DE2155042A1

DE2155042A1 - Verfahren zur enzymatischen Herstellung halbsynthetischer Penicilline

Info

Publication number: DE2155042A1
Application number: DE19712155042
Authority: DE
Inventors: Eupremio; Guerra Guido; Bologna Vitale (Italien). C07d 99-14
Original assignee: Alfa Farmaceutici S.P.A., Bologna (Italien)
Priority date: 1970-11-07
Filing date: 1971-11-05
Publication date: 1972-05-10
Also published as: ES396745A1; NL7115258A; ZA717343B; FR2140982A5; GB1315424A; US3766009A; BR7107433D0; JPS5622518B1

Description

Alfa farmaceutici S.p.A., Via Ragazzi del »99, η. 5, Bologna /Italien

"Verfahren zur enzymatisch^η Herstellung halbsynthetischer Penicilline¹¹

Die vorliegende Erfindung bezieht sich auf ein neues enzymatisches Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Penicilline, insbesondere halbsynthetischer Penicilline der allgemeinen Formel I :

CO

-HH

CH C

I I CO N

CH, -CH,

CH-COOH

(D

209820/1158

Dabei steht R für einen Rest aus der Gruppe £X-Amino-Benzyl, £X-Carboxybenzyl, 2 oder 3 Thienylmenthyl, 2 oder 3 Thienylaminomenthyl oder eine Isoxazolgruppe der allgemeinen Formelί

σ ρ

ι ϊ

wobei R₁ eine Phenylgruppe oder ein 2-Chlorophenyl oder 2,6-Dichlorophenyl ist;

R kann auch eine Gruppe der allgemeinen Formel

^R2 ^R4
C

darstellen. Dabei bedeutet:

Rp eine Aryl-, Aryloxyl-, Arylmercaptyl-Gruppe (eventuell durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert);

R, Wasserstoff oder eine (C₁ - G₁₀) Alkylgruppe, (C₁ - C₁₀) Alkoxylgruppe, Aminogruppe, (G₁ - C₆) Monoalkyl-Aminogruppe, (C₁ - C₆) Dialkyl-Aminogruppe,

209820/1158

Carboxylgruppe, (C₁ - Cg) Carboxylalkylgruppe, Carboxymethylacetoxylgruppe, Carboxybenzylgruppe und, als Spezialfall, können R« und R, auch gemeinsam zu einem ^G5 " ^G7 ^cy^cl°^aliP^iaa^^isclien Ring gehören;

R, Wasserstoff, oder, im Spezialfall, in dem Rg und R, gemeinsam einen Cc - Cy-cycloaliphatischen Ring bilden, eine Aminogruppe, eine C₁ - Cg) Monoalkylaminogruppe oder eine C^ - Cg) Dialkylaminogruppe.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich darüberhinaus auf die Herstellung nicht toxischer Salze und Ester der halbsynthetischen Penicilline der Formel (I). Die nicht toxischen Salze umfassen die Salze mit Natrium, Kalium, Kalzium, Magnesium, Aluminium, Ammonium und substituierten Ammonium sowie mit nicht toxischen Aminen, z.B. Triethylamin, Procain, Dibenzylamin, N-Benzyl-ß-Phenyläthylamin, Ν,Ν'-Dibenzyläthylendiamin, N-Alkylpiperidin und andere Amine, welche gewöhnlich zur Bildung von Salzen mit Benzylpenicillin verwendet werden.

Unterden nicht toxischen Estern halbsynthetischer Penicilline mit der allgemeinen Formel (I) sind zu erwähnen: (Cj - Cg) Alkyl, (₁ - Cq) Alcoxylmethyl,

209820/1158

p-Methoxybenzyl, p-Nitrobenzyl, Benzyhydryl, Phenacyl, p-Bromphenacyl, Trimethylsilyl, Benzyl.

Die vorliegende Erfindung bezieht sich speziell auf ein enzymatisches Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Penicilline der oben angegebenen Formel (1), oder ihrer nicht toxischen Salze oder Eater, dadurch gekennzeichnet, daß das Verfahren die enzymatisch^ Dephenylacetylierung ψ von Diacylpenicillinen der allgemeinen Formel (II):

\\ CHj₅ CO .S.

N CH CH V^Z^rJ* (II)

/ \ I ³

CO ^x CO N « CH COOH

umfaßt, wobei R die gleiche Bedeutung hat wie bereits weiter oben beschrieben worden ist. Die Dephenylacetylierung erfolgt dabei in wässrigem Medium bei Temperaturen zwischen 20⁰C und 50°C, vorzugsweise zwischen 30⁰C und 42⁰C, und einem alkalischen pH-Wert, vorzugsweise zwischen pH 7,1 und 8,5.

Gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt die enzymatisch^ Dephenylacetylierung von Diacylpenicillinen der allgemeinen Formel (II) durch das Ensympenicillin-Acylase, welches von verschiedenen Mikroorganismen erzeugt wird. Die Herstellung der halbsynthetischen Penicilline der Formel (I) erfolgte bisher durch chemische Acylierung von 6-Amino-Penicillinsäure.

209820/11 P 8

Für diese Reaktion wurden verschiedene reaktive Derivate von Karboxylsäuren verwendet, z.B. Säureehloride, Anhydride oder Anhydride, die aus der entsprechenden freien Oarboxylsäure und 6-Amino-Penicillinsäure bei Anwesenheit eines Kondensationsmittels, beispielsweise Dicyelohexylzyanamid, gebildet werden. Die zu verwendende 6-Amino-Penicillinsäure wurde mit Hilfe mikrobiologischer Hydrolyse von Benzylpenicillin bereitet. Diese Verfahren sind in der wissenschaftlichen Literatur ausführlich beschrieben.

In der belgischen Patentschrift 738 110 ist ein Verfahren beschrieben, welches ausschließlich die Herstellung von Isoxazol-Penicillinen betrifft, wobei diese Penicilline, ausgehend direkt vom Benzylpenicillin, durch eine Folge chemischer Reaktionen erhalten werden. Dieses Verfahren umfaßt:

1. Schützung des Benzylpenicillins durch Veresterung.

2. Herstellung eines Iminochlorids des geschützten Benzylpenicillins.

3. Reaktion dieses Iminochlorids mit einem alkalischen Salz der benötigten Isoxazolsäure, um geschützte Diacylpenicilline zu erhalten.

209820/1158

4. Chemische Dephenylacetylierung durch Reaktion dieses Produkts mit einem primären Amin.

5. Entfernung der Schutzgruppe um das Isoacazolpenicillin zu erhalten.

Dieses Verfahren unterliegt schwerwiegenden Einschränkungen. So kann es nur für die Herstellung von Isoxazol-Penieillinen * verwendet werden, da die Dephenylacetylierung durch chemische Reaktion mit primären Aminen infolge sterischer Hinderungen des Isoxazol-Restes nur in diesen begrenzten fällen möglich ist. Darüberhinaus beobachtet man während der chemischen Dephenylacetylierung eine beträchtliche Epimerisation in Stellung 6 des Penioillinmoleküls, was einen teilweisen Verlust der antimikrobischen Wirkung zur Folge hat. Aus diesem Grund können andere halbsynthetische Penicilline, die therapeutisch oder kommerziell interessant sind, mit Hilfe dieses Verfahrens nicht hergestellt werden.

Die Anmelderin hat nun gefunden, daß die Diacylpenicilline gemäß Formel (II) leicht bei hohen Ausbeuten dephenylacetyliert werden können, ohne daß eine Epimerisierung in Position 6 des Penicillinkerns auftritt, wenn man eine enzymatische Hydrolyse mit dem Enzym Penicillin-Acylase durchführt, welches eine hohe spezifische Wirksamkeit bezüglich der Phenacetylgruppe aufweist, lieben der Tatsache, daß die

209820/1 168

vorliegende Erfindung sehr vielseitig anwendbar ist und die Herstellung einer großen Zahl halbsynthetischer Penicilline ermöglicht, hat das erfindungsgemäße Verfahren den Vorteil, daß durch die milde Behandlung bei der enzymatischen Dephenylacetylierung keine Epimerisationserscheinungen des Wasserstoffs am Kohlenstoffatom in Stellung 6 eines Penicillinmoleküls auftreten, wie diese oft bei chemischen Methoden zu beobachten sind.

Die Herstellung halbsynthetischer Penicilline gemäß der vorliegenden Erfindung erfolgt bei Anwesenheit von Penicillin-Acylase oder enzymatischer Präparate irgendeiner solche Enzyme enthaltenden Quelle.

üir die enzymatische Herstellung halbsynthetischen Penicillins der allgemeinen Formel (I) können Penicillin-Acylase produzierende Mikroorganismen verwendet werden, die in der Lage sind, die Amidgruppe in Stellung 6 des Benzylpenicillinmolelnils unter Bildung von 6-Amino-Penicillinsäure anzugreifen. Diese Eigenschaft kann dadurch erkannt werden, daß solche Mikroorganismen in der Lage sind, Penicillin G zu wenigstens 20 # innerhalb 24 Stunden bei 38⁰G zu inaktivieren, wobei sich eine Lösung ergibt, in welcher das Penicillin

209820/1158

G zumindest teilweise durch Zufügung von Phenaeetylchlorid reaktiviert werden kann. Diese Mikroorganismen enthalten Schimmelpilze, Hefen und Bakterien und können aus folgenden Gattungen ausgewählt werden: Alternatia, Aspergillus, Botritis, Gephalosporium, Oryptococcus, Emericellopsis, Eipcoccum, Epiolermophyton, Fusarium, Mucor, Penicillum Phoma, Trichoderma, Trichophyton, Trichosporon, Streptomyces, Aerobacter, Alcaligenes, Bordetella, Cellulomonas, Gorynebacterium, Erwinia, Escherichia, Flavobacterium, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Xantomonas, Torulopsis, Ehodotorula, Arthrobaeter.

Diese Mikroorganismen können zur enzymatischen Synthese von Penicillin der Formel (I)gemäß der vorliegenden Erfindung entweder in Form von Zellen aus Kulturmedien oder als azetonische Puder, oder als an inerten Trägern absorbierte Zellen oder schließlich in Form zellularer Extrakte (enzymatische Herstellung) verwendet werden. In Weiterbildung der Erfindung ist es dafcei vorteilhaft, jedoch nicht wesentlich, als Enzymlieferanten speziell ausgewählte Mikrobenstämme zu verwenden, die durch Mutationen und aufeinanderfolgende Passagen resistent gegenüber hohen Konzentrationen von Phenylessigsäure (1000-3000_r.y/ml) gemacht worden sind und so in der Lage sind, große Mengen des Enzyms Penicillin-Acylase zu produzieren.

209820/1158

Das enzymatische Verfahren zur Herstellung von Penicillinen der allgemeinen Formel (i) besteht somit in der Dephenylacetylierung von Diacylpenicillinen der Formel (II) durch enzymatische Hydrolyse in Anwesenheit von Penioillin-Acylase produzierenden Mikroorganismen, oder einem enzymatischen Präparat, welches Penicillin-Aoylase enthält, bei einer Temperatur, bei der sowohl die Stabilität des enzymatischen Systems als auch des Penicillinmoleküls gewahrt ist. Diese Temperaturen liegen zwischen 2O⁰O und 50⁰O, vorzugsweise zwischen 30⁰G und 42⁰O.

Wie jeder enzymatische Prozess, ist auch die enzymatische Dephenylacetylierung von Diacylpenicillinen der Formel (II) empfindlich auf Veränderungen des pH-Wertes. Um halbsynthetische Penicilline zu erhalten, erfolgt gemäß der vorliegenden Erfindung die Dephenylacetylierung in einem pH-Bereich zwischen 7,1 und 8,5, vorzugsweise zwischen 7,5 und 8,0.

Die Menge an Diacylpenicillin der Formel (II), welche durch eine bestimmte Menge an Enzymmaterial in einer Zeit dephenylacetyliert werden kann, die sowohl in Einklang mit industriellen Anforderungen, als auch der Stabilität des Penicillinmoleküls steht, hängt von der

209820/1158

enzymatischen Aktivität ab, die im verwendeten biologischen Material vorhanden ist. Deshalb ist es vorteilhaft a priori eine solche Aktivität zu bestimmen, die auf der Kapazität von Penicillin-Acylase zur Hydrolisierung von Penicillin G in 6-Araino-Penieillinsäure und Phenylessigsäure basiert. Für eine erfolgreiche Durchführung des erfindungsgemäßen Verfahrens sollte man pro Mol Diacylpenicillin der Formel (II) eine Menge an biologischem Material verwenden, welches in der lage ist, ein Mol Benzylpenicillin bei 37° und einem pH-Wert von 7,8 in einer 3 $-igen Lösung in zehn Stunden zu 65 # des theoretischen Wertes in 6-Amino-Penicillinsäure aufzuspalten.

Am Ende der Enzymreaktion kann das gebildete halbsynthetische Penicillin mit Hilfe verschiedener bekannter !Techniken aus der Lösung isoliert werden. Eine weit verwendete Methode besteht in der Entfernung des zellularen oder enzymatischen Materials durch Filtration oder Zentrifugierung. Das Penicillin kann aus der erhaltenen klaren Lösung mit Hilfe eines organischen, in Wasser unlöslichen, Lösungsmittels nach Ansäuerung mit einer starken Säure extrahiert werden. Das Penicillin kann anschließend aus der organischen Phase in Form des Natriumsalzes ausgefällt werden, indem man eine gesättigte organische Lösung von Natrium-2-lthyl-Hexanoat zufügt. Der Niederschlag wird durch Filtration

209820/1 1 S8

abgetrennt, mit einem geeigneten Lösungsmittel gewaschen und im Vakuum getrocknet.

Das so erhaltene Produkt ist im allgemeinen genügend rein für praktische Anwendungszwecke. Alternativ kann das Penicillin jedoch auch in Form eines in Wasser schwer löslichen kristallinen Salzes ausgefällt werden, indem man eine Lösung einer Substanz zufügt, mit der das Penicillin das gewünschte unlösliche Salz bildet. Zu diesem Zweck können mit Vorteil die Salze von N,U'-Dibenzyläthylendiamin, Dihydroabietylamin, Procain, ϊί-lt hylpiperi din etc, verwendet werden.

Anhand der folgenden Ausführungsbeispiele soll die Erfindung nachstehend mit weiteren Merkmalen und Einzelheiten näher erläutert werden.

Beispiel 1

Herstellung von Eschericia coli Penicillin-Acylase produzierenden Zellen.

Zellen des Stammes Eschericia coli (ATCC 9637), die vorher resistent gegen 2000^/ml Phenylessigsäure gemacht worden sind, werden bei einer Temperatur von 3O⁰G auf einem Medium der folgenden Zusammensetzung kultiviert:

209820/1 1

Maiswasser	2,8
Peptone	0,1
Caseinhydrolisat	1,0
Na₂HPO₄ . 2H₂O	1,8
K₂HPO₄	1,8
Vaselinöl	0,02
Na-Phenylacetat	0,2
pH 6,8 - 7,0

Die Kultivierung erfolgt in einem Laborfermentiergerät unter Umrühren (650 Umdr.pro Min.) und Belüftung mittels feiner Luftblasen (6 Liter pro Stunde/Liter), bis die optische Dichte des Mediums den auf einem Colorimeter abgelesenen Wert von 99/100 bei einer Wellenlänge von 610 mu erreicht.

Das Wachstum dauert normalerweise 8 bis 10 Stunden.Nach Ablauf dieser Zeit wird das Medium zentrifugiert und die erhaltenen Zellen in einem gleichen Volumen Saline dispergiert. Diese Suspension enthält 5,5 x 10 Zellen pro ml. Um die enzymatische Aktivität der so erhaltenen zellularen Suspension zu bestimmen, werden 10 ml dieser Suspension bei 37°C und einem pH-Wert von 7,8 mit verschiedenen Mengen des Natriumsalzes von Benzylpenicillin versetzt. In regelmäßigen Abständen werden Proben der Mischung analysiert,um die Menge des intakt bleibenden

209820/1158

Benzylpenicillins zu ermitteln. Die Resultate sind in der folgenden Tabelle zusammengestellt j

Inkubationszeit Menge des Benzylpenicillins bei 37 C in mg/ml

(in Stunden)

O 2 4 6 8 10 12

Vie man der Tabelle entnehmen kann, erfolgt die Transformation von etwa 65 1· in 10 Stunden mit einer Lösung, die ursprünglich 30mg/ml Benzylpenicillin enthielt.

Beispiel 2

Herstellung einer enzyaatischen Lösung von Penicillin-Acylase von Escheriohia coli.

Zellen des Stamms Bscherichia coli (ATCC 9637), die gegen 2OOO^/ml Phenylessigsäure resistent sind, werden, wie unter Beispiel 1 beschrieben, kultiviert. Die erhaltenen und gewasobenen Zellen werden in destillierten

209020/1 tS8 "'*

20	30	40
12,6	23,4	36,5
8,8	19,3	31,2
6,3	15,6	27,7
4,1	12,4	24,4
2,3	10,8	21,3
1,7	8,5	18,7

Wasser bei einer Konzentration von 10 χ 10 Zellen/ml suspendiert. Die so erhaltene Dispersion wird mit 3 #-iger Methylisobutylketon-Lösung versetzt und die Mischung 6 Stunden lang auf 38⁰C gehalten. Das zellulare Material wird durch Zentrifugieren abgetrennt, Die dabei erhaltene klare Lösung zeigt eine Enzymaktivität um 65 i» von 43 mg/ml Benzylpenicillin in 10 Stunden bei 38⁰G und einem pH-Wert von 7,8 zu zerlegen.

Beispiel 3

Herstellung eines festen Enzympräparats, welches Penicillin-Acylase vom Stamm Escherichia coli enthält.

Zellen des Stammes Escherichia coli (ATGG 11105), die resistent gegen 2000 /ml Phenylessigsäure gemacht worden sind, werden in einem halbindustriellen Fermentiergerät von 6000 Idter Volumen im folgenden Medium kultiviert:

Maismaische (trocken) 1,0 }ί

K₂HPO₄ · H₂O 0,7 #

KH₂PO₄ · 2H₂O 0,3 l·

Natriumeitrat anh. 0,04 \

MgSO₄ 0,01 5

Se₂(SO₄)_{3 OtOO1}

209820/1158

Caseinhydrolisat 0,1 #

Glucose 0,1 #

Na-Phenylacetat 0,25 $> pH = 7,0.

Nach der oben angegebenen Wachstumsperiode, werden die Zellen durch Zentrifugieren angesammelt und mit Wasser gewaschen. Die Enzymaktivität der so erhaltenen Bakterienpaste wird, wie unter Beispiel 1 beschrieben, bestimmt.

Beispiel 5

Verfahren zur Herstellung von Diacylpenicillinen.

Das in diesem Beispiel beschriebene Verfahren ist nicht Gegenstand des Schutzbegehrens der vorliegenden Anmeldung, sondern dient lediglich zur Illustrierung des Verfahrens zur Herstellung von Diacylpenicillinen, welche als Ausgangsmaterial für die Herstellung halbsynthetischer Penicilline gemäß der vorliegenden Erfindung verwendet werden.

A. Herstellung des p-Nitrobenzylesters von Benzylpenicillin (Verbindung A).

Einer Mischung von 74,5 g Kaliumbenzylpenicillin und 500 ml Dirnenthylfοrmamid werden 39 g p-Nitro-

209820/1158

benzylbromid zugefügt. Sie Mischung wird unter Umrühren 5 Stunden lang auf 55 - 6O⁰O gehalten. Nach dem Abkühlen wird die Mischung mit 300 ml Benzen verdünnt und dann in 500 ml Wasser gegossen. Die organische Phase wird abgetrennt und dreimal mit Wasser gewaschen, um das Benzylpenicillin zu eliminieren, welches nicht reagiert hat. Die Benzenlösung, welche mit Hilfe von wasserfreiem NagSO, getrocknet worden ist, wird direkt verwendet, ohne die erhaltene Verbindung zu isolieren. Die Analyse zeigt einen Gehalt an Benzylpenicillinester von 70,8 g (Ausbeute: 75 $>).

B. Herstellung des Acetoxymethylesters von Benzylpenicillin (Verbindung B).

Eine Mischung von 45,6 g N-Äthylpiperiditisalz von Benzylpenicillin und 79 ml Brommethylacetat in 200 ml Dimethylformamid wird 16 Stunden lang bei Raumtemperatur gerührt. Es wird anschließend mit 500 ml Chloroform versetzt und in Wasser gegossen. Die organische Phase wird wiederholt mit Wasser gewasohen, um jede Spur von nicht reagiertem Benzylpenicillin zu eliminieren. Die gewaschene Lösung wird schließlich auf wasserfreiem NapSOi getrocknet und direkt zur Synthese des Diaoylpenicillins verwendet. Die erhaltene organische Lösung

209820/1158

215 5 O A

-17-enthält 33,6 g desAoetoxymethylesters (Ausbeute: 81 #).

C. Herstellung des Trimethylsilylesters von Beznylpenicillin (Verbindung G).

74,5 g Kaliumbenzylpenicillin werden in 750 ml Chloroform gelöst und dann allmählich 32,6 ml Trimethylchlorsilan zugefügt. Während dieses Hinzufügens darf die Temperatur nicht über 26⁰C steigen. Nach dem Zufügen wir-d die Mischung eine Stunde lang unter konstantem Umrühren auf einer Temperatur von 25 bis 27⁰C gehalten. • Bach der Filtrierung wird das Filtrat direkt in den nachfolgenden Stufen zur Herstellung von Diacylpenicillinen verwendet. Die organische Lösung enthält 79,6 g Trimethylsilylester von Benzylpenicillin (Ausbeute: 96$).

D. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Iminochloriden von geschütztem Benzylpenicillin.

Die organische Lösung, enthaltend 0,1 Mol des geschützten Benzylpenicillins, welche gemäß einem der Beispiele A, B oder C hergestellt worden ist, wird mit 0,12 Mol Chinolin behandelt und von außen auf 35°C gekühlt. Unter Umrühren werden 0,1 Mol an feingepudertem PCIc zugefügt und die Mischung 3 Stunden lang auf 30 - 35⁰C unter Ui rühren gehalten, wobei sie vor Feuchtigkeit geschützt

209820/1158

sein muß. Am Ende der Reaktion wird die Mischung vom Chinolin HGl filtriert, das Lösungsmittel unter reduziertem Druck abgedampft und der verbleibende Rest wiederholt unter Vakuum mit wasserfreiem Benzen bei einer Temperatur nicht oberhalb 25⁰C destilliert, um das Phosphoroxychlorid zu entfernen, welches bei der Reaktion gebildet wurde. Der nunmehr frei von Phosphoroxychlorid vorliegende Rest, wird in 200 ml wasserfreiem Benzen aufgelöst und direkt zur Herstellung von geschütztem Diacylpenicillin verwendet. Die Ausbeute ist praktisch quantitativ.

E. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von geschützten Diaoylpenicillinen.

Die beim Vorgehen nach Punkt D erhaltene Benzenlösung, welche das Iminochlorid des veresterten Benzylpenicillins enthält, wird mit fein gepudertem ITatriumsalz der erforderlichen Oarboxylsäure (0,15 Mol) behandelt. Die Mischung wird unter Umrühren 20 - 24 Stunden lang auf Raumtemperatur gehalten. Nach dem Ende der Reaktion wird die Mischung vom überschüssigen Natriumsalz und vom gebildeten Natriumchlorid filtriert. Das Filtrat wird wiederholt mit Wasser und mit einer 3 #-igen

209820/1 158

Natriumbicarbonatlösung gewaschen (wenn zum Schutz des Benzylpenicillins Trime-thylchlorosilan verwendet wird, so wird die Waschung abgewandelt und für die letzte Waschung eine 5 #-ige Salzsäurelösung verwendet. Während dieser Wasser-Säurewaschung wird der Trimethylsilylester des Diacylpenicillins hydrolisiert und findet sich als freie Säure in der letzten Benzenlösung, aus der er als Natriumsalz durch Behandeln mit Na-2-Äthylhexanoat isoliert werden kann). Durch Eindampfen der Lösung unter vermindertem Druck wird das rohe geschützte Diacylpenicillin erhalten.

P. Allgemeines Verfahren zur Herstellung von Diacylpenicillinen frei von schützenden Gruppen.

1. Entfernen der p-Nitrobenzylgruppe. Die Entfernung der p-Nitrogruppe kann mit Hilfe verschiedener Methoden erfolgen, die in der wissenschaftlichen Literatur beschrieben sind und alle auf katalytischer Reduktion basieren. Man kann beispielsweise wie folgt vorgehen: Der beim Vorgehen nach Punkt E nach dem Abdampfen des Lösungsmittels erhaltene Rest wird in 200 ml Äthylacetat aufgelöst. Die erhaltene Lösung wird auf 5 % Holzkohle bei Atmosphärendruck unter Anwesenheit von 10 - 14 ml

209820/11S 8

Triethylamin und 30 g Palladium-Katalysator hydriert. Am Ende der Reaktion wird der Katalysator entfernt und die Lösung wiederholt mit Wasser "bei einem pH-^ert von 7,1 his 7,5 extrahiert. Die wässrigen Phasen ergeben durch Lyophylisierung das Trimethylaminsalz des gewünschten Diacylpenicillins.

2. Abtrennen der p-Bromphenacylschutzgruppe.

W Der nach dem Eindampfen der Lösung unter Punkt E erhaltene Rest, der aus dem p-Bromphenacylester von Diacylpenicillin besteht, wird in 150 ml Di-Methylformamid aufgelöst. Für jeweils 0,1 Mol des ursprünglichen Produkts werden 0,2 Mol Natriumthiophenolat zugefügt. Die Mischung wird 30 Minuten lang unter Umrühren auf Raumtemperatur gehalten und dann mit Aceton versetzt. Das rohe Natriumsalz des gewünschten Diacylpenicillins wird ausgefällt und durch Filtration gesammelt.

3. Entfernen der Acetoxymethylschutzgruppe.

Der unter Punkt E erhaltene Rest wird in Äthyläther aufgelöst und die dabei erhaltene Lösung unter Umrühren bei O⁰C mit einer 5 #-igen Salzsäurelösung eine halbe Stunde lang gehalten. Die organische Phase wird abgetrennt, mit Wasser gewaschen, über Na₂SO^ getrocknet und mit einem äquivalenten Betrag molarer

209820/1158

Lösung von Natrium 2-Äthylhexanoat in Methylisobutylketon behandelt. Das Natriumsalz des gewünschten Diacylpenioillins wird als Niederschlag erhalten.

Beispiel 6

Herstellung des Natriumsalzes von Diacylpenicillinen.

Die unter diesem Beispiel beschriebene Herstellung ist nicht Teil des Schutzbegehrens der vorliegenden Anmeldung. Diacylpenicilline werden gemäß dem allgemeinen Verfahren nach Beispiel 5 hergestellt. Die folgende Tabelle enthält die Daten bezüglich der verschiedenen Herstellungen s

Herstellung von Diacylpenioillinen

000Na

209020/1158

Verbindung
Nummer

forma D

forma D

COONa

CH

COOCH₂-

0—CH —

CH. TKCS

TMCS

i»NBB

' .·■ BMA TMCS TMCS

Ausbeute

44

69

67

72

77

209820/1

	R	CH-	^^ OCH₃	-CH.	•	Schutz-	2'
Verbindung Numme r			/-yi^oc2^H5		' I forma D	TiMCS ·
8	ο · j CH_
		■	TMCS
9		forma D
	S NH₂		PBP
10	ID^NH₂		TMCS .
11
		TMCS
12		TMCS
13	TMCS
14
	155042
Ausbeute
76

67

53
66

51
63
54

Schutzgruppe BMA s Brommethylaoetat PBP « p-Broaphenaoylbromid XNCS * TriaethylchlcreilaQ FITBB « p-Nitrobeniylbromid

209820/1 1S8

Beispiel 7

Verfahren zur Herstellung von Oxacillin.

53,6 g des Natriumsalzes von N-(3-Phenyl-5-Methyl-Isoxazolyl-4) Benzylpenicillin (Verbindung 1 nach Beispiel 6) werden zu 1OOO ml einer Zellensuspenison von Escherichia coli nach Beispiel 1 zugegeben. Der pH-Wert ist auf 7»8 eingestellt und die Mischung unter Umrühren und gemäßigter Belüftung 12 bis 15 Stunden W lang auf 36 bis 39°G gehalten. Durch Zufügen von 5 #iger Sodalösung wird der ph^Wert der Mischung konstant zwischen 7,5 und 8,0 gehalben. Während dieser Periode werden zur Neutralisation der gebildeten Phenylessigsäure 74 ml Sodalösung verwendet (92 # des theoretischen Wertes). Am Ende der enzymatischen Hydrolyse wird die Suspension zentrifugiert und die klare Lösung auf 0 bis 5⁰G abgekühlt.

»Die Lösung wird nunmehr, unter Umrühren, zunächst mit 250 ml Äther und dann mit 10 # Salzsäure zur Erreichung eines pH-Wertes 2,0 behandelt. Die organische Phase wird abgetrennt und dreimal mit 100 ml Wasser gewaschen und über Na₂SO. getrocknet. Die wasserfreie Ätherlösung wird anschließend mit 100 ml von 1,0 Mol Natrium-2-Ethyl-Hexanoat in Methylisobutylketon behandelt. Das Natriumsalz des Oxacillins, welches als

209820/1158

Niederschlag ausfällt, wird filtriert und zunächst mit Äther und anschließend mit trockenem Isopropanol gewaschen. Nach dem Trocknen unter Vakuum erhält man 39»1 g Endstoff mit einem mikrobiologischen Titer von 89 1» (Ausbeute: 89 #).

Beispiel 8

Verfahren zur Herstellung von Chloxacillin.

Ausgehend von 7,5 g des Natriumsalzes von N- [j5 (2-Qhlorophenyl)-5-Methyl-Isoxazolyl-4[ Benzylpenicillin (Verbindung 2 unter Beispiel 6) werden beim Vorgehen gemäß Beispiel 7 41,6 g Chloxacillin erhalten (Ausbeute: 90,6 #) mit den folgenden Eigenschaften:

Mikrobiologischer !Eiter = 94 # HgO (Karl Fischer) = 4,6 $> Iodometrischer liter = 96 #

Beispiel 9

Verfahren zur Herstellung von Dicloxacillin.

61 g der Verbindung 3 nach Beispiel 6 (Natriumsalz von N- [T (2,6-Diohlorphenyl) 5-Methyl-Isoxazolyl^T| Benzylpenicillin) werden, wie unter Beispiel 1 beschrieben, verwendet. Nach dem Ende der enzymatlschen

20 9820/1158

Hydrolyse wird die Mischung zentrifugiert, um das zellulare Material zu entfernen und die erhaltene klare Lösung mit einem Liter Methylisobutylketon behandelt. Die Lösung wird anschließend bei O⁰C mit 10 #-iger Salzsäure angesäuert, um einen pH-Wert von 2 zu erhalten und die organische Phase abgetrennt, wiederholt mit Wasser gewaschen und über NapSO, getrocknet.

Zur trockenen Lösung werden 120 ml einer 1,0 Mol Na-2-Äthyl-Hexanoatlösung in Methylisobutylketon zugefügt und die Mischung unter Umrühren auf 25 bis 28⁰G erwärmt. Sie wird dann unter konstanter Bewegung bis zur vollständigen Kristallisation auf Raumtemperatur gehalten. Der Niederschlag wird filtriert und zunächst mit Methylisobutylketon und anschließend mit Äther gewaschen und unter Vakuum getrocknet. Man erhält 44,2 g Dicloxacillin (Ausbeute: 88 #) mit den folgenden Eigenschaften:

Mikrobiologischer Titer = 91,3 # H₂O (Karl Fischer) = 4,2 $ Iodometrischer Titer = 95,1 #

2098*0/1158

Beispiel 10

Verfahren zur Herstellung von Ampicillin (D(-)iX-Amino-Benzyl-Penicillin).

59 g der Verbindung 4 nach Beispiel 6 werden in einem Liter Enzymlösung von Penicillin-Acylase, welche gemäß Beispiel 2 hergestellt wurde, aufgelöst. Der pH-Wert wird auf 7,8 eingestellt und die Lösung 9 bis 12 Stunden lang auf einer Temperatur von 36 bis 39⁰G gehalten, der pH-Wert wird konstant zwischen 7,5 und 8,0 gehalten, indem man entsprechende Mengen 5 #-iger Sodalösung zufügt. Am Ende der enzymatischen Hydrolyse wird die Lösung auf 2 bis 5⁰G gekühlt und mit 10 #-iger Salzsäure angesäuert, um einen pH-Wert von 1,5 bis 2,0 zu erhalten. Die saure Lösung wird dreimal mit 100 ml Methylisobutylketon extrahiert. Die extrahierte wässrige Lösung wird nach Korrektur des pH-Wertes auf 7,0 unter reduziertem Druck bei 25 bis 28⁰C konzentriert. Der Rest wird auf einem Bett von Pilterhilfe gemischt mit aktiver Holzkohle filtriert. Die erhaltene Lösung wird unter Umrühren und äußerer Kühlung auf einen pH-Wert von 4,8 bis 4,9 gebracht.

209820/1 158

Daa Ampicillin, welches in Form von Trihydrat ausfällt, wird durch Filtration gesammelt und zunächst mit einer kleinen Menge Eiswasser und dann mit 85 $-igem Isopropanol gewaschen. Danach wird es in einem warmen Luftstrom (40⁰O) getrocknet. Man erhält 41,6 g Ampicillintrihydrat mit folgenden Eigenschaften:

Mikrobiologischer Titer = 89,6 $> H₂O (Karl Fischer) = 12,8 %

Hydroxamischer Titer = 93,1 %

|äj

äjD²⁵ = (c=O,25 t in H₂O = + 276°

Beispiel 11

Verfahren zur Herstellung von 6 (-) (X -Amino-(2-Thienyl)· Acetamid! Penicillinsäure.

Geht man von 49,5 g der Verbindung 11 nach Beispiel 6 aus und verfährt entsprechend Beispiel 10, so erhält man 30,6 g 6I (-) -Amino-(2-Thienyl)-Acetamidl Penicillinsäure (Ausbeute: 75%) mit folgenden Eigenschaften:

2098 70/1158

Hydroxamisoher liter = 92 96

H₂O = 13,3 1>

|<XT D²⁵ (c=0,5 # in 0,1Ii HGl) = + 192°

Beispiel 12

Verfahren zur Herstellung von 6 [j-Amino-1 Gyclohexyl-GarboxamidJ Penicillinsäure.

Geht man von 48 g der Verbindung 12 nach Beispiel 6 aus und verfährt,wie unter Beispiel 10 beschrieben, so erhält man 21,5 g amorpher 6-1-Amino-1 Gyclohexylcarboxamid Penicillinsäure (Ausbeute:64#) mit folgenden Eigenschaften:

Iodometrischer Titer = 88 $ Hydroxamischer Titer = 90,3 Ί» H₂O (Karl Fischer) = 3,8 #

Beispiel 13

Verfahren zur Herstellung von 6-(i-Amino-1-Gyolopentyl-Garboxamid) Penicillinsäure.

Ausgehend von 47 g der Verbindung 13 nach Beispiel 6 erhält man beim Vorgehen gemäß Beispiel 10 19,6 g

2 0 ü 8 2 {) / 1 Hi i\

von ö-O-Amino-i-Gyclopentyl-CarboxamidJPenecillinsäure (Ausbeute: 58 %) mit folgenden Eigenschaften:

Iodometrischer liter = 91 ?6 Hydroxamischer Titer = 87 $> H₂O (Karl Fischer) « 5,2 f>

Beispiel 14

Verfahren zur Herstellung von 6-|_ (-)-0(-Amino(3-Thienyl)-Acetamid| Penicillinsäure.

49,5 g der Verbindung 13 nach Beispiel 6 werden in 500 ml Wasser gelöst und zur Lösung 72 g (Trockengewicht) des Enzympräparats nach Beispiel 3 zugefügt. Der pH-Wert wird auf 7,8 eingestellt und die Mischung 8 Stunden bei 38⁰C gerührt, wobei der pH-Wert während dieser Zeit zwischen 7,5 und 8,0 gehalten wird. Am Ende der Hydrolyse wird die Suspension von den festen Bestandteilen filtriert. Das Produkt wird aus dem Piltrat gemäß dem Verfahren unter Beispiel 10 isoliert, Man erhält 29,1 g von 6- Q-)-(X-Amino(3-Thienyl)-Acetamid] Penicillinsäure(Ausbeute 71,2 #) mit folgenden Eigenschaften:

9820/1158

Hydroxamischer !Eiter = 91,3 Iodometrischer liter = 93,1 H₂O (Karl Fischer) = 13,6

Beispiel 15

Verfahren zur Herstellung von Pheneticillin.

Zu 1000 ml von Aerobacter alcaligenes Bakterienpaste (XTGG 13529), die man, wie unter Beispiel 4 beschrieben erhält, werden 50,5 g des Natriumsalzes der Verbindung 7 nach Beispiel 6 gegeben. Die Suspension wird unter Umrühren bei 38°G 12 Stunden lang auf einem pH-Wert von 7,7 bis 8,0 gehalten. Am Ende der enzymatischen Hydrolyse wird die Mischung zentrifugiert, um das zellulare Material zu entfernen. Die klare Lösung wird mit 200 ml Methylisobutylketon extrahiert. Die extrahierte Lösung wird mit 250 ml Methylisobutylketon geschichtet auf 2 bis 5⁰G abgekühlt und mit 10 #-iger Salzsäure angesäuert, um einen pH-Wert von 2 einzustellen. Die organische Phase wird von der wässrigen Phase abgetrennt und weitere zweimal mit 120 ml Methylisobutylketon extrahiert. Die sauren organischen Phasen werden mit 100 bis 150 ml Wasser gewaschen und über NapSO. getrocknet. Die wasserfreie Lösung wird

209820/1158

mit 165 ml einer molaren Lösung von Kalitim-2-Äthyl-Hexanol behandelt. Der gebildete weiße Niederschlag wird filtriert, mit Aceton gewaschen und unter Vakuum bei 35⁰O getrocknet. Man erhält 34,6 g Ealiumpheneticillin (Ausbeute: 86 ^) mit folgenden Eigenschaften:

Iodometrischer Titer = 88,3 # H₂O (Karl Fischer) = 1,2 1° Mikrobiologischer Titer = 86,2 %

Beispiel 16

Verfahren zur Herstellung von Methicillin.

Man verwendet 52 g der Verbindung 9 nach Beispiel 6 und verfährt, wie unter Beispiel 15 beschrieben. Am' Ende der enzymatischen Hydrolyse wird die nach der Zentrifugierung erhaltene klare Lösung bei einem pH-Wert von 2 mit 350 ml Dichlormethan extrahiert. Die organische Lösung wird nach dem Waschen mit Wasser und Trocknen über Na₂SO, mit 120 ml einer einmolaren Lösung von Natrium 2-Äthylhexanoat in Methylisobutylketon behandelt. Der gebildete weiße Niederschlag wird durch Filtration gesammelt, zunächst mit Dichlormethan und anschließend mit Aceton gewaschen und unter Vakuum

209820/1158

bei 35 bis 4O⁰C getrocknet. Man erhält 28,7 g des ITatriumsalzes von Methicillin (Ausbeute: 71 #).

209820/1158

Claims

Patentanspruohe;

1. Enzymatisches Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Penicilline, insbesondere halbsynthetischer Penicilline der allgemeinen Formel I ;

S
R CO NH CH CH

CO N CH-COOH (I)

(Dabei steht R für einen Rest aus der Gruppe (X -Amino-Benzyl, (X -Carboxybenzyl, 2 oder 3 Ihienylmenthyl, 2 oder 3 Thienylaminomenthyl oder eine Isoxazolgruppe der allgemeinen Formel:

N C CH,

209 8 20/1158

-35-R kann auch eine Gruppe der allgemeinen Formel

R₂ R₄

darstellen. Dabei bedeutet:

R„ eine Aryl-, Aryloxyl-, Arylmercaptyl-Gruppe (eventuell durch ein oder mehrere Halogenatome substituiert);

Wasserstoff oder eine (Cj - C₁₀) Alkylgruppe, (C₁ - C₁₀) Alkoxylgruppe, Aminogruppe, (C₁-Cg) Monoalkyl-Aminogruppe, (C₁ - Cg) Dialkyl-Aminogruppe, Carboxylgruppe, (C₁ - Cg) Carboxylalkylgruppe, Carboxylmethylacetoxylgruppe, Carboxybenzylgruppe und, als Spezialfall, können R« und R~ auch gemeinsam zu einem C₅ - C₇ eycloaliphatischen Ring gehören;

Rj Wasserstoff, oder, im Spezialfall, in dem R« und R, gemeinsam einen Cc - CY-oycloalphatischen Ring bilden, eine Aminogruppe, eine (C₁ - Cg) Monoalkylaminogruppe oder eine (C₁ - Cg) Dialkylaminogruppe),

209820/1158

dadurch gekennzeichnet, daß die obengenannten Penicilline oder ihre nichttoxischen Salze oder Ester durch enzymatische Hydrolyse mit Hilfe des Enzyms Penicillin-Acylase aus Diacyl-Penicillinen der allgemeinen Formel

(/ \\ gh- σο β

CH 9<^CH (II)

_R _QQ, CO -N CH COOH

gewonnen werden, wobei R für die gleichen Gruppen steht wie oben.

2. Verfahren nach Anspruch 1, dadurch gekennzeichnet, daß die Dephenylacetylierung der Diacylpenicilline in wässrigem Medium bei einer Temperatur zwischen 2O⁰C und 50⁰C, vorzugsweise zwischen 3O⁰C und 42⁰C, bei einem alkalischen pH-Wert, vorzugsweise zwischen 7,1 und 8,5» in Anwesenheit des Enzyms Penicillin-Aoylase erfolgt, welches durch Mikroorganismen erzeugt wird.

209820/1158

3. Verfahren nach Anspruch 1 oder 2, dadurch gekennzeichnet, daß die Dephenylaoetylierung der Diaoylpenicilline unter Anwesenheit von Penicillin-Aeylase erzeugenden Mikroorganismen, oder unter Anwesenheit zellularer Extrakte solcher Mikroorganismen erfolgt.

4. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 3, dadurch gekennzeichnet, daß die enzymatische Hydrolyse der Diacylpenicilline unter Verwendung von Penicillin-Acylase erfolgt, welche von solchen Mikroorganismen erzeugt wurde, welche in der Lage sind, die Amidgruppe in Position 6 des Benzylpenicillinmoleküls unter Bildung von wenigstens 20 $> an 6-Amino-Penicillinsäure während 24 Stunden bei 38⁰C und pH 7,8 anzugreifen.

5. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 bis 4, gekennzeichnet durch die Verwendung von Penicillin-Acylase, die durch Mikroorganismen, umfassend Schimmelpilze, Hefen und Bakterien, produziert wird, welche aus den folgenden Gattungen ausgewählt sind: Alternatia, Aspergillus, Botritis, Cephalosporium, Cryptococcus; Emericellopsis, Epicoocum, Epiolermophyton, Fusarium, Mucor, Penicillum, Phoma, Trichoderma, Tricophyton, Trichosporon, Streptomyces, Aerobacter, Alcaligenes,

209820/1158

Bordetella, Cellulomonas, Corynebacterium, Erwinia, Escherichia, Flavobacterium, Micrococcus, Proteus, Pseudomonas, Salmonella, Sarcina, Xantomonas, Torulopsis, Thodotorula, Arthrobacter.

6. Verfahren zur Herstellung halbsynthetischer Penicilline nach einem der Ansprüche 1 bis 5, dadurch gekennzeichnet, daß bei der enzymatischen Hydrolyse P die Penieillin-Acyläse produzierenden Mikroorganismen in Porm von Zellen vom Kulturmedium oder als acetonisches Pulver, oder als an inerten Trägern adsorbierte Zellen,oder als zellulare Extrakte (enzymatische Präparate) der erwähnten Mikroorganismen verwendet werden.

7. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Art Esoherichia zur Herstellung der Penicillin-Acylase verwendet wird.

8. Verfahren nach Anspruch 5 oder 6, dadurch gekennzeichnet, daß ein Mikroorganismus der Art Aerobacter zur Herstellung der Penicillin-Acylase verwendet wird.

09820/1158

9. Verfahren nach einem der Ansprüche 1 Ms 6, dadurch gekennzeichnet, daß das Hydrolysemedium enzymatisches Material in einer solchen Menge enthält, ttie in der Lage ist, bei 37°0 und einem pH-Wert von 7,6 in 10 Stunden eine 3 #-ige Lösung von Benzylpenicillin zu wenigstens 35 #> vorzugsweise 65 #, zu hydrolysieren.

10.Verfahren nach einem der Ansprüche 5 bis 8, dadurch gekennzeichnet, daß die Penicillin-Acylase produzierenden Mikroorganismen gegen 1000 - 3000Y/ml Phenylessigsäure resistent sind.

11, Verfahren nach einem der vorhergehenden Ansprüche, dadurch gekennzeichnet, daß eine Escherichia coli-Art, welche gegen 1000 bis 3000 y/ml Phenylessigsäure resistent ist, zur Herstellung der Penicillin-Acylase verwendet wird.

12.Verfahren nach Anspruch 10, dadurch gekennzeichnet, daß eine Aerobaoter-Aerogenes-Art, die gegen 1000 3000VmI Phenylessigsäure resistent ist, verwendet wird.

209820/1158