由式II化合物脱保护基得到，
其中，R的定义与权利要求1中相同。
6.根据权利要求5所述的生物合成制备方法，其特征在于，R为乙基，控制反应体系的pH为5-8。
7.根据权利要求5所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述腈水合酶基因包括但不限于来源于Rhodococcus rhodochrous，Pseudomonas chlororaphis，Brevibacterium，Agrohaeteriwn tumefadens，Myrothccium verrucaria，Corynehacterium，Pseudomonasputida，Pseudomonas fluorescens，Nocardia simplex，Rhodococcus sp，Nocardiabrasiliensis，Pichia pastoris，Escherichia coli；酰胺消旋酶基因包括但不限于来源于Achromobacter obae，CRYPTOCOCCUS LAURENTII，Cryptococcus sp，Pseudomonas sp，Candida humicola，Achromobacter，Alcaligenes faecalis，Flavobacteriumarborescens Trichosporon cutaneum，Escherichia coli；L-酰胺水解酶基因包括但不限于来源于Brevundimonas diminuta，Ochrobactrum anthropi，Streptomyces，Bacilluscereus，Comamonas acidovorans，Rhodococcus rhodochrous，Mycobacteriumtuberculosis，Brevibacterium sp，Delftia acidovorans，Brevibacillusborstelensis，Variovorax paradoxus，Escherichia coli。
8.根据权利要求7所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述腈水合酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：1所示的蛋白质，或SEQ ID NO：1经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有腈水合酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：1所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有腈水合酶活性的蛋白质；所述酰胺消旋酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：2所示的蛋白质，或SEQ ID NO：2经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有酰胺消旋酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有酰胺消旋酶活性的蛋白质；所述L-酰胺水解酶为氨基酸序列为SEQ ID NO：3所示的蛋白质，或SEQ ID NO：3经过一个或几个氨基酸残基取代、缺失或添加后具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质，或与SEQ ID NO：3所示的氨基酸序列具有80％以上同源性且具有L-酰胺水解酶活性的蛋白质。
9.根据权利要求4所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述步骤1中，所述腈水合酶、酰胺消旋酶、L-酰胺水解酶的投量比控制为1︰0.8-2︰0.8-3。
10.根据权利要求1或4所述的生物合成制备方法，其特征在于，所述步骤1中，反应体系中加入CoCl2，转化反应在溶剂中进行，所述溶剂为缓冲溶液，所述缓冲溶液选自磷酸盐缓冲溶液、碳酸盐缓冲溶液、Tri-HCl缓冲溶液、柠檬酸盐缓冲溶液、MOPS缓冲溶液中的一种。
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