CN102993270B - 甘氨酰-l-酪氨酸的制备工艺 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种甘氨酰-L-酪氨酸的制备工艺，属于药物化学领域，包括缩合反应和氨解反应，氨解反应是由N-氯乙酰-L-酪氨酸与浓氨水直接进行氨解反应，反应结束后，在40～50℃、-0.08～-0.10MPa下减压蒸除过量的氨水，剩余物经水重结晶后过滤制得甘氨酰-L-酪氨酸粗品。本发明的氨解步骤中直接使用N-氯乙酰-L-酪氨酸与浓氨水反应，不用再另外加入碳酸氢铵催化，可以大大降低甘氨酰-L-酪氨酸的纯化难度，不仅避免了后处理过程中盐酸调节PH值产生的氯化铵难以除去的问题，并且水重结晶代替用WA-30柱层析分离，提高了产物的收率和纯度的同时，降低了反应成本，所得粗品经过一次精制就可达到药用级别，极大的简化了操作，方便了工业化生产。
Description
技术领域
本发明属于药物化学领域，涉及一种甘氨酰-L-酪氨酸的制备工艺。
背景技术
甘氨酰-L-酪氨酸是由酪氨酸和甘氨酸反应而成的人工合成二肽。目前制备甘氨酰-L-酪氨酸方法主要有两种途径：一是L-酪氨酸与氯乙酰氯缩合然后氨解的方法制备甘氨酰-L-酪氨酸，该合成路线所用的起始原料氯乙酰氯、L-酪氨酸和氨水皆为常见原料，价廉易得，且反应路线较短，可以大大降低终产品的成本，较适合于工业化生产；另一种是L-酪氨酸酯与N-保护的甘氨酸为起始原料进行缩合成肽反应制备甘氨酰-L-酪氨酸，此路线与第一种路线相比，合成路线较长，活性酯的合成以及保护基的脱掉步骤降低了氨酰-L-酪氨酸合成的总收率。
甘氨酰-L-酪氨酸的化学结构式如下：
2001年美国专利(US Patent 6,197,998B1)报道了酰氯反应氨解的方法，首先由氯乙酰氯与L-酪氨酸在碱性条件下进行缩合反应制得N-氯乙酰-L-酪氨酸，N-氯乙酰-L-酪氨酸再在6eq的碳酸氢钠催化下与氨水进行氨解反应制的甘氨酰-L-酪氨酸粗品，然后经过WA-30柱层析分离、水重结晶得到甘氨酰-L-酪氨酸。
Paul，R.et al.，Journal Organic Chemistry Vol27：2094～99(1962)，报道了以N，N′-碳酰二咪唑为缩合剂将苄氧羰基甘氨酸和酪氨酸乙酯，缩合成肽，然后水解掉保护基制备甘氨酰-L-酪氨酸的方法。
S.Rajappa，K et al.，Tetrahedron Vol23：4805～9(1967)，报道了O-(N-苄氧羰基甘氨酰)新戊酰异羟肟酸为活性酯低温下加入酪氨酸乙酯，先缩合成肽，然后水解掉保护基制备甘氨酰-L-酪氨酸的方法。
欧洲专利EP311057(1998)，报道了以二环己基碳酰亚胺为缩合剂，将N-羟基琥珀酰亚胺和苄氧羰基甘氨酸制成活性酯，然后与酪氨酸乙酯缩合成肽，继而水解制备甘氨酰-L-酪氨酸的方法。
发明内容
本发明的目的是提供一种甘氨酰-L-酪氨酸的制备工艺，对氨解以及精制工艺进行了优化，从而降低了成本，并且提高了收率和纯度，更适用于工业化生产。
所述的甘氨酰-L-酪氨酸的制备工艺，包括由氯乙酰氯与L-酪氨酸在碱性条件下发生缩合反应得到N-氯乙酰-L-酪氨酸，然后再进行氨解反应得到甘氨酰-L-酪氨酸，氨解反应由N-氯乙酰-L-酪氨酸与浓氨水在无任何催化剂催化的条件下直接进行，反应结束后，在40～50℃、-0.08～-0.10MPa下减压蒸除过量的氨水，剩余物经水重结晶后过滤制得甘氨酰-L-酪氨酸粗品，再经精制工艺得到药用级别的甘氨酰-L-酪氨酸精制品。
制得的甘氨酰-L-酪氨酸粗品的HPLC纯度≥98.0％，收率为75％～85％；药用级别的甘氨酰-L-酪氨酸精制品的HPLC纯度≥99.5％，收率为80％～90％。
所述的氨解反应中N-氯乙酰-L-酪氨酸的质量与浓氨水体积比值为1∶5～20，N-氯乙酰-L-酪氨酸的质量以克计，浓氨水体积以毫升计。
所述的氨解反应温度为30℃～50℃，氨解反应时间为7～10小时。
所述的氨解反应进程通过TLC监控，展开剂为氯仿和甲醇，两者体积比为1∶3，TLC为薄层色谱。
所述的水重结晶过程中，水的加入体积与N-氯乙酰-L-酪氨酸质量比为1～3∶1，水的体积以毫升计，N-氯乙酰-L-酪氨酸的质量以克计。
制得的甘氨酰-L-酪氨酸粗品，可以在化工工业中直接应用。
所述的精制工艺包括如下步骤：
(1)溶解：将甘氨酰-L-酪氨酸粗品溶于纯化水中，甘氨酰-L-酪氨酸粗品的质量和纯化水体积比值为1∶5～15，搅拌状态下加热至30℃～50℃下至固体全部溶解，甘氨酰-L-酪氨酸粗品质量以克计，纯化水的体积以毫升计；
(2)吸附过滤：加入活性炭，恒温下搅拌40～60min后趁热过滤，加入的活性炭与甘氨酰-L-酪氨酸粗品的质量比为2％，将所得滤液继续加入活性炭，重复吸附过滤一次；
(3)析晶：滤液温度降至25±2℃后，加入与纯化水等体积的乙醇，然后放置于-5℃～0℃下析晶8～10小时，制得药用级别的甘氨酰-L-酪氨酸精制品。
本发明采用如下的工艺路线：
本发明的有益效果如下：
(1)本发明的氨解反应直接使用N-氯乙酰-L-酪氨酸与浓氨水反应，不用再另外加入碳酸氢铵进行催化，可以大大降低甘氨酰-L-酪氨酸的纯化难度，避免了后处理过程中盐酸调节PH值产生的氯化铵难以除去的问题；
(2)采用水重结晶代替用WA-30柱层析分离，提高了产物的收率和纯度的同时，降低了反应成本；
(3)所得粗品经过一次精制就可达到药用级别，极大的简化了操作，方便了工业化生产。
附图说明
图1是本发明实施例1甘氨酰-L-酪氨酸粗品HPLC谱图。
图2是本发明实施例2甘氨酰-L-酪氨酸精制品HPLC谱图。
图3是本发明实施例3甘氨酰-L-酪氨酸粗品HPLC谱图。
图4是本发明实施例4甘氨酰-L-酪氨酸精制品HPLC谱图。
图5是本发明实施例5甘氨酰-L-酪氨酸粗品HPLC谱图。
图6是本发明实施例6甘氨酰-L-酪氨酸精制品HPLC谱图。
图7是本发明实施例7甘氨酰-L-酪氨酸粗品HPLC谱图。
图8是本发明实施例8甘氨酰-L-酪氨酸精制品HPLC谱图。
具体实施方式
以下结合实施例对本发明做进一步描述。
实施例中的N-氯乙酰-L-酪氨酸是由氯乙酰氯与L-酪氨酸在碱性条件下发生缩合反应制得的，实施例中使用的浓氨水为市售产品，质量百分比浓度为25～28％。
实施例中所用的HPLC色谱仪器为Waters 600_717_2996，使用的色谱柱为GRACEAlltima Amino 5um 250mm*4.6mm，流动相为0.05mol/L磷酸二氢钾溶液(磷酸调pH值4.0)∶乙腈＝40∶60(体积比)。
实施例1
在250ml单口瓶中加入200ml浓氨水，然后加入10g N-氯乙酰-L-酪氨酸，溶液在搅拌条件下加热至30℃，氨解约8小时，用薄层色谱法(GF254板，展开剂：氯仿-甲醇(1∶3)，反应产物甘氨酰-L-酪氨酸Rf值：0.3左右)监控反应进程，当溶液中的L-酪氨酸斑点基本消失时，停止反应。首先在40℃，-0.09±0.01Mpa下将氨气抽走，然后在45℃、-0.09±0.01Mpa下将水减压蒸馏至干，加入10ml的纯化水至剩余物溶解，将溶液置于冰箱内放置过夜，待结晶完全。过滤，即得粗品8.8g，收率82.3％。HPLC纯度为98.25％，HPLC谱图见图1，HPLC积分结果见表1。
表1实施例1的HPLC积分结果表
实施例2
在250ml单口瓶中加入7.0g甘氨酰-L-酪氨酸粗品和35ml的纯化水，然后在搅拌条件下慢慢加热至50℃，此时固体全部溶解，然后加入0.14g的活性炭，搅拌40min后趁热过滤，滤液继续加入0.14g的活性炭于50℃下搅拌40min后趁热过滤，滤液慢慢降温至25±2℃后，滴加35ml的乙醇，滴加完毕后，将其置于-2±2℃的温度下析晶8小时，即可得到6.2g的甘氨酰-L-酪氨酸精制品，收率为88.6％，HPLC纯度为99.65％，HPLC谱图见图2，HPLC积分结果见表2。
表2实施例2的HPLC积分结果表
实施例3
在250ml单口瓶中加入150ml浓氨水，然后加入10g N-氯乙酰-L-酪氨酸，溶液在搅拌条件下加热至35℃，氨解约10小时，用薄层色谱法(GF254板，展开剂：氯仿-甲醇(1∶3)，反应产物甘氨酰-L-酪氨酸Rf值：0.3左右)监控反应进程，当溶液中的L-酪氨酸斑点基本消失时，停止反应。首先在40℃，-0.09±0.01Mpa下将氨气抽走，然后在48℃、-0.09±0.01Mpa下将水减压蒸馏至干，加入20ml的纯化水至剩余物溶解，将溶液置于冰箱内放置过夜，待结晶完全。过滤，即的粗品8.6g，收率80.7％。HPLC纯度为98.62％，HPLC谱图见图3，HPLC积分结果见表3。
表3实施例3的HPLC积分结果表
实施例4
在250ml单口瓶中加入7.0g甘氨酰-L-酪氨酸粗品和70ml的纯化水，然后在搅拌条件下慢慢加热至40℃，此时固体全部溶解，然后加入0.14g的活性炭，搅拌50min后趁热过滤，滤液继续加入0.14g的活性炭于50℃下搅拌50min后趁热过滤，滤液慢慢降温至25±2℃后，滴加70ml的乙醇，滴加完毕后，将其置于-2±2℃的温度下析晶9小时，即可得到6.1g的甘氨酰-L-酪氨酸精制品，收率为87.1％，HPLC纯度为99.64％，HPLC谱图见图4，HPLC积分结果见表4。
表4实施例4的HPLC积分结果表
实施例5
在250ml单口瓶中加入100ml浓氨水，然后加入10g N-氯乙酰-L-酪氨酸，溶液在搅拌条件下加热至40℃，氨解约7小时，用薄层色谱法(GF254板，展开剂：氯仿-甲醇(1∶3)，反应产物甘氨酰-L-酪氨酸Rf值：0.3左右)监控反应进程，当溶液中的L-酪氨酸斑点基本消失时，停止反应。首先在40℃，-0.09±0.01Mpa下将氨气抽走，然后在50℃、-0.09±0.01Mpa下将水减压蒸馏至干，加入25ml的纯化水至剩余物溶解，将溶液置于冰箱内放置过夜，待结晶完全。过滤，即的粗品8.5g，收率79.7％。HPLC纯度为98.55％，HPLC谱图见图5，HPLC积分结果见表5。
表5实施例5的HPLC积分结果表
实施例6
在250ml单口瓶中加入7.0g甘氨酰-L-酪氨酸粗品和84ml的纯化水，然后在搅拌条件下慢慢加热至35℃，此时固体全部溶解，然后加入0.14g的活性炭，搅拌60min后趁热过滤，滤液继续加入0.14g的活性炭于50℃下搅拌60min后趁热过滤，滤液慢慢降温至25±2℃后，滴加84ml的乙醇，滴加完毕后，将其置于-2±2℃的温度下析晶10小时，即可得到5.9g的甘氨酰-L-酪氨酸精制品，收率为84.3％，HPLC纯度为99.67％，HPLC谱图见图6，HPLC积分结果见表6。
表6实施例6的HPLC积分结果表
实施例7
在250ml单口瓶中加入50ml浓氨水，然后加入10g N-氯乙酰-L-酪氨酸，溶液在搅拌条件下加热至50℃，氨解约8小时，用薄层色谱法(GF254板，展开剂：氯仿-甲醇(1∶3)，反应产物甘氨酰-L-酪氨酸Rf值：0.3左右)监控反应进程，当溶液中的L-酪氨酸斑点基本消失时，停止反应。首先在40℃，-0.09±0.01Mpa下将氨气抽走，然后在45℃、-0.09±0.01Mpa下将水减压蒸馏至干，加入30ml的纯化水至剩余物溶解，将溶液置于冰箱内放置过夜，待结晶完全。过滤，即的粗品8.0g，收率75.0％。HPLC纯度为98.23％，HPLC谱图见图7，HPLC积分结果见表7。
表7实施例7的HPLC积分结果表
实施例8
在250ml单口瓶中加入7.0g甘氨酰-L-酪氨酸粗品和105ml的纯化水，然后在搅拌条件下慢慢加热至30℃，此时固体全部溶解，然后加入0.35g的活性炭，搅拌60min后趁热过滤，滤液继续加入0.35g的活性炭于50℃下搅拌60min后趁热过滤，滤液慢慢降温至25±2℃后，滴加105ml的乙醇，滴加完毕后，将其置于-2±2℃的温度下析晶10小时，即可得到5.7g的甘氨酰-L-酪氨酸精制品，收率为81.4％，HPLC纯度为99.87％，HPLC谱图见图8，HPLC积分结果见表8。
表8实施例8的HPLC积分结果表
Claims (2)
1.一种甘氨酰-L-酪氨酸的制备工艺，包括由氯乙酰氯与L-酪氨酸在碱性条件下发生缩合反应得到N-氯乙酰-L-酪氨酸，然后再进行氨解反应得到甘氨酰-L-酪氨酸，其特征在于氨解反应由N-氯乙酰-L-酪氨酸与浓氨水在无任何催化剂催化的条件下直接进行，反应结束后，在40~50℃、-0.08～-0.10MPa下减压蒸除过量的氨水，剩余物经水重结晶后过滤制得甘氨酰-L-酪氨酸粗品，再经精制工艺得到药用级别的甘氨酰-L-酪氨酸精制品；
所述的精制工艺包括如下步骤：
（1）溶解：将甘氨酰-L-酪氨酸粗品溶于纯化水中，甘氨酰-L-酪氨酸粗品的质量和纯化水体积比值为1:5～15，搅拌状态加热至30℃～50℃下至固体全部溶解，甘氨酰-L-酪氨酸粗品质量以克计，纯化水的体积以毫升计；
（2）吸附过滤：加入活性炭，恒温下搅拌40～60min后趁热过滤，加入的活性炭与甘氨酰-L-酪氨酸粗品的质量比为2%，将所得滤液继续加入活性炭，重复吸附过滤一次；
（3）析晶：滤液温度降至25±2℃后，加入与纯化水等体积的乙醇，然后放置于-5℃～0℃下析晶8～10小时，制得药用级别的甘氨酰-L-酪氨酸精制品；
所述的氨解反应中N-氯乙酰-L-酪氨酸的质量与浓氨水体积比值为1:5～20，N-氯乙酰-L-酪氨酸的质量以克计，浓氨水体积以毫升计；
所述的氨解反应温度为30℃～50℃，氨解反应时间为7～10小时。
2.根据权利要求1所述的甘氨酰-L-酪氨酸的制备工艺，其特征在于所述的氨解反应进程通过TLC监控，展开剂为氯仿和甲醇，两者体积比为1:3。
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