CN108484665B - 一种从酶转化液中分离提取l-草铵膦的方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开一种从酶转化液中分离提取L‑草铵膦的方法，采用酶催化法生产L‑草铵膦时，酶催化液中除了含有L‑草铵膦，还含有酶或菌体、副产物(通常是有机物)、未反应的D‑型底物、铵盐等杂质，由于L‑草铵膦具有易溶于水和不易溶于有机溶剂等特点，分离提取程度困难。本方法主要通过以下3步对L‑草铵膦进行分离提取：(1)预处理；(2)离子交换法；(3)结晶。最后得到的产品纯度达到98％以上，收率达到98％以上。本发明工艺流程短，操作简单，应用范围广，成本低，且L‑草铵膦收率髙，产品质量好。
Description
技术领域
本发明涉及一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，属于化学-酶法生产氨基酸的技术领域。
背景技术
草铵膦(glufosinate ammonium)又名草丁膦，是一种由德国赫斯特公司(现在的拜耳公司)研发的有机磷类除草剂。草铵膦的化学式为C5H12NO4P，易溶于水，不易溶于有机有机溶剂，对光稳定。草铵膦具有高效、低毒、广谱、灭杀性等特点，并且随着百草枯的退市，以及对草甘膦和百草枯的抗性难除杂草越来越多，草铵膦凭借它独特的除草机理而具有广泛的市场前景。目前市售的草铵膦均为外消旋混合物，但只有L-构型的草铵膦具有除草活性，如果使用L-草铵膦可以降低其50％的使用量。
目前L-草铵膦的生产方法可分为化学法和生物法。迄今为止化学法合成L-草铵膦的报道较多。化学法可以通过手性辅助剂诱导法、天然氨基酸手性源法、不对称催化加氢法和不对称Michael加成法等合成L-草铵膦。化学法具有生产方便、见效快等优点。但是化学法合成L-草铵膦通常步骤冗长，合成路线复杂，收率低，且手性拆分试剂昂贵。生物法可根据起始的原料和途径分为3大类：1)以L-草铵膦的衍生物为底物，通过酶法直接水解获得；2)以外消旋草铵膦的前体为底物，通过酶的选择性拆分获得；3)以2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸为底物，通过酶的不对称合成获得，其中涉及的酶系主要有以下7种：1)蛋白酶、2)磷酸二酯酶I、3)脱乙酰基酶、4)酰胺酶、5)α-胰凝乳蛋白酶、6)谷氨酸脱氢酶、7)转氨酶。与化学法相比，生物法合成L-草铵膦具有立体选择性严格、反应条件温和、收率高等优点，探索生物法生产L-草铵膦的可行性具有十分重要的产业化价值和显著的社会效益。
目前已经有很多关于合成L-草铵膦的详细报道，但是关于分离提纯L-草铵膦的报道却很少。目前较多的是关于外消旋草铵膦的分离提取的报道。专利CN102127110A中使用钠滤膜分离与电渗析膜分离的组合工艺分离提纯草铵膦。该发明从富含无机盐的草铵膦溶液中有效的分离草铵膦，收率达到95％以上，草铵膦纯度达到95％以上。但是膜在使用一段时间以后，常出现传质阻力增高，膜通量下降，截留率、操作压力升高等现象。美国专利US5153355中，作者利用两种不同的高聚物或者高聚物/无机盐的双水相萃取系统对L-谷氨酸和L-草铵膦的混合溶液进行有效的分离，得到纯度96％的L-草铵膦溶液。但是这一方法易乳化、相分离时间长、成相聚合物的成本较高。专利CN104860988A使用浮选法来分离纯化草铵膦。该方法草铵膦盐酸盐反应液开始，先用减压蒸馏去除稀盐酸，再使用氨水最大限度生成氯化铵，然后减压蒸馏除去水，最后用浮选溶剂将草铵膦与盐分离，草铵膦的收率与纯度均在95％以上。但是浮选法需要使用的试剂较多，成本高，影响因素多，对工艺要求较高。陈一飞在《草铵膦(Basta)的离子交换树脂提纯技术》中公开了使用201×7强碱型阴离子树脂吸附无机杂质以分离纯化草铵膦的方法。但是此方法消耗的酸碱溶剂较多，且收率较低，低于80％。
综上所述，现有的关于L-草铵膦分离提纯方法较少，大多是关于从化学法生产的外消旋草铵膦溶液中分离提取。并且现有的报道的草铵膦分离方法大都存在操作复杂、运行成本太高等问题。
发明内容
本发明的目的在于提供一种通过反应结晶、离子交换分离和结晶等工艺从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，该方法操作简单、回收率和产品纯度高。
为实现上述目的，本发明的技术方案为：
本发明提供一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，所述方法为：
(1)预处理：取含L-草铵膦的酶转化液减压浓缩至原体积的10-50％后调节pH值至2-5，获得预处理液；
(2)离子交换法：将步骤(1)获得的预处理液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，依次用超纯水和氨水(优选1-2mol/L)洗脱，根据茚三酮显色反应(取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，用吹风机吹干，若滤纸上出现紫色，则表示流出液含有L-草铵膦，若无紫色则表示流出液没有L-草铵膦)，收集含L-草铵膦的流出液(茚三酮反应显紫色的一段时间的洗脱液)；
(3)结晶：将步骤(2)含L-草铵膦的流出液减压浓缩，用重结晶溶液结晶，收集晶体，冷冻干燥(优选-80℃)，获得L-草铵膦；所述重结晶溶液是将聚丙烯酰胺溶于水和丙酮混合而成，其中水与丙酮体积比为1:9，水和丙酮总体积以聚丙烯酰胺重量计为100-1000ml/g。
进一步，步骤(1)预处理方法为：取含L-草铵膦的酶转化液减压浓缩至原体积的10-50％后调节pH值至2-5后，在0-25℃搅拌析晶，过滤，取滤液调节pH值至1-6，获得预处理液。
进一步，步骤(1)减压浓缩温度为50-65℃。
进一步，步骤(2)强酸型阳离子交换树脂为氢型，优选为下列型号之一：001×7、001×8、D072、HD-8、D061、HZ-016或D001cc。
进一步，步骤(2)所述柱层析所用离子交换柱高径比为2-20:1，上样流速为0.5-2.0BV/h，优选1.0BV/h。
进一步，步骤(2)所述洗脱方法为：先用超纯水冲洗4BV，再用1-2mol/L氨水以0.5-2.0BV/h流速洗脱，收集含L-草铵膦的流出液。
进一步，步骤(2)所述离子交换的方法为：将步骤(1)获得的预处理液采用钠型或铵型强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，用超纯水冲洗4BV，收集目标流出液；将目标流出液采用氢型强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，用超纯水冲洗4BV，再用1-2mol/L氨水以0.5-2.0BV/h流速洗脱，收集含L-草铵膦的流出液；所述钠型或铵型强酸型阳离子交换树脂型号为001×7或D001cc；所述氢型强酸型阳离子交换树脂型号为下列之一：001×7、001×8、D072、HD-8、D061、HZ-016或D001cc。更优选为：当含L-草铵膦的酶转化液中含有丙氨酸时，用2mol/L氢氧化钠调节pH值至5后获得的预处理液先用钠型001×7阳离子树脂，在离子交换柱高径比为13:1、上样流速为1BV/h的条件下上样后，用超纯水冲洗4BV，收集目标流出液；将目标流出液采用氢型001×7树脂，在离子交换柱高径比为13:1、0.5BV/h流速的条件下上样后，用超纯水冲洗4BV，随后以0.5BV/h的流速用2mol/L氨水洗脱，收集含L-草铵膦的流出液。
进一步，步骤(3)所述结晶方法为：将步骤(2)L-草铵膦流出液减压浓缩(50-65℃)至恒重，用重结晶溶液0-25℃搅拌析晶，过滤，取晶体冷冻干燥，获得L-草铵膦。
进一步，所述L-草铵膦的酶转化液中含30-100g/L(优选50g/L)的L-草铵膦。
本发明所述的含L-草铵膦的酶转化液可以由不同的酶催化对应的底物生成，不同的酶转化液可以有如下不同的成分：
A.丙氨酸、L-草铵膦、无机离子；
B.L-草铵膦、乙酸、无机离子；
C.无机离子、草酰乙酸、L-草铵膦；
D.苯乙酸、N-苯乙酰-D-草铵膦、L-草铵膦、铵盐等；
E.乙酸、N-乙酰-D-草铵膦、L-草铵膦、铵盐等；
F.L-草铵膦、R-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、铵离子；
G.L-草铵膦、乙醇、丙氨酸、D-双丙胺膦乙酯、无机离子。
本发明预处理中所述减压蒸馏可除去铵离子、乙醇以及乙酸等物质，所用的减压蒸馏温度为50-65℃，调pH值至2-5搅拌结晶可除去苯乙酸、N-苯乙酰-D-草铵膦、N-乙酰-D-草铵膦、R-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、D-双丙胺膦乙酯等杂质。离子交换过程中，如果含L-草铵膦的酶转化液含有丙氨酸，先用钠型或铵型阳离子树脂处理，丙氨酸会吸附于树脂上，上样完成后，用超纯水冲洗，L-草铵膦及其它杂质会随超纯水下来，再用氢型阳离子交换树脂柱层析，依次用超纯水和氨水洗脱，收集L-草铵膦流出液。
本发明的有益效果主要体现在：
(1)本发明适用于多种酶催化法生产L-草铵膦的转化液进行L-草铵膦的分离提纯。通过预处理、离子交换法以及结晶三个步骤对酶转化液进行预处理，最后获得纯度高于98％的L-草铵膦，收率也高于98％。
(2)本发明方法操作简单、步骤短，所用试剂成本低、易得，具有较好的工业化前景。
(3)整个过程获得产品的收率高，最后得到的产品质量好，纯度高。
具体实施方式
下面结合具体实施方式对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此：
本发明所述浓盐酸是指12mol/L浓盐酸。所述超纯水是指经过超纯水仪处理，水中除了水分子(H2O)外，几乎没有什么杂质，没有细菌、病毒、含绿二恶英等有机物和矿物微量元素。质量浓度2％茚三酮的配制方法为：将1g茚三酮与0.04g氯化亚锡加入到50ml超纯水中，加热使其溶解，之后搅拌过滤，避光保存、备用。
实施例1：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将160g N-苯乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-苯乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入780U酰胺酶(在最适条件下，每分钟催化底物生成1μmol的产物所需的酶量，即为1个酶活力单位U，下同)，在35℃下反应8小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/L N-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵离子，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，取滤液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，定时取样进行茚三酮显色反应(反应过程为取一滴流出液滴在滤纸上，再滴上一滴2％茚三酮溶液，用吹风机吹干，若滤纸上出现紫色，则表示流出液含有L-草铵膦，若无紫色则表示流出液没有L-草铵膦)，收集洗脱液(茚三酮反应显紫色的一段时间的洗脱液)，获得含L-草铵膦的流出液；
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(58.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.6g，计算收率为99.2％，纯度为99.5％。
实施例2：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将120g N-乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入2400U酰化酶，在37℃下反应48小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、15g/L乙酸和59.7g/LN-乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取酶转化液1L，在60℃条件下进行减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵盐和部分乙酸，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-乙酰-D-草铵膦结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调解pH值至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液；
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(60.2g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.2g，计算收率为98.3％，纯度为99.1％。
实施例3：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将100g(R,S)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使(R,S)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入500U酰胺酶，在28℃下反应15小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/LL-草铵膦、49.3g/L R-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、铵离子。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在55℃条件下进行减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵盐和部分乙酸，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得R-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调解pH值至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
3)将步骤2)收集到的得L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(59.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.3g，计算收率为98.6％，纯度为98.5％。
实施例4：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将90g 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸和和67g L-天冬氨酸溶于1000mL的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.0)中，加入7500U草酰乙酸转氨酶和24.7g磷酸吡哆醛，在80℃下反应4小时。反应结束后得到酶转化液主要含有盐、66g/L草酰乙酸、50g/L L-草铵膦。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在65℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，获得浓缩液，用浓盐酸将浓缩液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(61.3g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.9g，计算收率为99.8％，纯度为99.5％。
实施例5：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将200g双丙胺膦乙酯加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.0，使底物溶解，随后将溶液定容至1000mL，先加入500U碱性mesinterico肽酶，在25℃下反应6小时，随后加入1000Uα-胰凝乳蛋白酶反应6小时，最后加入1000U磷酸二酯酶Ⅰ，在37℃下反应6小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、34.5g/L乙醇、44.5g/L丙氨酸、93.3g/LD-草铵膦乙酯、无机盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去部分乙醇，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得D-双丙胺膦乙酯结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用2mol/L氢氧化钠水溶液调节pH至6，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氨型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，离子交换柱高径比为13:1。上样流速为1BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，L-草铵膦不吸附而丙氨酸会吸附，收集水洗液。
3)将步骤2)收集到的水洗液以0.5BV/h的流速上样，使用氢型001×7树脂进行离子交换、吸附，离子交换柱高径比为13:1。上样后用超纯水冲洗4BV，随后以0.5BV/h的流速用2mol/L氨水洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
4)将步骤3)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(63.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.0g，计算收率为98.0％，纯度为98.3％。
实施例6：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将86g双丙胺膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使双丙胺膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入2400U蛋白酶，在32℃下反应12小时。反应结束后得到酶转化液主要含有180g/L丙氨酸、50g/L L-草铵膦、无机盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，用2mol/L氢氧化钠水溶液将浓缩液调节pH至5，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的钠型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，离子交换柱高径比为13:1。上样流速为1BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，L-草铵膦不吸附而丙氨酸会吸附，收集水洗液。
3)将步骤2)收集到的水洗液以0.5BV/h的流速上样，使用氢型001×7树脂进行离子交换、吸附，离子交换柱高径比为13:1。上样后用超纯水冲洗4BV，随后以0.5BV/h的流速用2mol/L氨水洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
4)将步骤3)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(57.9g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.4g，计算收率为98.8％，纯度为99.0％。
实施例7：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将110g L-3-乙酰氯基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.8，使底物溶解，随后将溶液定容至1000mL，先与1000U磷酸二酯酶Ⅰ在25℃下反应6小时，随后用氨水调节溶液pH至10.0，与750U酰化酶Ⅰ反应6小时，最后与7000U谷氨酰胺酶在37℃下反应6小时。反应结束后得到酶转化液主要含有15g/L乙酸、50g/L L-草铵膦、铵盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去部分乙酸和铵盐，用浓盐酸将浓缩液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到预处理，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(58.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.7g，计算收率为99.4％，纯度为98.9％。
实施例8：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将160g N-苯乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-苯乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入780U酰胺酶，在35℃下反应8小时。反应结束后得到酶转化液，酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/LN-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取5L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵离子，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸结晶析出。搅拌结晶15h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型强酸型阳离子交换树脂进行离子交换、吸附(表1所示)，树脂量为15Kg，离子交换柱高径比为12.5:1。上样流速为0.5BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液；
3)将步骤2)收集到的洗脱液减压浓缩至恒重(61.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时使得L-草铵膦结晶析出后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重并计算收率。
表1不同强酸型阳离子树脂对L-草铵膦进行分离提取的收率与纯度
从上表1实验结果可以看出，可以用不同型号的强酸型阳离子树脂对L-草铵膦进行分离纯化，分离结果均在96％以上，001×7树脂对L-草铵膦的分离结果最好，最后获得的收率最高。
实施例9：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将800g N-苯乙酰-D,L-草铵膦加入4500mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-苯乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至5000mL，加入780U酰胺酶，在35℃下反应，反应8小时后反应结束。反应结束后得到酶转化液，酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/L N-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。使反应结束后得到酶转化液主要含有50g/LL-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/LN-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取5L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为2.5L，旋蒸过程可以除去铵离子，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸结晶析出。搅拌结晶15h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的001×7氢型强酸型阳离子交换树脂进行离子交换、吸附，树脂量为15Kg，离子交换柱高径比为12.5:1。上样流速为2BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液；
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(289.3g)，加入750ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌使得L-草铵膦结晶析出。搅拌12小时后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重245.5g，计算收率为98.2％，纯度为99.3％。
实施例10：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将110g L-3-乙酰氯基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.8，使底物溶解，随后将溶液定容至1000mL，先与1000U磷酸二酯酶Ⅰ在25℃下反应6小时，随后用氨水调节溶液pH至10.0，与750U酰化酶Ⅰ反应6小时，最后与7000U谷氨酰胺酶在37℃下反应6小时。反应结束后得到酶转化液主要含有15g/L乙酸、50g/L L-草铵膦、铵盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去部分乙酸和铵盐，用浓盐酸调节浓缩液pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤(1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱的高径比为2.5:1-20:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(59.5g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌使得L-草铵膦结晶析出。搅拌12小时后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重并计算收率。
表2离子交换柱不同高径比对L-草铵膦分离提取的收率和纯度
从上表2实验结果可以看出，可以用不同高径比的强酸型阳离子树脂对L-草铵膦进行分离纯化，不同的高径比对L-草铵膦的收率有着显著的影响，其中高径比在5:1-20:1之间是最优选择。
实施例11：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将240g N-乙酰-D,L-草铵膦加入1800mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至2000mL，加入2400U酰化酶，在37℃下反应48小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、15g/L乙酸和60g/L N-乙酰-D-草铵膦、铵盐。
(2)分离纯化
1)取2L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为1000ml，旋蒸过程可以除去铵盐和部分乙酸，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至3.5，在0℃条件下缓慢搅拌，使得N-乙酰-D-草铵膦结晶析出。搅拌结晶24h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调节pH至1.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为6Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以2.0BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液；
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(130.6g)，加入600ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌使得L-草铵膦结晶析出。搅拌12小时后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重99.1g，计算收率为99.1％，纯度为98.7％。
实施例12：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将90g 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸和和67g L-天冬氨酸溶于1000mL的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.0)中，加入7500U草酰乙酸转氨酶和24.7g磷酸吡哆醛，在80℃下反应4小时。反应结束后得到酶转化液主要含有盐、66g/L草酰乙酸、50g/L L-草铵膦。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在65℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，用浓盐酸将浓缩液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤(1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用1mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(60.7g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌使得L-草铵膦结晶析出。搅拌12小时后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.2g，计算收率为98.4％，纯度为98.3％。
实施例13：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将90g 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸和和67g L-天冬氨酸溶于1000mL的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.0)中，加入7500U草酰乙酸转氨酶和24.7g磷酸吡哆醛，在80℃下反应4小时。反应结束后得到酶转化液主要含有盐、66g/L草酰乙酸、50g/L L-草铵膦。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在50℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，用浓盐酸将浓缩液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用1mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，采用实施例1方法收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液。
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(57.8g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌使得L-草铵膦结晶析出。搅拌12小时后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重49.4g，计算收率为98.7％，纯度为98.6％。
对比例1：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
按照实施例1的方法对L-草铵膦进行分离纯化，不同的是：不进行离子交换步骤。
(1)酶转化液
将160g N-苯乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-苯乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入780U酰胺酶，在35℃下反应8小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/L N-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取5L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为2500ml，旋蒸过程可以除去铵离子，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)收集到的预处理液进行液相检测，发现溶液中仍有许多杂质，其成分如下：5g/L苯乙酸、10.2g/L N-苯乙酰-D-草铵膦、3.12g/L氯离子和100g/L的L-草铵膦。
3)将步骤1)收集到的预处理液进行减压浓缩至恒重(58.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时，但是结果并无结晶析出。
对比例2：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
按照实施例2的方法对L-草铵膦进行分离纯化，不同的是：不进行离子交换步骤。
(1)酶转化液
将120g N-乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入2400U酰化酶，在37℃下反应48小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、15g/L乙酸和59.7g/L N-乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取酶转化液1L，在60℃条件下进行减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵盐和部分乙酸，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-乙酰-D-草铵膦结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)收集到的预处理液液进行液相检测，发现溶液中仍有许多杂质，其成分如下：8g/L苯乙酸、10.2g/L N-乙酰-D-草铵膦、3.6g/L氯离子和100g/L的L-草铵膦。
3)将步骤1)收集到的预处理液减压浓缩至恒重(60.2g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时，发现并无结晶析出。
对比例3：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
按照实施例3的方法对L-草铵膦进行分离纯化，不同的是：不进行离子交换步骤。
(1)酶转化液
将100g(R,S)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使(R,S)-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入500U酰胺酶，在28℃下反应15小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/LL-草铵膦、49.3g/L R-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、铵离子。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在55℃条件下进行减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵盐和部分乙酸，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得R-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液用浓盐酸调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)收集到的预处理液行液相检测，发现溶液中仍有许多杂质，其成分如下：6g/L R-2-氨基-4-(羟基甲基膦酰基)-丁酰胺、3.4g/L氯离子和100g/L的L-草铵膦。
3)将步骤1)收集到的滤液减压浓缩至恒重(59.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时，发现并无结晶析出。
对比例4：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
按照实施例4的方法对L-草铵膦进行分离纯化，不同的是：不进行离子交换步骤。
(1)酶转化液
将90g 2-羰基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酸和和67g L-天冬氨酸溶于1000mL的50mmol/L的Tris-HCl缓冲液中(pH8.0)中，加入7500U草酰乙酸转氨酶和24.7g磷酸吡哆醛，在80℃下反应4小时。反应结束后得到酶转化液主要含有盐、66g/L草酰乙酸、50g/L L-草铵膦。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在65℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，获得浓缩液，用浓盐酸将浓缩液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)收集到的预处理液进行液相检测，发现溶液中仍有许多杂质，其成分如下：12.3g/L草酰乙酸、4.12g/L氯离子和100g/L的L-草铵膦。
3)将步骤2)收集到的预处理液减压浓缩至恒重(61.3g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时发现并无结晶析出。
对比例5：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
按照实施例5的方法对L-草铵膦进行分离纯化，不同的是：不进行离子交换步骤。
(1)酶转化液
将200g双丙胺膦乙酯加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.0，使底物溶解，随后将溶液定容至1000mL，先加入500U碱性mesinterico肽酶，在25℃下反应6小时，随后加入1000Uα-胰凝乳蛋白酶反应6小时，最后加入1000U磷酸二酯酶Ⅰ，在37℃下反应6小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、34.5g/L乙醇、44.5g/L丙氨酸、93.3g/LD-草铵膦乙酯、无机盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去部分乙醇，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得D-双丙胺膦乙酯结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液。
2)用2mol/L氢氧化钠水溶液将步骤1)得到的预处理调节pH至6后，上已经预处理好的氨型001×7阳离子树脂，离子交换柱高径比为13:1。上样流速为1BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，L-草铵膦不吸附而丙氨酸会吸附，收集水洗液。
3)将步骤2)收集到的水洗液进行液相检测，发现溶液中仍有许多杂质，其成分如下：1.6g/L乙醇、11.2g/LD-双丙胺膦乙酯、3.6g/L氯化钠和100g/L的L-草铵膦。
4)将步骤2)收集到的水洗液减压浓缩至恒重(63.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶于溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时发现并无结晶析出。
对比例6：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
按照实施例6的方法对L-草铵膦进行分离纯化，不同的是：不进行离子交换步骤
(1)酶转化液
将86g双丙胺膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使双丙胺膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入2400U蛋白酶，在32℃下反应12小时。反应结束后得到酶转化液主要含有180g/L丙氨酸、50g/L L-草铵膦、无机盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml。
2)用2mol/L氢氧化钠水溶液将步骤1)得到的L-草铵膦浓缩液调节pH至5后，上已经预处理好的钠型001×7阳离子树脂，离子交换柱高径比为13:1。上样流速为1BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，L-草铵膦不吸附而丙氨酸会吸附，收集水洗液。
3)将步骤2)收集到的水洗液进行液相检测，发现溶液中仍有许多杂质，其成分如下：6.8g/L氯化钠和100g/L的L-草铵膦。
4)将步骤2)收集到的洗脱液减压浓缩至恒重(57.9g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时，发现没有晶体析出。
对比例7：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
按照实施例7的方法对L-草铵膦进行分离纯化，不同的是：不进行离子交换步骤。
(1)酶转化液
将110g L-3-乙酰氯基-4-(羟基甲基膦酰基)丁酰胺加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.8，使底物溶解，随后将溶液定容至1000mL，先与1000U磷酸二酯酶Ⅰ在25℃下反应6小时，随后用氨水调节溶液pH至10.0，与750U酰化酶Ⅰ反应6小时，最后与7000U谷氨酰胺酶在37℃下反应6小时。反应结束后得到酶转化液主要含有15g/L乙酸、50g/L L-草铵膦、铵盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下进行减压浓缩至转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去部分乙酸和铵盐。
2)将步骤1)收集到的滤液进行液相检测，发现溶液中仍有许多杂质，其成分如下：8g/L乙酸、4.3g/L氯离子和100g/L的L-草铵膦。
3)将步骤1)收集到的洗脱液减压浓缩至恒重(58.6g)，加入250ml混合溶剂(水/丙酮体积比为1:9)和2.5g聚丙烯酰胺，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌12小时发现并无结晶析出。
根据该对比例1-7可以认为，离子交换步骤是本发明的方法中不可缺少的一部分，仅仅通过预处理的方法，溶液中仍含有副产物和大量的盐，对后续结晶造成问题，无法得到高纯度的L-草铵膦产品，然而如果不经过预处理而直接使用离子交换法，为了使L-草铵膦吸附于树脂上，必须将酶转化液pH调节至2.6以下，然而只要pH低于4，酶转化液中的苯乙酸和一些未反应的D-型底物就会析出，若上样液中有固体杂质则会造成分离柱的堵塞，无法进行分离。
对比例8：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将160g N-苯乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-苯乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入780U酰胺酶(在最适条件下，每分钟催化底物生成1μmol的产物所需的酶量，即为1个酶活力单位U，下同)，在35℃下反应8小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/L N-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵离子，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液，取滤液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液；
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(58.6g)，不进行后续的结晶步骤，测定此时L-草铵膦的含量，含量为85.3％。
对比例9：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
(1)酶转化液
将160g N-苯乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-苯乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入780U酰胺酶(在最适条件下，每分钟催化底物生成1μmol的产物所需的酶量，即为1个酶活力单位U，下同)，在35℃下反应8小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/L N-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵离子，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液，取滤液调节pH至2.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的氢型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样后用超纯水冲洗4BV，除去转化液中的杂质，再用2mol/L氨水以0.5BV/h流速洗脱，收集洗脱液，获得L-草铵膦流出液；
3)将步骤2)收集到的L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重(58.6g)，加入200ml无水甲醇，加热使L-草铵膦溶解，在0℃条件下缓慢搅拌使得L-草铵膦结晶析出。搅拌12小时后，将其置于冷冻真空干燥机内-80℃冷冻干燥，获得L-草铵膦晶体。取出晶体后，迅速装入密封袋中，称重54.04g，计算收率为98.7％，纯度为91.3％。
根据对比例8-9可以认为，如不进行结晶直接使用L-草铵膦水剂则溶液中L-草铵膦含量较低；使用普通的溶析剂进行结晶，纯度也仅为90％左右，使用本发明的方法中的重结晶溶液对L-草铵膦进行结晶，得到的L-草铵膦晶体纯度更高。
对比例10：一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，具体步骤如下：
使用一种目前已经报道的分离草铵膦的方法(离子交换法)来分离酶转化液中的L-草铵膦，
(1)酶转化液
将160g N-苯乙酰-D,L-草铵膦加入900mL水中，用17％氨水调节溶液pH至8.5，使N-苯乙酰-D,L-草铵膦溶解，随后将溶液定容至1000mL，加入780U酰胺酶(在最适条件下，每分钟催化底物生成1μmol的产物所需的酶量，即为1个酶活力单位U，下同)，在35℃下反应8小时。反应结束后得到酶转化液主要含有50g/L L-草铵膦、36g/L苯乙酸和80g/L N-苯乙酰-D-草铵膦和铵盐。
(2)分离纯化
1)取1L酶转化液，在60℃条件下减压浓缩至酶转化液体积为500ml，旋蒸过程可以除去铵离子，获得L-草铵膦浓缩液。用浓盐酸将L-草铵膦浓缩液pH调节至2.0，在25℃条件下缓慢搅拌，使得N-苯乙酰-D-草铵膦和苯乙酸结晶析出。搅拌结晶12h后，抽滤除去结晶，收集滤液，此步骤重复一次，合并滤液调节pH至4.0，获得预处理液。
2)将步骤1)得到的预处理液，使用已经预处理好的钠型001×7阳离子树脂进行离子交换、吸附，树脂量为3Kg，离子交换柱高径比为15:1。上样流速为1.0BV/h，上样完成后以水做洗脱剂进行洗脱，洗脱流速为0.5BV/h，分别收集洗脱液和残余液，收集的洗脱液为L-草铵膦溶液，收集的洗脱液的量为9000ml。
3)将步骤2)收集到的洗脱液进行检测，发现洗脱液中含有0.28g/L苯乙酸、0.57g/L N-苯乙酰-D-草铵膦、0.17g/L氯离子和5.56g/L的L-草铵膦，L-草铵膦的纯度仅为84.5％。
根据对比例10可以看出，已经报道的离子交换法无法分离酶转化液中的L-草铵膦和副产物，并没有达到分离效果，因此可以认为，这一经过报道的离子交换法与本专利的离子交换法存在差别，无法应用于本专利。
以上所述仅是本发明的非限定实施方式，对于本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明创造构思和不作出创造性劳动的前提下，还可以作出若干变形和改进，这些都属于本发明的保护范围。
Claims (5)
1.一种从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，其特征在于所述方法为：
(1)预处理：取含L-草铵膦的酶转化液减压浓缩至原体积的10-50％后调节pH值至2-5，在0-25℃搅拌析晶，过滤，取滤液调节pH值至1-6，获得预处理液；
(2)离子交换法：将步骤(1)获得的预处理液采用强酸型阳离子交换树脂进行柱层析，先用超纯水冲洗4BV，再用1-2mol/L氨水以0.5-2.0BV/h流速洗脱，收集含L-草铵膦的流出液；强酸型阳离子交换树脂为下列型号之一：001x7、001x8、D072、HD-8、D061、HZ-016或D001cc；
(3)结晶：将步骤(2)含L-草铵膦的流出液减压浓缩，用重结晶溶液结晶，收集晶体，冷冻干燥，获得L-草铵膦；所述重结晶溶液是将聚丙烯酰胺溶于水和丙酮混合而成，其中水与丙酮体积比为1:9，水和丙酮总体积以聚丙烯酰胺重量计为100-1000ml/g。
2.如权利要求1所述从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，其特征在于步骤(1)减压浓缩温度为50-65℃。
3.如权利要求1所述从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，其特征在于步骤(2)所述柱层析所用离子交换柱高径比为2-20:1，上样流速为0.5-2.0BV/h。
4.如权利要求1所述从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，其特征在于步骤(3)所述结晶的方法为：将步骤(2)L-草铵膦流出液减压浓缩至恒重，用重结晶溶液在0-25℃搅拌析晶，过滤，取晶体冷冻干燥，获得L-草铵膦。
5.如权利要求1所述从酶转化液中分离提取L-草铵膦的方法，其特征在于所述L-草铵膦的酶转化液中含30-100g/L L-草铵膦。
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