DK148018B - Fremgangsmaade til fremstilling af l-phenylglycin og d-phenylglycinamid eller d-phenylglycin - Google Patents

Description

148018

Opfindelsen angår en fremgangsmåde til fremstilling af L-phenyl= glycin og D-phenylglycinamid eller D-phenylglycin.

Racemisk phenylglycin kan spaltes i sine optisk aktive antipoder ved hjælp af konventionelle processer, som involverer saltdannelse af phenylglycinet eller et derivat deraf eller en forløber derfor med en syre og selektiv krystallisation eller anden separerings-teknik .

Opfindelsen tager sigte på at angive en fremgangsmåde til fremstilling af L-phenylglycin og D-phenylglycinamid eller D-phenylglycin ved selektiv enzymatisk hydrolyse af racemisk phenylglycinamid.

Det er kendt, at aminosyreamider kan hydrolyseres selektivt ved 2 148018 hjælp af et enzym. Aromatiske aminosyreamider, såsom phenylalanin-amid, kan generelt hydrolyseres under indvirkning med enzymer, såsom papain, bromelain eller fycin. Det har imidlertid vist sig, at disse enzymer ikke hydrolyserer phenylglycinamid.

Fra J.P.Greenstein & M.Winitz: Chemistry of the Amino Acids, bind 3 (1961), side 1778-1779, er det endvidere kendt, at en racemisk blanding af et antal α-aminosyreamider optisk kan separeres i L-syren og D-amidet ved hjælp af enzymatisk indvirkning af leucinaminopeptidase. Det er derfor kun L-aminosyreamidet, som hydrolyseres.

Ifølge nævnte litteratursted vil hydrolysehastigheden for L-a-amino-syreamidet med den almene formel R-CHiNHj) -CO-NH2 afhænge af naturen af gruppen R. Af tabel 20-14 og side 1779 i nævnte værk vil det ses, at ved indføring af en phenylgruppe i R-gruppen sker der en stigning i hydrolysehastigheden.

En meget kraftigere tendens kan imidlertid ses af formindskelsen af hydrolysehastigheden ved et formindsket antal methylengrupper i R i de phenylsubstituerende L-a-aminosyreamider. Betragtninger på grundlag af regler for homologe rækker ved ekstrapolation af hydrolysehastigheden startende fra γ-phenyl-a-smørsyreamid via phenylalanin= amid til phenylglycinamid ville føre til en forventning om en meget lav hydrolysehastighed for sidstnævnte forbindelse.

Det har nu overraskende vist sig, at L-phenylglycin og D-phenylglycin= amid eller D-phenylglycin kan fremstilles ved selektiv enzymatisk hydrolyse af racemisk phenylglycinamid, og fremgangsmåden ifølge opfindelsen er ejendommelig ved, at DL-phenylglycinamid selektivt hydrolyseres med en egnet aminopeptidase ved en pH-værdi på 7-9,5 og ved en temperatur på 20-40°C, og at D-phenylglycinamid og L-phenylglycin isoleres på sædvanlig måde, idet separeret D-phenylglycinamid om ønsket hydrolyseres ved opvarmning med en vandig opløsning af en stærk syre til dannelse af D-phenylglycin.

Isoleringen af D-phenylglycinamid og L-phenylglycin kan udføres ved hjælp af en hvilken som helst konventionel teknik.

Aminopeptidasen kan benyttes i fri eller i vand-uopløselig tilstand, f.eks. covalent bundet til en uopløselig bærer.

3 148018

Pet foretrukne enzym er leucinaminopeptidase (enzymregistrerings-nummer 3.4.1.1), der bevirker særdeles stereospecifik hydrolyse af det racemiske amid på kort tid.

Egnede leucinaminopeptidaser kan fremstilles ud fra f.eks. koøjne og svinenyrer.

Omsætningen kan udføres under konventionelle betingelser, således som beskrevet i bl.a. Dixon & Webb, "Enzymes", side 247 (1965) for hydrolyse af andre racemiske aminosyreamider ved hjælp af aminopeptidase.

Omsætningen kan gennemføres i nærværelse af aktiverende forbindelser, såsom mangansalte og magnesiumsalte.

Forarbejdningsmetoden til isolering af hydrolyseprodukterne D-phenyl= glycinamid og L-phenylglycin er uafhængig af, om der gøres brug af fri aminopeptidase eller vanduopløselig aminopeptidase. Eftersom L-phenylglycin er i ringe grad opløseligt i vand, må processen udføres i fortyndede opløsninger, når der benyttes uopløseligt enzym, med henblik på at undgå krystallisation af L-phenylglycin på det uopløselige enzym. Ved begge udførelsesformer af fremgangsmåden kan L-phenylglycin separeres fra D-phenylglycinamidet ved ekstraktion, krystallisation eller ved hjælp af en eller flere ionbytterharpikser.

Udgangsproduktet for fremgangsmåden ifølge opfindelsen kan fremstilles ud fra aminonitrilet af phenylglycin på en kendt måde ved sur hydrolyse til dannelse af DL-phenylglycinamidsalt, hvorfra DL-phenylglycin= amidet kan opnås ved behandling med en ækvivalent mængde base.

Det ved den enzymatiske hydrolyse opnåede D-phenylglycinamid kan uden racemisering om ønsket hydrolyseres til D-phenylglycinsaltet ved opvarmning af amidet med en vandig opløsning af en stærk syre, såsom svovlsyre, saltsyre, benzensulfonsyre eller toluensulfonsyre. Dette salt kan behandles med ammoniak, hvorefter D-phenylglycinet krystalliserer i den fri form.

D-phenylglycin benyttes blandt andet som udgangsmateriale ved fremstilling af α-aminobenzylpenicillin. L-phenylglycin benyttes f.eks. som udgangsmateriale for L-asparågin-L-phenylglycinmethylester (et sødemiddel).

4 148018

Opfindelsen belyses nærmere i de følgende eksempler.

Eksempel 1 3,0 mmol (560 mg) DL-phenylglycinamid,HCl opløses ved stuetemperatur i 52,0 ml af en pufferopløsning (borsyre-kaliumchlorid-natrium= hydroxid) ved pH 9,0 i en reaktionsbeholder udstyret med en omrører. Efter tilsætning af 2,2 ml 0,125 M MgCl2 og 0,lml 0,025 M MnCl2 indstilles pH-værdien på 8,5 ved hjælp af 2,0 ml ca. 1 N natriumhydroxid. Derpå sættes 0,4 mg leucinaminopeptidase (80 mg Merck 25010 enzymsuspension; fra svinenyrer) til denne opløsning, og der omrøres ved stuetemperatur og et pH på 8,5 i 1½ time.

En tyndtlagkromatografisk analyse viser, at L-phenylglycinamidet er blevet fuldstændig hydrolyseret til I-phenylglycin. Efter en reaktionstid på 20 timer yderligere indeholder reaktionsblandingen ifølge en aminosyreanalyse: 0,40 vægt$ I-phenylglycin (effektivitet = 100$) og 0,39 vægt$ D-phenylglycinamid (udbytte = 99,5).

. Eksempel 2

En opløsning af 32,3 mmol (6,0 g) DI-phenylglycinamid,HCl, 300 mg MgCl2 og 1 mg MhClg i 80 ml vand indstilles på pH-værdien 8,1 ved hjælp af 25 ml af en ca. IN natriumhydroxid i en reaktionsbeholder udstyret med omrører. Efter tilsætning af 1,5 mg leucinaminopeptidase (300 mg Merck 25010 enzymsuspension) til denne klare opløsning, omrøres denne ved stuetemperatur i 4 timer. Under omsætningen styres reaktionsblandingens pH-værdi til en værdi mellem 8,1 og 9,1 ved hjælp af ca. IN saltsyre og en autotitrator. Efter dette tidsrum indstilles pH-værdien på 6,5 ved hjælp af saltsyre, og reaktionsblandingen koncentreres derpå til et volumen på 50 ml ved inddampning (30°C, 12 mm Hg). Det krystalliserede I-phenylglycin isoleres ved filtrering. Udbyttet af I-phenylglycin er 2,0 g (effektivitet = 83,3$).

Specifik drejning for dette I-phenylglycin: [a]jp = +156° (2,6 vægt$ HC1; C =1,6).

Reference: Beilstein 14 III p. 1188 [oc]g5 = +157,5° (2,6 vægt $ HC1; C = 1,6).

Selektivitet: $ I-phenylglycin = 99,5.

5 148018 50 ml koncentreret saltsyre sættes til filtratet, og D-phenylglycin= amid,HCl, som derpå krystalliserer, isoleres også ved filtrering.

Udbyttet af D-phenylglycinamid,HCl er 2,5 g (effektivitet 83,6$).

Den molære drejning for D-phenylglycinamid,HCl: [M]^° = -186,5° (vand; C = 0,8).

Reference: Beilstein 14 III p. 1189 [M]p° = -188 (vand; C = 0,8).

Selektivitet: $ D-phenylglycinamid,HCl = 99,5.

En opløsning af det resulterende D-phenylglycinamid,HCl i 20 ml 6N saltsyre koges i 1½ time. Efter inddampning til tørhed af reaktionsblandingen optages inddampningsresten i 20 ml vand. En tyndtlags-kromatografisk analyse af denne opløsning viser, at D-phenylglycin= amidet er fuldstændig omdannet til D-phenylglycin. Opløsningens pH-værdi indstilles på 6,5 ved hjælp af koncentreret ammoniak, og det krystalliserede D-phenylglycin filtreres gennem et glasfilter og vaskes på filteret med 5 ml vand.

Udbyttet af D-phenylglycin er 0,35 g (effektivitet = 81$). Specifik drejning for dette D-phenylglycin: [a]j*° = -147° (C = 0,6; 2N HCl);

Reference; Beilstein 14 III p. 1187 [α]β° = -153° ( C = 0,6; 2N HCl).

Selektivitet: $ D-phenylglycin = 98.

Eksempel 3

En opløsning af 5,0 mmol (930 mg) DI-phenylglycinamid,HCl, 50 mg MgClg og ca. 0,2 mg MhClg i 100 ml vand indstilles på pH-værdien 8,0 ved hjælp af IN natriumhydroxid. Efter at der til denne opløsning er tilsat 250 mg leucinaminopeptidase (Merck 25010), som er kovalent bundet til 3-amino-propyl-triethoxysilylbio-glas i en mængde på 0,3 vægt$, opnået som beskrevet i "Biotechnology and Bioengineering", bind XVI, side 275-77, 1974, blev opløsningen omrørt ved stuetemperatur i 18 timer.

148018 6

Efter frafiltrering af den til glaspulver bundne leucinaminopepti= ' dase underkastes filtratet en tyndtlagkromatografisk undersøgelse. Denne viste, at Dl-phenylglycinamidet var omdannet til.ækvimolsere mængder 1-phenylglycin og D-phenylglycinamid ved hjælp af til glas kovalent bundet leucinaminopeptidase.

Filtratet indstilles på pH-værdien 10,0 med IN NaOH og føres gennem 100 g ""Amber li te" ® 1.R.C.-50-ionbytter i H+-formen. Derpå føres 100 ml vand gennem ionbytteren, eluatet inddampes til et volumen på 15 ml i vakuum, og 1-phenylglycinet isoleres ved filtrering. Udbyttet af 1- . phenylglycin, som ifølge tyndtlagskromatografi er rent, andrager 0,34 g (effektivitet 90%).

Specifik drejning for dette 1-phenylglycin: [cc]£5 = +157° (2,6 vægt$ HCl; C = 1,6)

Reference: Beilstein 14 III, p. 1188: [cc]g5 = +157,5°(2,6 vægt$ HCl; C = 1,6).

Selektivitet: $ I-phenylglycin = 99,8$.

Det til "Amberlite" ®I.R.C.-50 bundne D-phenylglycinamid elueres med 150 ml 0,5N svovlsyre. Eluatet koncentreres til 10 ml ved ind-dampning i vakuum og koges derpå i 1 time. Efter køling og neutralisation med koncentreret vandig ammoniak frafiltreres det krystalliserede D-phenylglycin over et glasfilter og vaskes på filteret med 5 ml vand. Udbyttet af D-phenylglycin andrager 0,33 g (effektivitet 90$). Specifik drejning fundet: [a]p5 = -152°(C = 0,6; 2N HCl)

Reference: Beilstein 14 III, p. 1187: [a]^5 = -153°(C = 0,6; 2N HCl).

Selektivitet: $ D-phenylglycin = 99,2$.

Eksempel 4 0,5 mg leucinaminopeptidase (Serva 27717; fra okseøjne) sættes til en opløsning af 1,62 mmol (0,3 g) DI-phenylglycinamid,HCl, 12 mg MgClg og 0,3 mg MhCl2 i 35,0 ml pufferopløsning (borsyre-kaliumchlo=