CH621769A5

CH621769A5 -

Info

Publication number: CH621769A5
Application number: CH771575A
Authority: CH
Inventors: Wilhelmus Hubertus Jos Boesten
Original assignee: Stamicarbon
Priority date: 1974-06-14
Filing date: 1975-06-13
Publication date: 1981-02-27
Also published as: JPS519786A; FR2274582B1; NL181508C; DK148018C; CA1052716A; JPS582676B2; DK148018B; ES438524A1; NL7407941A; DE2526594A1; BE830148A; NL181508B; SE431746B; US3971700A; GB1503583A; DK269175A; FR2274582A1; HU170333B; DE2526594C2

Description

Die vorliegende Erfindung betrifft ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von D-Phenylglycinamid und L-Phenylglycin durch Spaltung von DL-Phenylglycinamid.

Racemisches Phenylglycin lässt sich in seine optisch aktiven Antipoden mit Hilfe konventioneller Verfahren spalten, die eine Salzbildung des Phenylglycins oder eines Derivates oder Vorproduktes desselben mit Hilfe einer Säure sowie eine selektive Kristallisation oder ein anderes Trennverfahren umfassen.

Aufgabe der vorliegenden Erfindung ist es, ein Verfahren zur Zerlegung von racemischem Phenylglycinamid, vorzugsweise über eine selektive enzymatische Hydrolyse, zu finden.

Bekanntermassen lassen sich Aminosäureamide mit Hilfe eines Enzyms selektiv hydrolysieren. Aromatische Aminosäureamide, wie Phenylalaninamid, können im allgemeinen durch die Wirkung von Enzymen, wie Papain, Bromelain oder Phy-sin, hydrolysiert werden. Es wurde nun gefunden, dass diese Enzyme keine Hydrolyse von Phenylglycinamid herbeiführen.

Es wurde nun ein Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von D-Phenylglycinamid und L-Phenylglycin gefunden, bei dem von racemischem Phenylglycinamid ausgegangen wird und das dadurch gekennzeichnet ist, dass man DL-Phenylglycinamid mit einer dazu geeigneten Aminopeptidase hydrolysiert. Aus dem Gemisch kann das D-Phenylglycinamid und/oder L-Phenylglycin gewünschtenfalls isoliert werden. Diese Isolation kann mit jeder zweckmässigen konventionellen Methode durchgeführt werden.

Ob eine bestimmte Aminopeptidase geeignet ist oder nicht lässt sich leicht anhand der in den Beispielen dargestellten Technik feststellen.

Das bevorzugte Enzym ist Leucinaminopeptidase (Enzyme Commission Number 3.4.1.1.), das in kurzer Zeit eine stark stereospezifische Hydrolyse des racemischen Amids herbeiführt.

Die Reaktion kann unter bisher üblichen Bedingungen stattfinden, wie erwähnt z. B. in Dixon & Webb 'Enzymes' Seite 247 (1965) für die Hydrolyse anderer racemischer Aminosäureamide mit Hilfe von Aminopeptidase-Enzyme. Die Temperatur wird vorzugsweise auf 20-40°C gehalten und die Reaktion findet vorzugsweise in einer gepufferten wässerigen Lösung bei einem pH zwischen etwa 7 und 9.5 statt. Es können aktivierende Verbindungen wie Mangansalze und Magnesiumsalze eingemischt werden.

Das Aufarbeitungsverfahren zur Isolierung der Reaktionsprodukte D-Phenylglycinamid und L-Phenylglycin ist unabhängig von einer etwaigen Anwendung freier Aminopeptidase oder wasserunlöslicher Aminopeptidase. Da L-Phenylglycin schlecht wasserlöslich ist, wird man bei einem unlöslichen Enzym mit verdünnten Lösungen arbeiten müssen, um eine Kristallisation von L-Phenylglycin auf dem unlöslichen Enzym zu vermeiden. Bei beiden Ausführungsformen kann man das L-Phenylglycin mittels Extraktion, Kristallisation oder mit Hilfe von einem oder mehreren Ionenaustauschern trennen.

Das L-Phenylglycin kann als solches oder aber nach Racemi-sierung abgelassen werden. DL-Phenylglycin kann mit Hilfe einer Säure und eines Alkohols in das Salz von Phenylglycinal-kylester umgesetzt werden, aus dem durch eine Behandlung mit Ammoniak DL-Phenylglycinamid erhalten wird, das wieder in den Prozessgang zurückgeführt werden kann.

Das Ausgangsprodukt für das erfindungsgemässe Verfahren lässt sich auf bekannte Weise aus dem Aminonitril von Phenylglycin durch saure Hydrolyse zu DL-Phenylglycinamidsalz herstellen, aus dem durch eine Behandlung mit einer äquivalenten Basenmenge das DL-Phenylglycinamid gewonnen wird.

Das bei der Aufarbeitung anfallende D-Phenylglycinamid kann mit einer Säure ohne Racemisierung zu D-Phenylglycin-salz hydrolysiert werden, indem man das Amid mit einer wässerigen Lösung einer starken Säure, wie Schwefelsäure, Salz-saure, Benzolsulfonsäure oder Toluolsulfonsäure erhitzt.

Dieses Salz kann mit Ammoniak behandelt werden, wonach D-Phenylglycin in freier Form auskristallisiert. Das erfindungs-gemäss erhaltene Gemisch kann auch zur Herstellung von D-Phenylglycin verwendet werden, indem nach Isolierung von D-Phenylglycinamid dieses Amid zu D-Phenylglycin oder einem sauren Additionssalz desselben hydrolysiert wird.

D-Phenylglycin dient u.a. als Ausgangsstoff für die Herstellung von a-Aminobenzylpenicillin. L-Phenylglycin ist z.B. ein Ausgangsstoff für L-Asparagin-L-phenylglycinmethylester (Süssstoff).

Die Aminopeptidase kann in freier oder unlöslicher Form, etwa covalent an einen unlöslichen Träger gebunden, verwendet werden.

Das erfindungsgemässe Verfahren wird anhand der nachstehenden Beispiele näher erläutert, ohne sich allerdings auf diese Beispiele zu beschränken.

Beispiel 1

In einem mit einem Rührwerk versehenen Reaktionsgefäss werden bei Zimmertemperatur 3,0 mgMol (560 mg) DL-Phenylglycinamid. HCl in 52,0 ml Pufferlösung (Borsäure-Kaliumchlorid-Natronlauge) mit einem pH von 9,0 gelöst.

Nach Zusatz von 2,2 ml 0,125 Mol MgCb und 0,1 ml 0,025 Mol MnClz wird der pH mit Hilfe von 20 ml ca. 1 n Natronlauge auf einen Wert von 8,5 eingestellt. Anschliessend werden dieser Lösung 0,4 mg Leucinaminopeptidase (80 mg Enzymsuspension Merck 25010, hergestellt aus Schweinsnieren) beigegeben und wird das Gemisch 1,5 Stunden bei Zimmertemperatur und einem pH von 8,5 gerührt.

Eine dünnschichtchromatographische Untersuchung weist aus, dass das L-Phenylglycinamid völlig zu L-Phenylglycin hydrolysiert worden ist. Nach einer Reaktionszeit von weiteren 20 Stunden enthält das Reaktionsgemisch gemäss einer Ami-nosäureanalyse 0,40 Gew.-% L-Phenylglycin (Ausbeute 100%) und 0,39 Gew.-% D-Phenylglycinamid (Ausbeute 99,5%).

Beispiel 2

In einem mit einem Rührwerk versehenen Reaktionsgefäss wird eine Lösung von 32,3 mgMol (6,0 g) Dl-Phenylglycinamid. HCl, 300 mg MgCk und 1 mg MnCb in 80 ml Wasser mit Hilfe von 25 ml ca. 1 n Natronlauge auf ein pH von 8,1 gebracht. Nach Zusatz von 1,5 mg Leucinaminopeptidase (300 mg Enzymsuspension Merck 25010) zu dieser klaren

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Lösung wird 4 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Das pH des Reaktionsgemisches wird während der Reaktion mit Hilfe von ca. 1 n Salzsäure und einem Autotitrierapparat auf einem Wert zwischen 8,1 und 9,1 gehalten. Nach dieser Zeit wird mit Salzsäure auf ein pH von 6,5 angesäuert; anschliessend wird das Reaktionsgemisch auf eine Menge von 50 ml eingedampft (30°C; 12 mm Hg). Mittels Filtration wird das auskristallisierte L-Phenylglycin isoliert. Es fallen 2,0 g L-Phenylglycin an (Ausbeute 83,3%).

Spezifische Drehung von L-Phenylglycin:

[a]»= +156° (2,6 Gew.-% HCl; c= 1,6).

Literatur: Beilstein 14 III, Seite 1188:

[a]»= +157,5° (2,6 Gew.-% HCl; c= 1,6).

Selektivität: 99,5 % L-Phenylglycin.

Dem Filtrat werden bei 10°C 50 ml konzentrierte Salzsäure beigegeben; das dadurch auskristallisierte D-Phenylglycinamid. HCl wird ebenfalls mittels Filtration isoliert.

Es fallen 2,5 g D-Phenylglycinamid • HCl an (Ausbeute 83,6%). Molare Drehung von D-Phenylglycinamid • HCl:

[M]g> = -186,5° (Wasser; c = 0,8);

Literatur: Beilstein 14 III, Seite 1189:

[M]2o = -188° (Wasser; c = 0,8).

Selektivität: 99,5 % D-Phenylglycinamid • HCl.

Eine Lösung von 500 mg des erhaltenen D-Phenylglycin-amid • HCl in 20 ml 6 n Salzsäure wird IV2 Stunden gesiedet. Nach Eindampf ung des Reaktionsgemisches bis zur Trockne wird der Eindampfrückstand in 20 ml Wasser gelöst. Eine dünnschichtchromatographische Untersuchung dieser Lösung zeigt, dass das D-Phenylglycinamid völlig in D-Phenylglycin umgesetzt wurde. Das pH der Lösung wird mit Hilfe von konzentriertem Ammoniak auf einen Wert von 6,5 eingestellt; das auskristallisierte D-Phenylglycin wird mit Hilfe eines Glasfilters filtriert und auf dem Filter mit 5 ml Wasser gewaschen. Es fallen 0,35 g D-Phenylglycin an (Ausbeute 81%).

Spezifische Drehung dieses D-Phenylglycins:

[ct]g> = -147° (c = 0,6; 2 n HCl);

Literatur: Beilstein 14 III, Seite 1187:

[aß0 = -153° (c = 0,6; 2 n HCl).

Selektivität: 98% D-Phenylglycin.

Beispiel 3

Eine Lösung von 5,0 mgMol (930 mg) DL-Phenylglycinamid • HCL, 50 mg MgCk und etwa 0,2 mg MnCk in 100 ml Wasser wird mit 1 n Natronlauge auf einem pH von 8,0 eingestellt. Nach Beigabe von 250 mg covalent an 3-Aminopropyl-triethoxysilyl Bio-Glass gebundener Leucinaminopeptidase (Merck 25010) mit einem Beladungsgrad von 0,3 Gew.-%, erhalten wie beschrieben in Biotechnology and Bioengineering Vol. XVI, Seite 275-77,1974, zu dieser Lösung, wird 18 Stunden lang bei Zimmertemperatur gerührt. Nach Fütration der an Glaspulver gebundenen Leucinaminopeptidase wird das

Filtrat einer dünnschichtchromatographischen Untersuchung unterzogen. Es zeigt sich dabei, dass das DL-Phenylglycinamid durch die covalent an Glas gebundene Leucinaminopeptidase in äquimolekulare Mengen L-Phenylglycin und D-Phenylglycinamid umgesetzt wird.

Das Filtrat wird mit 1 n NaOH auf einem pH-Wert von 10,0 eingestellt und anschliessend über 100 g Amberlite I.R.C.-50 Ionenaustauscher in der H+-Form hinübergeführt.

Nach Hinüberleiten von 100 ml Wasser über den Ionenaustauscher wird das Eluat unter Vakuum auf eine Menge von 15 ml eingedampft und wird das L-Phenylglycin mittels Fütration isoliert. Es fallen 0,34 g dünnschichtchromatographisch reines L-Phenylglycin an (Ausbeute 90%).

Spezifische Drehung L-Phenylglycin:

[a]M= + 157° (2,6 Gew.-% HCl; c= 1,6);

Literatur: Beilstein JW III, Seite 1188:

[aß5 = +157,5 (2,6 Gew.-% HCl; c = 1,6).

Selektivität: 99,8% L-Phenylglycin.

Das an das Amberlite I.R.C.-50 gebundene D"Phenylglycinamid wird mit Hilfe von 150 ml 0,5 n Schwefelsäure eluiert. Das Eluat wird unter Vakuum auf 10 ml eingedampft und anschliessend eine Stunde lang gesiedet. Nach Abkühlung und Neutralisation mit konzentriertem wässerigem Ammoniak wird das auskristallisierte D-Phenylglycin mit Hilfe eines Glasfilters filtriert und auf dem Füter mit 5 ml Wasser gewaschen. Es fallen 0,33 g D-Phenylglycin an (Ausbeute 90%).

Gefundene spezifische Drehung:

[a]« = -152° (c = 0,6; 2 n HCl);

Literatur: Beilstein 14 III, Seite 1187:

[et]« = -153° (c = 0,6; 2 n HCl).

Selektivität: 99,2% D-Phenylglycin.

Beispiel 4

In einem mit einem Rührwerk versehenen Reaktionsgefäss werden einer Lösung von 1,62 mgMol (0,3 g) DL-Phenylglycinamid ■ HCl, 12 mg MgCk und 0,3 mg MnCk in 35,0 ml Pufferlösung (Borsäure-Kaliumchlorid-Natronlauge) unter ständigem Rühren bei Zimmertemperatur und einem pH von 8,1 0,5 mg Leucinaminopeptidase (Serva 27717; hergestellt aus Rinderaugen) beigegeben. Das pH des Reaktionsgemisches steigt innerhalb von 15 Minuten auf einen Wert von 8,6 an und bleibt dann konstant. Eine dünnschichtchromatographische Untersuchung hat ausgewiesen, dass das Reaktionsgemisch nach 45 Minuten bzw. nach 4 Stunden aus äquimolekularen Mengen L-Phenylglycin und D-Phenylglycinamid besteht. Eine Aminosäureanalyse, ausgeführt nach einer Reaktionszeit von 6 Stunden, zeigt das gleiche Resultat, nämlich: 0,35 Gew.-% L-Phenylglycin (Ausbeute 100%);

0,34 Gew.-% D-Phenylglycinamid (Ausbeute 99%).

Beispiel 5

Eine Menge von 1,6 mgMol (0,3 g) DL-Phenylglycinamid • HCl wird bei einem pH von 7,0 in 30 ml einer Pufferlösung (Borsäure-Kaliumchlorid-Natriumhydroxyd) gelöst. Nach Beigabe von 1,0 ml einer 0,125 molaren MgCk-Lösung und von 0,1 ml einer 0,025 molaren MnCb-Lösung werden 0,8 mg s

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Aminopeptidase M (Enzyme Commission Number 3.4.11.2 'particle bound' Aminopeptidase aus Schweinsnieren, hergestellt von Sigma, Nummer A-7761) zugesetzt. Das pH wurde auf einem Wert von 7,1 eingestellt und das Gemisch 21 Stunden lang gerührt. Während dieser Zeit steigt das pH nach und nach auf einen Wert von 7,45 an. Es werden Proben des Reaktionsgemisches mittels Dünnschichtchromatographie analysiert. Nach 2 Stunden besteht das Aminosäuregemisch zu 3 Mol.-% aus Phenylglycin und nach 20 Stunden zu 50 Mol. %

aus Phenylglycin.

Die Rührbehandlung wird fortgeführt. Eine Analyse der Aminosäure zeigt, dass diese nach 24 Stunden zu 0,34 Gew.-% aus Phenylglycin und zu 0,40 Gew.-% aus Phenylglycin-5 amid und nach 100 Stunden zu 0,45 Gew.-% aus Phenylglycin und zu 0,35 Gew.-% aus Phenylglycinamid besteht. Dieses Enzym ist also, obwohl nicht ungeeignet, von geringerem Wert als die in den vorangehenden Beispielen benutzte Leucinaminopeptidase.

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Claims

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1. Verfahren zur Herstellung eines Gemisches von D-Phe-nylglycinamid und L-Phenylglycin, dadurch gekennzeichnet, dass man DL-Phenylglycinamid mit einer dazu geeigneten Aminopeptidase hydrolysiert.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man als Aminopeptidase Leucinaminopeptidase verwendet.

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PATENTANSPRÜCHE

3. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die enzymatische Hydrolyse bei einem pH-Wert zwischen 7 und 9,5 und bei einer Temperatur zwischen 20 und 40°C ausführt.

4. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, dass man die Aminopeptidase in unlöslicher Form verwendet.

5. Gemisch von D-Phenylglycinamid und L-Phenylglycin, erhalten nach dem Verfahren gemäss Anspruch 1.

6. Verwendung des Gemisches nach Anspruch 5 zur Herstellung von D-Phenylglycin, dadurch gekennzeichnet, dass man das D-Phenylglycinamid abtrennt und zu D-Phenylglycin hydrolysiert.