CN100529086C - 一个可提高黄原胶产量的基因 - Google Patents

一个可提高黄原胶产量的基因 Download PDF

Info

Publication number
CN100529086C
CN100529086C CNB2005100866537A CN200510086653A CN100529086C CN 100529086 C CN100529086 C CN 100529086C CN B2005100866537 A CNB2005100866537 A CN B2005100866537A CN 200510086653 A CN200510086653 A CN 200510086653A CN 100529086 C CN100529086 C CN 100529086C
Authority
CN
China
Prior art keywords
gene
xanthan gum
ala
val
leu
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Expired - Fee Related
Application number
CNB2005100866537A
Other languages
English (en)
Other versions
CN1952155A (zh
Inventor
何勇强
唐纪良
姜伯乐
唐东阶
陆光涛
梁晓夏
危广宁
何飞燕
冯家勋
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Guangxi University
Original Assignee
Guangxi University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Guangxi University filed Critical Guangxi University
Priority to CNB2005100866537A priority Critical patent/CN100529086C/zh
Publication of CN1952155A publication Critical patent/CN1952155A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN100529086C publication Critical patent/CN100529086C/zh
Expired - Fee Related legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Images

Landscapes

  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)

Abstract

本发明公开了来自野油菜黄单胞菌中的一个与黄原胶生产有关的基因—尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶基因,它是下列核苷酸序列之一:1)序列表中序列1的DNA序列;2)与序列表中序列1限定的DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。本发明还涉及含有该基因的载体和通过高表达该基因来提高黄原胶产量的方法。

Description

一个可提高黄原胶产量的基因
技术领域
本发明属于微生物基因工程领域。具体涉及与黄原胶合成相关的基因,该基因编码的蛋白质为尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶(UDP-glucose4-epimerase,简称rmd),该基因在野生型野油菜黄单胞菌中表达,可显著增加黄原胶的产量,可用于黄原胶生产菌株的遗传改良。
背景技术
黄原胶是一种由野油菜黄单胞菌野油菜致病变种(Xanthomonascampestris pv.campestris,简称Xcc)所产生的胞外多糖聚合物,由多个“五糖单元”聚合而成。两个D-葡萄糖分子通过β-(1→4)糖苷键连接成主链骨架,一条由甘露糖-(β→1,4)-葡萄糖醛酸-(β→1,2)-甘露糖组成的侧链通过α-(1→3)糖苷键连接到主链的一个D-葡萄糖残基,组成一个“五糖单元”。黄原胶具有良好的增粘性和触变性,极佳的热、酸、碱稳定性,较强的抗酶解能力,能与大多数的金属盐配伍,与常用的溶剂、试剂相容。它是目前国内外已经开发的几种微生物多糖中最具特色的一种,也是世界上生产规模最大,用途最广的微生物多糖。已作为助悬剂、增稠剂、乳化剂、稳定剂,在石油开采、医药、食品、饮料、化妆品、洗涤剂、涂料等行业中广泛应用,另外在森林灭火、环境保护方面也有很好的应用前景(Sutherland1986;李信,1995)。美国曾对9种微生物多糖进行评价,黄原胶以其功能全面、用途广泛而居首位。目前全世界黄原胶的年产量超过5万吨,在发酵工业中占有十分重要的地位。黄原胶的广泛应用,为相关的行业创造了巨大的经济效益。
然而,目前国内黄原胶生产菌株的产量在4%碳源的发酵液中黄原胶产量为27g/L,而发达国家则超过34g/L,选育高产菌株仍有很大的发展空间,可以通过采用:①提高黄原胶生物合成相关基因产物的活性(Harding etal 1987;Zha et al 1998);②增加相关基因的拷贝数(Tseng et al 1992);③修饰黄原胶生物合成调控基因(Tang et al 1991;Katzen et al 1998);④修饰与糖代谢有关的基因,降低糖类的其他途径消耗;⑤改变多聚糖分解酶类基因,以减少胞外多糖的降解,提高产胶率(Schroter et al 2001);⑥提高胞外多糖转运酶类活性等方法来改良菌株提高黄原胶产量。
发明内容
本发明提供与黄原胶合成相关的新基因,用于黄原胶生产菌株的遗传改良,提高黄原胶产量。
因此,本发明的一个目的是提供一种编码尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶的基因(rmd),其是下列核苷酸序列之一:
1)SEQ ID No.1所示的DNA序列;
2)与SEQ ID No.1所示DNA序列具有80%以上同源性的DNA序列。
在一个实施方案中,所述的基因具有SEQ ID No.1所示的DNA序列,5’端的第1-939位核苷酸为开放阅读框。
本发明还涉及含有上述基因的表达载体。优选为pLAFR3-rmd。
本发明另一个目的是提供一种提高黄原胶产量的方法,其特征在于在微生物中高表达上述基因。优选所述微生物是野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)。
具体地讲,一种源于野油菜黄单胞菌8004菌株的基因(基因组全序列已在GenBank公布,序列号为CP000050)所表达的尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶或功能类似物,其氨基酸序列与SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列具有至少80%的同源性,至少它具有SEQ ID NO:2所示的氨基酸序列。本发明还具体地涉及编码它们的基因。另外还提供了尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶在黄原胶生产中的应用和基因在黄原胶生产和其菌株的遗传改良中的应用。
SEQ ID No.1是野油菜黄单胞菌8004菌株的基因DNA序列片段,由939个碱基组成。含完整的尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶基因,自5’端的第1-939位核苷酸为该基因的开放阅读框(Open Reading Frame,ORF),自5’端的第1-3位核苷酸为该基因的起始密码子GTG,自5’端的第937-939位核苷酸为终止密码子TGA。SEQ ID No.2所示的氨基酸序列是尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶基因编码的尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶蛋白产物,由312个氨基酸组成。
本发明提供了一种与黄原胶合成相关的新基因,在黄原胶生产和其菌株的遗传改良中的应用有着重要的意义。
附图说明
图1为rmd基因的PCR产物电泳图。
M:100bp标准DNA(片段大小从大到小依次为:3kb,2kb,1.5kb,1.2kb,1kb,0.9kb,0.8kb,0.7kb等);1:rmd基因PCR产物电泳带,显示大小为约950bp。
图2为rmd基因克隆入表达载体pLARF3后的酶切检验。
M:λ/Hind III标准DNA(片段大小从大到小依次为:23.1kb,9.4kb,6.6kb,2.4kb,2.0kb);1:克隆载体pLAFR3作为对照的BamHI/EcoRI酶切产物;2:表达质粒pLAFR3-rmd的BamHI/EcoRI酶切产物。
图3为pLAFR3的质粒图谱。
图4为验证rmd基因在转化株中高表达的RNA实验。
图5为rmd基因导入野生型Xcc 8004后,构建高表达菌株。高表达菌株与野生型菌株在NYG+2%葡萄糖上的生长状况。
具体实施方式
下文将参考实施例详细描述本发明,所述实施例仅是意图举例说明本发明,而不是意图限制本发明的范围。本发明的范围由后附的权利要求具体限定。
实施例
在本发明的实施例中所用到的材料包括:黄单胞菌野生型菌株8004,购于英国植物病原细菌国家保藏中心(The National Collection of PlantPathogenic Bacteria,NCPPB),保藏号为NCPPB No.1145;表达载体pLAFR3(Staskawicz et al,1987)为本研究室(广西大学生命科学与技术学院分子遗传研究所)保存。限制性内切酶、修饰酶等试剂购自Promega、Stratagene、TAKARA、QIAGEN等公司;抗生素(利福平、卡那霉素)和培养基原料(蛋白胨、酵母提取粉、甘油)购于上海生物工程公司。
SV Total RNA Isolation System总RNA提取试剂盒购自Promega公司,反转录试剂盒ReveAidTM First Strand cDNA Synthesis Kit购自Fermentas公司。
培养基NYG(每升溶液含5g蛋白胨,3g酵母膏和20g甘油,根据三组分缩写为NYG,pH 7.0)。
实施例1rmd基因的PCR扩增
根据rmd的基因序列,设计引物:
正向引物:C3626F,5-CCCGAATTCGTGGCTTCTCATTC-3,
反向引物:C3626R,5-CCCGGATCCTCACTGCTCAGTGC-3。
根据野油菜黄单胞菌菌株的rmd基因序列,设计带有BamHI、EcoRI酶切位点的上下游引物,上游引物命名为C3626F,加有BamHI切点;下游引物命名为C3626R,加有EcoRI切点。以野油菜黄单胞菌菌株NCPPBNo.1145总DNA为模板,PCR扩增该基因全长序列(PCR条件95℃3min;95℃30sec,56℃30sec,72℃1min,30个循环;72℃5min)。电泳图示PCR产物,大小约950bp(见图1)。用双脱氧核苷酸法在ABI 377 DNA自动测序仪上测定DNA核苷酸序列(SEQ ID No.1)。
实施例2rmd基因高表达质粒的构建及验证
用BamHI/EcoRI酶切PCR产物及pLAFR3(见图3)并连接,将其rmd基因片段克隆至pLAFR3中,构建表达质粒pLAFR3-rmd并酶切验证(见图2)。
实施例3黄单胞菌转化子中rmd基因高表达的验证
采用电穿孔法将表达质粒pLAFR3-rmd导入上述黄单胞菌野生菌株中。通过从黄单胞菌转化子提取质粒,酶切的方法筛选黄单胞菌转化株。
采用半定量PCR方法检测rmd基因在转化株中确实高表达状况(图4)。操作方法:野生型菌株和测试菌株在NYG培养基中培养18小时,分别提取RNA(SV Total RNA Isolation System总RNA提取试剂盒),用反转录ReveAidTM试剂盒获得总RNA的cDNA。在分别用16S rDNA上下游引物(GAGGATGATCAGCCACACTG和ACCACATACTCCACCGCTTG)和rmd基因上下游引物(C3626F、C3626R),以总cDNA为模板,进行PCR(反应条件95℃3min;95℃30sec,61℃30sec,72℃1min,30个循环;72℃5min)。检测16S rRNA的表达状况,在确定16S rRNA表达基本一致。电泳带明亮程度差异明显,结果表明,在构建的高表达菌种中rmd基因比在野生菌中表达量增高。
实施例4rmd基因高表达菌株在固体培养基上的生长状况
在NYG+2%葡萄糖固体培养基(NYG加1.5%琼脂,pH7.0)平板上,用牙签点接野生型黄单胞菌、rmd基因高表达菌株,28℃培养72小时。结果表明,rmd基因高表达菌株比野生型菌株的胞外多糖产量明显(见图5)。
实施例5rmd基因高表达菌株的黄原胶产量检测
黄原胶产量检测(Tang D,et al.2005),可以通过摇瓶发酵,提取黄原胶,对产量进行比较。黄原胶产量作定性分析时,将Xcc的过夜培养物以1%(v/v)的接种量接种至加2%葡萄糖的NYG培养基,28℃摇床培养3天后,取1体积的培养物,缓慢注入到3~7倍体积的无水乙醇中,边注入边搅拌,然后将絮状沉淀物取出后干燥,称重,换算成每100ml培养物可形成多少克黄原胶进行菌株间的产量比较。对rmd基因高表达菌株与野生型菌株平行进行摇瓶发酵,重复三次,黄原胶产量统计对比结果如表1。结果显示,培养72小时和120小时rmd基因高表达菌株黄原胶产量分别比野生型菌株提高44.7%和43.9%。证实rmd基因高表达能增加黄原胶的产量。
表1rmd基因高表达菌株与野生型8004菌株黄原胶产量比较
Figure C20051008665300081
参考文献
1.李信主编.1995.黄原胶生产与应用,北京:中国农业科技出版社.
2.Harding NE.et al.1987.Genetic and physical analyses of a cluster ofgenes essential for xanthan gum biosynthesis in Xanthomonas campestris.JBacteriol.169:2854-2861.
3.Hirsch PR et al.1984.A physical map of pPH1JI and pJB4JI.Plasmid.12:139-141.
4.Katzen F et al.1998.Xanthomonas campestris pv.campestris gummutants:effects on xanthan biosynthesis and plant virulence.J Bacteriol.180:1607-1617.
5.Liu YG et al.1995 Efficient isolation and mapping of Arabidopsisthaliana T-DNA insert junctions by thermal asymmetric interlaced PCR.PlantJ.8:457-63.
6.Liu YN et al.1990.A multipurpose broad host range cloning vector andits use to characterise an extracellular protease gene of Xanthomonascampestris pathovar campestris.Mol Gen Genet.220:433-440.
7.Schroter K et al.2001.Xanthomonas campestris pv.campestris secretesthe endoglucanases ENGXCA and ENGXCB:construction of anendoglucanase-deficient mutant for industrial xanthan production.ApplMicrobiol Biotechnol.55:727-733.
8.Sutherland IW.1986.Industrially useful microbial polysaccharides.Microbiol Sci.3:5-9.
9.Tang D J,Li X J,He Y Q,et al.The zinc uptake regulator Zur isessential for the full virulence of Xanthomonas campestris pv.campestris.MolPlant-Microbe Interact,2005,18:652-658.
10.Tang JL et al.1991.Genetic and molecular analysis of a cluster of rpfgenes involved in positive regulation of synthesis of extracellular enzymes andpolysaccharide in Xanthomonas campestris pathovar campestris.Mol GenGenet 226:409-417.
11.Tseng YH et al.1992.Increase of xanthan production by cloning xpsgenes into wild-type Xanthomonas campestris.Lett Appl Microbiol.14:43-46.
12.Zha D et al.1998.Cloning of DNA sequences involved inexopolysaccharide synthesis of Xanthomonas campestris pv.campestris.WeiSheng Wu Xue Bao.38:251-255.
序列表
<110>广西大学
<120>一个可提高黄原胶产量的基因
<130>IB055870
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>939
<212>DNA
<213>Xanthomonas campestris
<400>1
gtggcttctc attctgagct gaaaggcaag cgggttctgg tcagtggcgc gtccgggttc     60
accggacgct acatgtccca gcagctcaag gagcagggct gcaccgtgat cggtgttggg    120
acccgttgcg acggtgccgg tacaagcgca accgacgagt tctggccgat ggatctgcgt    180
gacgctgccg acgtcgctcg cgtcgttgcg caggcccaag ccgactacgt tgtgcatctg    240
gctgcagtgg cctttgtcgg tcatggggat gccgacgatt tttatcgggt caatctgctc    300
ggcacgcgta acctgctgca ggcgctggcc gcaagccaac accgcccaga gagggtgctg    360
atcgcgagca gtgccaatgt ctacggcaat gcaaccgagg gcgtgatcga cgagtcggtc    420
acgccttcgc ccgcgaacga ctacgcggtg agcaagctcg ccatggaata tgtcgccagc    480
ttgtggcacg agcgcctgcc cctggtgatt gcccgcccat tcaactacac gggggtcggt    540
caggcgacca atttcctgat tcccaagatt gtttcgcatt tcgcatcgcg cgcctcttcc    600
atcgagttgg gcaacaccga agtgtggcgg gatttcggcg atgtcagatc ggtcgtgctg    660
gcttatcgca agcttctgca agcacccgct gcggaagggc agatcgtcaa cgtgtgttcg    720
ggtgtcgcca gttcgctgag cgacatcatc aggatctgct cgaaaatcac cggccacgac    780
atcgacgtcc aggtgaatcc cgcattcgtt cggcagaatg aagtcaggaa gttgcttggc    840
agcaatgcca gattgcagga gctgatcggc gattggcaga gtcttgcgct ggaggatacg    900
ttgcgctgga tgcttgaagc tgcaagcact gagcagtga                           939
<210>2
<211>312
<212>PRT
<213>Xanthomonas campestris
<400>2
Met Ala Ser His Ser Glu Leu Lys Gly Lys Arg Val Leu Val Ser Gly
1               5                   10                  15
Ala Ser Gly Phe Thr Gly Arg Tyr Met Ser Gln Gln Leu Lys Glu Gln
            20                  25                  30
Gly Cys Thr Val Ile Gly Val Gly Thr Arg Cys Asp Gly Ala Gly Thr
        35                  40                  45
Ser Ala Thr Asp Glu Phe Trp Pro Met Asp Leu Arg Asp Ala Ala Asp
    50                  55                  60
Val Ala Arg Val Val Ala Gln Ala Gln Ala Asp Tyr Val Val His Leu
65                  70                  75                  80
Ala Ala Val Ala Phe Val Gly His Gly Asp Ala Asp Asp Phe Tyr Arg
                85                  90                  95
Val Asn Leu Leu Gly Thr Arg Asn Leu Leu Gln Ala Leu Ala Ala Ser
            100                 105                 110
Gln His Arg Pro Glu Arg Val Leu Ile Ala Ser Ser Ala Asn Val Tyr
        115                 120                 125
Gly Asn Ala Thr Glu Gly Val Ile Asp Glu Ser Val Thr Pro Ser Pro
    130                 135                 140
Ala Asn Asp Tyr Ala Val Ser Lys Leu Ala Met Glu Tyr Val Ala Ser
145                 150                 155                 160
Leu Trp His Glu Arg Leu Pro Leu Val Ile Ala Arg Pro Phe Asn Tyr
                165                 170                 175
Thr Gly Val Gly Gln Ala Thr Asn Phe Leu Ile Pro Lys Ile Val Ser
            180                 185                 190
His Phe Ala Ser Arg Ala Ser Ser Ile Glu Leu Gly Asn Thr Glu Val
        195                 200                 205
Trp Arg Asp Phe Gly Asp Val Arg Ser Val Val Leu Ala Tyr Arg Lys
    210                 215                 220
Leu Leu Gln Ala Pro Ala Ala Glu Gly Gln Ile Val Asn Val Cys Ser
225                 230                 235                 240
Gly Val Ala Ser Ser Leu Ser Asp Ile Ile Arg Ile Cys Ser Lys Ile
                245                 250                 255
Thr Gly His Asp Ile Asp Val Gln Val Asn Pro Ala Phe Val Arg Gln
            260                 265                 270
Asn Glu Val Arg Lys Leu Leu Gly Ser Asn Ala Arg Leu Gln Glu Leu
        275                 280                 285
Ile Gly Asp Trp Gln Ser Leu Ala Leu Glu Asp Thr Leu Arg Trp Met
    290                 295                 300
Leu Glu Ala Ala Ser Thr Glu Gln
305                 310

Claims (2)

1.一种提高黄原胶产量的方法,其特征在于在野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)中高表达一种编码尿苷二磷酸葡萄糖差向异构酶的基因(rmd),所述基因是SEQ ID No.1所示的DNA序列。
2.权利要求1的方法,其中所述野油菜黄单胞菌是野油菜黄单胞菌野生型菌株8004。
CNB2005100866537A 2005-10-20 2005-10-20 一个可提高黄原胶产量的基因 Expired - Fee Related CN100529086C (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005100866537A CN100529086C (zh) 2005-10-20 2005-10-20 一个可提高黄原胶产量的基因

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CNB2005100866537A CN100529086C (zh) 2005-10-20 2005-10-20 一个可提高黄原胶产量的基因

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN1952155A CN1952155A (zh) 2007-04-25
CN100529086C true CN100529086C (zh) 2009-08-19

Family

ID=38058712

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CNB2005100866537A Expired - Fee Related CN100529086C (zh) 2005-10-20 2005-10-20 一个可提高黄原胶产量的基因

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN100529086C (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN102212499B (zh) * 2010-04-09 2012-12-19 广西大学 一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因的应用
CN102212500B (zh) * 2010-04-09 2012-12-26 广西大学 一种编码转录调控因子的基因的应用
CN110777104B (zh) * 2019-10-30 2021-05-28 广西大学 一种黄原胶高产菌的构建方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AAY50667. NCBI:GENBANK. 2005
AAY50667. NCBI:GENBANK. 2005 *
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关. 陆光涛等.生物工程学报,第20卷第4期. 2004
野油菜黄单胞菌野油菜致病变种8004菌株wxcA基因与EPS的产量有关. 陆光涛等.生物工程学报,第20卷第4期. 2004 *

Also Published As

Publication number Publication date
CN1952155A (zh) 2007-04-25

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Kawano et al. Cloning of cellulose synthesis related genes from Acetobacter xylinum ATCC23769 and ATCC53582: comparison of cellulose synthetic ability between strains
CN110438136B (zh) β-葡萄糖苷酶及其突变体的基因、氨基酸序列和应用
CN111424027A (zh) 一种定点突变改造的褐藻胶裂解酶突变体及其应用
CN101072873B (zh) 利用调节剂生产生物聚合物的组合物和方法
CN107904223A (zh) 一种褐藻胶裂解酶、分泌褐藻胶裂解酶的宿主细胞及其应用
CN100529086C (zh) 一个可提高黄原胶产量的基因
CN101100658B (zh) 一种海藻糖合成酶及其应用
JP4235262B2 (ja) 組換え細菌宿主における非生来細菌性エキソ多糖の産生
CN105543128A (zh) 一种极地适冷耐盐褐藻酸裂解酶及其编码基因c3与应用
CN102212499B (zh) 一种编码4-羟基苯丙酮酸双加氧酶的基因的应用
KR20100040438A (ko) 신규한 아가레이즈 및 이를 이용한 아가로스로부터 아가로올리고사카라이드의 효소적 생산방법
CN109355274B (zh) 一种对胰蛋白酶和胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶
CN104560917B (zh) 一种β-葡萄糖苷酶和β-葡萄糖苷酶突变体及应用
CN103352031A (zh) 一种糖基转移酶基因及应用
Devi et al. Production of biopolymer levan by Bacillus subtilis using non-ionic surfactants
CN109609485A (zh) 一种甲壳素脱乙酰酶及其应用
CN104087604A (zh) 一种菊糖果糖转移酶基因表达序列
CN105861403B (zh) 一种高效分泌表达溶解性多糖单加氧酶cbp21的重组菌及其应用
CN104611284A (zh) 一种环糊精葡萄糖基转移酶生产菌株及其应用
CN102212500B (zh) 一种编码转录调控因子的基因的应用
CN109371003B (zh) 一种对胃蛋白酶抗性提高的β-葡萄糖苷酶
CN115478061A (zh) 纤维素酶突变体及其组合物
CN113736807B (zh) 一种纤维二糖水解酶及其编码基因与应用
CN112481235B (zh) Trdrs2蛋白及其相关生物材料在调控里氏木霉合成和分泌蛋白能力中的应用
CN103695453B (zh) 一种编码巯基-二硫键氧化还原酶基因的应用

Legal Events

Date Code Title Description
C06 Publication
PB01 Publication
C10 Entry into substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
C14 Grant of patent or utility model
GR01 Patent grant
C17 Cessation of patent right
CF01 Termination of patent right due to non-payment of annual fee

Granted publication date: 20090819

Termination date: 20131020