CN106699839B - 化学法合成Diapin(甘-甘-亮,Gly-gly-leu)工艺 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种化学法合成Diapin(Gly‑Gly‑Leu)工艺，属于化工合成领域，其特征在于以亮氨酸和氯乙酰氯为起始原料，首先进行酰化反应生成甘氨酰‑亮氨酸氯代二肽，然后氨解得到甘氨酰‑亮氨酸二肽；二肽再和氯乙酰氯进行酰化反应生成甘氨酰‑甘氨酰‑亮氨酸氯代三肽，然后再氨解得到甘氨酰‑甘氨酰‑亮氨酸三肽，含量大于99％，收率大于56％。本发明用化学酰氯法合成三肽Diapin，同时适用于通式(Gly)n‑Leu的多肽，包括其L‑和D‑构型。该方法实验步骤简单，原料易得，收率高，易于工业化生产。不像固相法和液相法要进行基团的保护和脱保护，然后裂解，再进行液相HPLC制备，成本高，操作繁琐。

Description

化学法合成Diapin(甘-甘-亮,Gly-gly-leu)工艺

技术领域：

本发明涉及一种化学法合成三肽Diapin的工艺，属于化工合成领域。

背景技术

一百多年前Curtius人工合成了第一个多肽，后来的50年明确确立了通过叠氮酸及酰氯生成肽键的方法，但尚未提供合成多肽的通用途径。虽然1932年Bergmann和Zervas提供的苄氧羰基为多肽合成铺平了道路，但由于测序方法学的落后，直到1953年Vigneaud及同事才合成了催产素。无疑这是合成多肽领域里第一个辉煌成就。有意思的是，上世纪50年代初，每隔几年就会有些进展，混合酸酐法、活泼酯法和偶联试剂接二连三取得成功。现在固相法和液相法为多肽合成的主流，尽管没有尽善尽美的理想方法，但许多实验室的持续努力使得合成任何多肽所需要的程序都有广泛选择的余地。2012年密歇根大学医学院陈育庆教授发现了三肽GGL等15个化合物具有降糖作用并筛选出GGL(L)或(D)药效最佳。采用L-亮氨酸的酰化法制得三肽，以便找出一条适合工业化生产的路子。

多肽或三肽的合成有多种手段，传统的方法有混合酸酐法、液相法、固相法、活泼酯法和偶联试剂法。比较成熟的有两大类：一是固相法，1936年美国著名生物化学家BruceMerifield发明了多肽固相合成法(Solid Phase Peptide Synthesis SPPS)。由于其独特的优越性，大量具有重要生物活性的多肽、激素及蛋白质在短短几年内被合成。固相合成法的原理是将目标肽链的C端氨基酸的羧基通过适当的Linker连接在不溶性的高分子上，结合在固相载体上的氨基酸作为氨基组分，和过量的活化羧基组分反应连接，达到合成肽链的长度后，除去侧链保护基，然后从树脂上切割下来。优点是简化了反应后处理操作，速度快，易于实现自动化，但不易实现工业化生产。对长肽(10肽以上)可以显示其优点，但对短肽则无优势。二是液相法，即Boc保护法及混合酸酐法。其优点是缩合收率较高，不易消旋化，可以工业化生产，但最后要脱保护基，进行液相色谱制备纯化。原料和生产成本高。

在上述两大类方法中，原料都需要用保护基保护，最后脱保护，然后用液相色谱HPLC制备纯化，因此收率低，原料和生产成本高；大量的二氯甲烷、DMF、哌啶、TFA无法回收，对环境污染较大，废液处理成本高。

发明内容

根据现有技术的不足，本发明要解决的技术问题是：提供一种合成三肽Diapin的工艺，氨基酸不要任何保护的情况下，以亮氨酸为起始原料，经氯乙酰氯酰化、氨解、再酰化和氨解得到三肽Diapin，减少了固相合成法和液相合成法的保护和脱保护的步骤，避开了收率低、成本高的液相制备的纯化，提高了产品质量，产品纯度HPLC≥99.8％，总收率≥56％。

本发明所采用的技术方案是：提供一种化学酰氯法合成三肽Diapin(Gly-Gly-Leu)，其特征在于以亮氨酸和氯乙酰氯为起始原料，首先进行酰化反应生成甘氨酰-亮氨酸氯代二肽，然后氨解得到甘氨酰-亮氨酸二肽；二肽再和氯乙酰氯进行酰化反应生成甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸氯代三肽，然后再氨解得到甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸三肽。

所述的化学法合成三肽Diapin工艺，其特征在于所述的氨解之一为胺化合物。

所述的化学法合成三肽Diapin工艺，其特征在于所述的胺化合物优选氨水或乌洛托品及其衍生物。

所述的化学法合成三肽Diapin工艺，其特征在于用化学酰氯法合成三肽Diapin，同时适用于通式(Gly)n-Leu的多肽，包括其L-和D-构型。

所述的化学法合成三肽Diapin工艺，其特征在于所述的胺化合物用量为底物摩尔比的1∶∶1-1∶40。

所述的化学法合成三肽Diapin工艺，其特征在于所述的胺化合物氨水的用量为底物摩尔比1∶25-1∶35；乌洛托品的用量为底物摩尔比1∶1.5-1∶2.5。

所述的化学法合成三肽Diapin工艺，其特征在于所述的胺化反应温度为0-80℃，优选10-25℃。

反应过程如下：

该反应过程不用像固相法、液相法和混合酸酐法那样要用保护基保护和脱保护，所有反应都是普通的有机反应。得到了二个新化合物氯代甘氨酰-亮氨酸和氯代甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸中间体，合成过程中此二中间体无需精制，可直接用于下一步氨化。

本发明用化学酰氯法合成三肽Diapin，同时适用于通式(Gly)n-Leu的多肽，四肽、五肽、六肽以致无穷，包括其L-和D-构型。该方法实验步骤简单，原料易得，收率高，易于工业化生产。不像固相法和液相法要进行基团的保护和脱保护，然后裂解，再进行液相HPLC制备，成本高，操作繁琐。

具体实施方案

下面结合实施例对本发明做进一步描述：

实施例一：氯代甘氨酰-亮氨酸(中间体I)的制备

表1 制备中间体I物料表

1.1、反应式：

1.2、操作过程：

在200L搪瓷反应釜中，加入L-亮氨酸6.6kg(50.38mol)，水16kg，搅拌降温至10±5℃，滴加5M NaOH 12.2kg，温度控制在30℃以下，滴毕，PH≥10，体系基本溶清，加入甲苯21.5kg，冷却至0℃以下，同时滴加氯乙酰氯6.8(60.18mol)和甲苯17.5kg的溶液和5MNaOH17.8kg溶液，温度控制在-10-0℃，使PH始终≥10，滴加过程2-3h，滴毕，0-5℃保温反应1h；约20-30min.测一次PH值，使PH≥10。分液，甲苯层用10kg水洗一次，合并水相，用6M HCl调PH≤2，搅拌1h，抽滤，固体用水5kg×3洗涤，60±5℃鼓风干燥12h，得类白色固体氯代二肽约9.8kg，mp：121-123℃，比旋度：[α]_D ²⁰＝-16.8°(C＝5，CH₃OH)收率：90-95％。HPLC：98.5％。¹HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ12.66(brs，1H)；8.45-8.47(d，J＝8.0Hz，1H)；4.20-4.27(tt，J＝6.0Hz，1H)；4.05-4.13(dd，J＝13.2 Hz，2H)；1.60-1.66(九重峰，J＝6.8Hz，1H)；1.50-1.54(dd，，J＝3.2Hz，2H)；0.94-0.96(dd，，J＝6.60Hz，6H)。ESI/MS：m/z 207.98(100)，[M+H]⁺208.95。

实施例二：二肽甘氨酰-亮氨酸(II)的制备

表2 制备中间体II物料表

注：氯代二肽：浓氨水(W/W)＝9-10

2.1、反应式：

2.2、操作过程：

在200L搪瓷反应釜中，加入浓氨水90kg，冷却至10℃以下，搅拌下加入氯代二肽9.8kg(47.23mol)，温度控制在15±5℃下搅拌反应6天(第三天体系溶清)。减压浓缩成粘稠状，有固体析出，抽滤，固体用4kg水洗，固体用16kg无水乙醇打浆2h；母液继续浓缩至约12L，加入16kg无水乙醇，搅拌4h，过滤；合并固体，加入10kg水搅拌1h，再加入32kg无水乙醇搅拌4h，过滤，用4kg无水乙醇洗涤，60±5℃鼓风干燥10h，得类白色固体二肽G-L 6.16kg，mp：238-241℃，比旋度：[α]_D ²⁰＝-36.2°(C＝2，H₂OH)，收率：60-70％。HPLC：99.3％。¹HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ12.66(brs，1H)；8.31-8.33(d，J＝8.0Hz，1H)；4.16-4.23(dd，J＝6.0Hz，1H)；3.24-3.54(tt，J＝13.2 Hz，2H)；1.99-2.01(dd，，J＝8.4Hz，2H)；1.41-1.53(九重峰，J=16.0Hz，1H)；1.23-1.27(dd，J＝3.2Hz，2H)；0.94-0.96(dd，J＝6.60Hz，6H)。ESI/MS：m/z 207.98(100)，[M+H]⁺208.95。

实施例三：氯代甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸(III)的制备

表3 制备中间体III物料表

3.1、反应式：

3.2、操作过程：

在200L搪瓷反应釜中，加入二肽G-L 6.16g(32.76mol)，水30kg，搅拌降温至10±5℃，滴 加5M NaOH 8.0kg，温度控制在30℃以下，滴毕，PH≥10，体系基本溶清，加入甲苯14.5kg，冷却至0℃以下，同时滴加氯乙酰氯4.45kg(39.32mol)的甲苯4.5kg溶液和5M NaOH溶液11.30kg，温度控制在-10-0℃，使PH始终≥10，滴加过程2-3h，滴毕，0-5℃保温反应1h；约20-30min.测一次PH值，使PH≥10。分液，甲苯层用8kg水洗一次，合并水相，用6M HCl调PH≤2，冷却降温至0±5℃搅拌12h，抽滤，固体用0℃水洗涤(4kg×2)；固体再加入50kg水打浆，冷却降温至0±5℃搅拌12h，抽滤，固体用0℃水(4kg×3)洗涤，60±5℃鼓风干燥12h，得类白色固体氯代三肽6.97kg，mp：129-133℃，比旋度：[α]_D ²⁰＝-19.2°(C＝5，CH₃OH)收率：75-85％。HPLC：95.5％。¹HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ11.04(brs，1H)；8.02-8.40(d，J＝2.68Hz，1H)；7.83-7.95(dd，J＝3.96Hz，1H)；4.14-4.26(tt，J＝2.61Hz，1H)；3.75-3.91(dd，J＝27.68Hz，2H)；3.25(tt，J＝2.63Hz 2H)；1.60-1.63(九重峰，J＝3.65Hz，1H)；1.48-1.53(dd，J＝3.62Hz，2H)；0.94-0.96(dd，J＝6.60Hz，6H)。ESI/MS：m/z 264.98(100)，[M+H]⁺264.99。

实施例四：三肽甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸的制备

4.1、反应式：

4.2、中间体IV季铵盐的制备

表4 制备中间体IV季铵盐物料表

4.3、操作过程：

在200L搪瓷反应釜中，加入氯仿40kg，乌洛托品7.76kg(55.34mol)，搅拌下加入氯代三肽6.97kg(26.35mol)，25±5℃下搅拌下反应12h。抽滤，固体用6kg氯仿洗涤，55±5℃鼓 风干燥10h，得类白色固体氯代三肽季铵盐10.72kg，收率：100-110％。

实施例五：三肽Diapin的制备

表5 制备三肽Diapin物料表

5.1、操作过程：

在5L三口瓶中，加入冰醋酸900ml，水1.5L，搅拌降温至0±5℃，加入氯代三肽季铵盐595g(1.47mol)，约30min.搅拌澄清，加入无水乙醇1.5L，控制反应温度在25±5℃下反应16h，减压浓缩至干，呈粘稠玻璃态，加入水1.4L搅拌溶解，冷却至5±5℃下，用浓氨水约700ml调PH≥8，减压浓缩蒸水约2.2±0.1L，体系有粘稠固体析出。加入3L无水乙醇，搅拌12h，抽滤，固体用500ml无水乙醇洗涤；固体转入5L反应瓶中，加入300ml水，打浆1h，加入3L无水乙醇搅拌12h，抽滤，固体用500ml无水乙醇洗涤；

实施例六：三肽Diapin的精制

表6 精制三肽Diapin的物料表

6.1、操作过程：

将固体用1.5kg水搅拌稍加热溶解，抽滤，滤液减压浓缩蒸出1.4±0.1L水，加入1.8L无水乙醇(约剩余水量的10倍)，搅拌12h，抽滤，固体用500ml无水乙醇洗涤，50±5℃鼓风干燥12h，得类白色固体三肽G-G-L(L)240g，mp：189-193℃，比旋度：[α]_D ²⁰＝-29.2°收率：70.6％(65-75％)。 HPLC：99.8％。¹HNMR(DMSO-d6，400MHz)：δ11.04(brs，1H)；8.02-8.40(d，J＝2.68Hz，1H)；7.83-7.95(dd，J＝3.96Hz，1H)；δ6.14(brs，2H)；4.14-4.26(tt，J＝2.61Hz，1H)；3.75-3.91(dd，J＝27.68 Hz，2H)；3.25(tt，J＝2.63Hz，2H)；1.60-1.63(九重峰，J＝3.65Hz，1H)；1.48-1.53(dd，J＝3.62Hz，2H)；0.94-0.96(dd，J＝6.60Hz，6H)。ESI/MS：m/z 245.94.4(100)，[M+H]⁺246.95。

Claims (1)

1.一种化学酰氯法合成三肽Daipin（Gly-Gly-Leu）的方法，其特征在于以亮氨酸和氯乙酰氯为起始原料，首先进行酰化反应生成甘氨酸-亮氨酸氯代二肽，然后氨解得到甘氨酰-亮氨酸二肽；二肽再和氯乙酰氯进行酰化反应生成甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸氯代三肽，甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸氯代三肽与乌洛托品反应，胺化得到甘氨酰-甘氨酰-亮氨酸三肽，其所述乌洛托品用量为底物摩尔比1:1.5-1:2.5，胺化反应温度25±5℃，反应时间为12小时。