CN105063131B - 一种利用发酵液分割法提高发酵罐使用效率的糖化酶发酵工艺 - Google Patents

Abstract

一种利用发酵液分割法提高发酵罐使用效率的糖化酶发酵工艺，属于酶工程和发酵工程技术领域。本发明是在黑曲霉GB0506糖化酶发酵酶活线性增长末期，将发酵液分配到几个未使用的发酵罐中，加新鲜发酵培养基继续发酵，确定发酵液分割的最佳时机为发酵118‑120小时，最佳分割方式为1罐分割为3罐。与原有工艺相比，采用该法获得的发酵液最终发酵酶活没有明显变化，但平均每一发酵罐在罐发酵时间大幅下降，极大节约发酵过程电能消耗。本发明还提供一种针对将发酵液平均分配到3个发酵罐的发酵罐组合使用方法，在相应工艺条件下，单位发酵体积的发酵强度提高54%以上。利用发酵液分割法的糖化酶发酵新工艺为酶制剂生产企业在原有设备基础上大幅提高发酵罐使用效率。

Description

一种利用发酵液分割法提高发酵罐使用效率的糖化酶发酵 工艺

技术领域

本发明涉及一种利用发酵液分割法提高发酵罐使用效率的糖化酶发酵工艺，属于酶工程和发酵工程技术领域。

背景技术

糖化酶能从淀粉链的非还原性末端切开α-1,4葡萄糖苷键，是淀粉制糖工艺中最重要的酶制剂，广泛地应用于食品、医药、发酵、纺织等工业，是世界上生产量最大应用范围最广的酶制剂产品之一。由于淀粉分子在低温下形成结构紧密的晶体而高温下又容易糊化，因此实际生产中，往往利用淀粉酶将淀粉分解为相对分子量较小的糊精再进一步用糖化酶将糊精彻底分解为葡萄糖。在现代制糖工业中，黑曲霉糖化酶与细菌α-淀粉酶和普鲁兰酶配合使用可以使淀粉几乎全部水解得到葡萄糖含量在97%以上的葡萄糖糖浆，经结晶可以达到医用葡萄糖的要求。黑曲霉糖化酶的最适pH为4.5，在50~60℃可以长时间保持高水解活力，这一条件既能够避免糖化反应过程杂菌的污染又能避免葡萄糖与蛋白质等发生化学反应，有利于得到纯净的葡萄糖。上述特点使黑曲霉来源的糖化酶在淀粉制糖工业中具有不可替代的作用。除制糖外，糖化酶还在酿酒、发酵等多个行业有着广泛的应用。

糖化酶的生产菌种黑曲霉是一种丝状真菌，发酵时其种子的制作需要从孢子开始，而黑曲霉生产菌经过多年的诱变育种其孢子形成和萌发的能力均已严重退化，同时其发酵前期菌体生长速度也较慢，因此糖化酶的生产周期较长，一般从制种到放罐的整个过程耗时在28天以上，发酵时间一般在5天以上。

在前期工作中，采用DNA重组的方法，对一株黑曲霉生产菌CICIM F0410进行改造，获得了一批糖化酶基因拷贝数提高的菌株。其中编号为GB0506的菌株在摇瓶发酵条件下糖化酶发酵酶活比出发菌CICIM F0410提高约17.5%。（发表论文：姚婷婷等. 携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究. 生物工程学报，2006年7月，22(4): 567-571）。在发酵罐发酵条件下，GB0506发酵水平也有所提高。与出发菌黑曲霉CICIM F0410相比，黑曲霉GB0506在发酵罐发酵条件下发酵过程虽然没有延长但其前期用于菌体生长的时间明显延长，菌体生长阶段占用发酵罐时间很长，一般在发酵进行到第四天时其发酵液酶活依然在5000 U/mL以下，这一特点使该菌株在实际生产中发酵时间不能缩短，生产周期长并缺乏灵活性。与此相比，由于黑曲霉CICIM F0410在发酵到第5天时发酵酶活一般已经与最高酶活接近，因此在实际生产中，在生产任务紧张时可以提前放罐。上述原因导致黑曲霉GB0506虽然发酵酶活比黑曲霉CICIM F0410有所提高，但在实际生产中未能得到广泛的应用。

针对黑曲霉GB0506的特点，本发明主要利用发酵中后期发酵液分割的方法，对分割时机和分割方式进行优化，获得了一种可以延长黑曲霉GB0506发酵过程中糖化酶快速线性增长阶段的方法。该方法可以大幅度提高发酵罐利用效率，缩短平均发酵周期，达到既提高产量又实现节能的目标，创造了一种适合于黑曲霉GB0506的发酵新工艺。

发明内容

本发明的目的是利用发酵液分割和发酵罐组合使用的方法提高黑曲霉GB0506糖化酶发酵中发酵罐利用效率，降低发酵过程电能消耗。

本发明的技术方案，一种利用发酵液分割法提高发酵罐使用效率的糖化酶发酵工艺，针对糖化酶生产菌黑曲霉GB0506发酵前期菌体生长时间长并存在一个特殊的酶活快速增长期的特点建立的，步骤为：在黑曲霉GB0506糖化酶发酵酶活线性增长末期：即在采用酶活为1200 -1400 U/mL的种子培养液按10%接种量接种到发酵培养基的条件下，当发酵进行到118-120小时的时候；将发酵液平均分配到3个发酵罐中，添加新鲜发酵培养基继续发酵40-42小时至发酵终点。

所述利用发酵液分割法提高发酵罐使用效率的糖化酶发酵工艺，其特征在于：所述斜面培养基为经改良的查氏培养基，即在查氏培养基中添加0.2%酵母粉与1%玉米淀粉，pH 5.8；

查氏培养基：硝酸钠 3g，磷酸氢二钾 1g，硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1L，121℃灭菌15 min；

种子培养基：玉米淀粉8%，豆饼粉2%，硫酸铵0.5%，氯化钙0.01%，用自来水配制，灭菌前用中温淀粉酶液化培养基；一级和二级摇瓶种子培养基，种子罐种子培养基均采用上述种子培养基；

发酵培养基：玉米淀粉18%，豆饼粉 2.8 %，玉米浆1.5%，硫酸铵 0.5%，氯化钙0.01%，用自来水配制，灭菌前用中温淀粉酶液化培养基；发酵罐发酵过程用氨水维持pH4.5-5.0；补料时使用的发酵培养基与上述发酵培养基相同。

将发酵液分配到几个未使用的发酵罐中，添加新鲜发酵培养基继续发酵。与原有工艺相比，采用这一方法获得的发酵液最高酶活没有变化，但每一个发酵罐的平均使用时间大幅度下降，极大节约了发酵过程的电能消耗并提高了生产强度。其具体工艺为：

（1）发酵液分割工艺：

首先按糖化酶发酵的传统方法，当种子罐种子培养液酶活达到1200U/mL以上时按10%接种量接种至发酵罐发酵培养基。按照传统批式发酵法工艺，接种发酵罐发酵培养基后一般在第五天酶活线性增长结束，再发酵约24小时，即发酵进行至第六天时酶活达到最高水平，随后结束发酵。使用这一工艺时发酵罐一共使用了六天，144小时。

本发明在第五天（即118-120小时的时候）酶活线性增长刚结束时，将发酵液分割为3罐，再补充新鲜发酵培养基后继续发酵，在这一条件下，由于补充了新鲜发酵培养基，所以发酵液分割后酶活线性增长可以再维持一段时间。其中将发酵液分割为三罐的条件下（以下简称一分三工艺），酶活线性增长可以再维持约24小时，分割后维持发酵40-42小时酶活达到最高水平。这时结束发酵一共可以得到三罐发酵液。在这一新工艺条件下，第一个发酵罐的使用时间为162小时，后补充的两个发酵罐的使用时间仅为40-42小时，以发酵液分割后再发酵42小时计算，三个发酵罐平均单罐使用时间为82小时。

如果采用传统发酵工艺，将三个发酵罐分别接种种子培养基，则三个发酵罐均需要发酵144小时。采用新工艺后，在获得同样体积和发酵酶活的发酵液的前提下，平均单罐发酵时间缩短了62小时以上，即43%。同时，由于糖化酶发酵过程需要高强度的通风和搅拌，采用一分三工艺可以大幅度节省发酵过程中搅拌、通风等能量消耗。

（2）一分三工艺条件下的发酵罐组合使用方法

在前面介绍的发酵液分割工艺中，在发酵前期（酶活线性增长末端之前，即发酵前五天或从发酵开始到118-120小时的时候）只使用一个发酵罐培养菌体和发酵，另外两个发酵罐在近5天时间里处于等待状态，这显然不利于设备的充分利用，针对这一问题本发明建立了一套发酵罐组合使用的方法，组合使用5个发酵罐提高发酵罐使用效率。具体方法如下：

在黑曲霉GB0506糖化酶发酵中，组合使用5个编号分别为A、B、C、D、E的发酵罐，按每周一个循环进行发酵。其中A、B、C三个发酵罐轮流作为第一罐发酵（以下称一级发酵），按48小时一罐间隔接入种子培养液，D、E两个发酵罐固定用作发酵液分罐后发酵（称二级发酵）。

一个一级发酵罐发酵至糖化酶酶活线性增长末期：即发酵进行到118-120小时的时候，将发酵液各1/3分配到已经准备好新鲜发酵培养基的D、E二级发酵罐中，再从联消器储罐分配相当于2/3发酵液体积的新鲜发酵培养基至只剩下1/3体积发酵液的该一级发酵罐中，三个发酵罐一起进行二级发酵，再经40-42小时发酵后结束发酵。结束发酵后安排大约4-8小时间隔，可用于放罐、发酵罐清洗、培养基配制及灭菌等准备工作。该一级发酵罐接种新的种子培养液用于下一轮发酵；D、E发酵罐再次与另一个一级发酵罐一起进行发酵液分割及二级发酵。

D、E发酵罐每周使用三次，于每周日进行一天的清洗和检修。

按照一周一个循环的方式安排发酵，一般可以按以下方式进行具体安排。在周一早晨8点，将上周三早晨接种种子培养液已经培养了5天的A发酵罐发酵液各1/3分割到D、E发酵罐中，然后与D、E罐一起进行分割后的二级发酵。发酵40-42小时后，至周三凌晨约2点A罐与D、E罐均达到发酵终点，一起放罐，放罐后有大约6小时间隔时间可用于发酵罐清洗、培养基灭菌等工作。周三早晨8点已经重新准备好新鲜发酵培养基的A罐再次接入种子培养液，培养至下周一再次用于下一轮发酵液分割及二级发酵。B发酵罐发酵液应该在上一周的周五早晨8点接入种子培养液，培养至本周三早晨与D、E发酵罐一起进行发酵液分割及二级发酵，于本周五凌晨约2点与D、E罐一起放罐，然后B发酵罐于周五早晨8点再次接种种子培养液，培养至下周三再次用于下一轮发酵液分割及二级发酵。C发酵罐发酵液应该在上一周的周日早晨8点接入种子培养液，培养至本周五早晨8点用于发酵液分割及二级发酵，并于本周日凌晨约2点放罐，放罐后C发酵罐在同一天早晨8点再次接入种子培养液用于下一轮发酵，一般是培养至下一周的周五用于发酵液分割及二级发酵。发酵罐D、E在周日凌晨放罐后可以安排1天的时间进行检修及准备工作，下周一上午再次用于下一循环的二级发酵。

按上述方法操作每周7天可以获得9罐糖化酶发酵液，平均每天获得9/7罐。与此相对应，如果采用原有的发酵工艺用5个发酵罐同时进行发酵，发酵周期为6天，即使不计算发酵结束后需要的休整时间，5个发酵罐6天只能获得5罐发酵液，平均每天获得发酵液5/6罐。在发酵液分割新工艺下，结合使用发酵罐组合使用方法，单位体积发酵罐的实际发酵强度可以提高54%。

综上所述，利用黑曲霉GB0506菌株进行糖化酶发酵时，利用本发明提供的方法既可以大幅度提高单位体积发酵罐生产强度又可以大幅度降低单位发酵液消耗的电力。

本发明的有益效果：本发明是针对黑曲霉GB0506的特殊的发酵性质而建立的，在使用黑曲霉GB0506进行糖化酶发酵时，与采用传统的糖化酶批式发酵法相比，采用本发明提供的方法可以大幅度提高单位发酵罐体积的发酵强度，缩短平均单罐发酵时间，在生产同样数量糖化酶产品的基础上节约电能消耗。本发明提供的发酵液分割及发酵罐组合使用方法对其他菌体生长周期长的微生物液体发酵技术也有参考意义。

生物材料样品：糖化酶生产菌黑曲霉 CICIM F0410、黑曲霉GB0506均由江南大学中国高校工业微生物资源和信息中心(http://www.cicim-cu.jiangnan.edu.cn)提供。黑曲霉 CICIM F0410、黑曲霉GB0506均为糖化酶生产菌株，在《姚婷婷等. 携多拷贝glaA的重组黑曲霉过量合成糖化酶的研究. 生物工程学报, 2006, 7，22(4): 567-571》已公开。黑曲霉GB0506，申请人保证从申请日起二十年内向公众发放该生物材料。

附图说明

图1 黑曲霉GB0506与CICIM F0410的15 L发酵罐发酵进程比较。

图2 黑曲霉GB0506的2吨发酵罐发酵进程曲线。

图3 发酵液分割时机对分割后发酵进程的影响。

图4 一分三工艺发酵酶活增长曲线。

具体实施方式

通过实施例对本发明作进一步说明，实施例将不以任何方式限制本发明的范围。

实施例1：黑曲霉GB0506的15 L发酵罐发酵特点

将糖化酶生产菌黑曲霉CICIM F0410和黑曲霉GB0506接种改良查氏培养基，培养15天，取孢子接种500mL摇瓶种子培养基，培养2~3d，当糖化酶酶活达到20U/mL时，按10%接种量接种二级摇瓶种子培养基（1.5L摇瓶，单瓶装液量为200mL，共计5瓶），培养至酶活约为100U/mL以上时按10%接种量接种15L发酵罐发酵培养基（发酵罐装液量为10L）。共进行10次实验，结果两株菌15L发酵罐发酵最高酶活均出现在第六天，10次实验的平均数据曲线如图1所示。

改良的查氏培养基，即在查氏培养基中添加0.2%酵母粉与1%玉米淀粉，pH 5.8；

查氏培养基：硝酸钠 3g，磷酸氢二钾 1g，硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，硫酸亚铁0.01g，蔗糖30g，琼脂20g，蒸馏水1L，121℃灭菌15 min；

由图1可见，黑曲霉GB0506的发酵最高酶活为27500 U/mL，而黑曲霉CICIM F0410的最高酶活为26100 U/mL。黑曲霉GB0506的发酵酶活稍高于黑曲霉CICIM F0410。但从发酵酶活曲线看，黑曲霉CICIM F0410从第2天（48小时的时候）开始酶活就以比较快的速度持续增长，并一直持续约3天时间，在第5天接近最高酶活，在生产任务紧张时也可以直接放罐，马上进行下一轮发酵，因此生产安排具有很大的灵活性，在电力紧张时具有节约电能的潜力。而黑曲霉GB0506在发酵的前4天酶活均远低于CICIM F0410，在第4天到第5天之间存在一个特有的酶活快速线性增长的阶段，但这个酶活线性增长的阶段只能维持24小时，在第五天就结束了。根据上述情况，如果在黑曲霉GB0506发酵的第5天，酶活快速线性增长阶段即将结束时及时补充新鲜培养基则有可能使这个酶活线性增长的阶段得到延续从而提高糖化酶的产量。单个发酵罐的容量是有限的，如果将已有的发酵液分割成几份，分配到几个发酵罐中，则可以补加大量发酵液，这有可能使这个黑曲霉GB0506发酵特有的酶活快速线性增长阶段得到延伸。

实施例2： 15L发酵罐发酵液分割时机的确定

为确定15 L发酵罐发酵液分割的最佳时机，分别在第3、4、5、6天的时间进行发酵液分割，将发酵液平均分割为3罐，再用发酵培养基补充体积至10 L。分别各进行10次平行试验，平均结果如表1所示。

表1 一分三工艺发酵液分割时机对发酵进程的影响

注：分割时机表示进行发酵液分割的时间点

由表1可见，在酶活线性增长阶段或此阶段之前进行发酵液分割（也就是在发酵进行到第3-5天时进行发酵液分割），则总发酵时间的延长并不多，发酵液分割为3罐后单罐总发酵时间比不分割的情况延长约10-18小时。在酶活达到最高点后（即第六天时）进行发酵液分割则分割后需要进行较长时间的发酵才能达到酶活最高点，这可能与这一时间点菌体生长停滞，代谢活力下降有关。从上述实验结果看，酶活线性增长刚结束时是最适合的进行发酵液分割的时机。因此15 L发酵罐发酵液分割时间确定在第5天，即发酵进行到大约120小时的时候。

同样，将发酵液分割为4罐，平均结果如表2所示。

表2 一分四工艺发酵液分割时机对发酵进程的影响

由表2可见，在酶活线性增长阶段或此阶段之前将发酵液分割为4罐，则分割后总发酵时间比不分割的情况延长34-35h。发酵液分割为4罐后，分割后发酵时间要比分割为3罐的情况长很多，这可能是由于这种分割为4罐的工艺使原有发酵液过度稀释，分割后菌体需要一个较长的阶段适应发酵液的新环境。以第五天分割发酵液的情况为例，采用一分四工艺则新增加的3个发酵罐需要的发酵总时间为61小时。第一个发酵罐发酵总时间为181小时，后补充的另外3个发酵罐发酵的时间为61小时，四个罐使用的时间总和为181+61×3=364小时，平均单罐使用时间为91小时。可见一分四工艺对发酵罐的使用效率低于一分三工艺。

可见，以黑曲霉GB0506为菌种进行糖化酶发酵时，将发酵液分割为4罐的工艺是不合适的，发酵液分割数不宜超过3罐。

同样，将发酵液分割为2罐，平均结果如表3所示

表3 一分二工艺发酵液分割时机对发酵进程的影响

注：分割时机表示进行发酵液分割的时间点

由表3可见，在酶活线性增长阶段或此阶段之前将发酵液分割为2罐，则分割后总发酵时间比不分割的情况延长8-12 h。发酵液分割为2罐后，分割后发酵时间要比分割为3罐的的情况稍短。以第五天分割发酵液为2罐的方法为例，分割后发酵时间为36小时，其中新增加的1个发酵罐的总的使用时间为36小时，而原有发酵罐的使用时间为156小时，两个发酵罐使用的总时间为36＋156=192小时，平均单个发酵罐使用时间为96小时，可见采用一分二工艺对发酵罐的使用效率明显低于一分三工艺。结合本实施例对一分四工艺的分析可见，对于以黑曲霉GB0506为菌种进行糖化酶发酵时，将发酵液分割为3罐的工艺最有利于发酵罐使用效率的提高。

实施例3：2吨发酵罐发酵液分割工艺的建立

上述实施例是在小型发酵罐上进行的，其所获得的参数无法直接用于大生产，为此进一步在2吨发酵罐中试规模上进行了试验及优化。

首先要确定的是在2吨发酵规模上最佳的种子罐转种时机。根据以往的经验，以培养时间作为种子培养液的成熟程度的指标在实际生产中很难获得稳定的结果，因为种子培养过程中酶活的增长一般不太稳定，而以种子培养液的酶活作为指标则能够获得比较稳定的发酵结果，故我们以酶活为种子培养液成熟度的指标进行了不同成熟度种子培养液接种的发酵试验。将黑曲霉GB0506接种改良查氏培养基，培养15天，取孢子接种500mL一级摇瓶种子培养基，培养2~3d，当糖化酶酶活达到20U/mL时，按10%接种量接种二级摇瓶种子培养基（1.5L摇瓶，单瓶装液量为200mL，共计8瓶），培养至酶活约为100U/mL以上时按1%接种量，接种300L种子罐种子培养基（装液量为160L），当糖化酶酶活达到800-1600U/mL时接种2吨发酵罐发酵培养基（装液量为1.6 吨）。每一个条件进行3批次实验，平均结果如表4所示。

表4 不同成熟度种子培养液对发酵结果的影响

由表4可见，在种子液酶活为1000-1400U/mL的时候转种，则发酵酶活最高，均在48500U/mL以上，但酶活1000U/mL时转种则发酵时间需要延长24小时，虽然最终酶活有10U/mL的增加，但考虑动力消耗等则没有实际意义，据此确定种子液转种的最佳时机为酶活达到1200-1400U/mL的时候，考虑到节约种子液发酵时间，一般以酶活达到1200U/mL为最佳，与此对应的种子罐种子液培养时间大约为72小时，具体转接时机应该根据种子液酶活实际检测结果确定。

在上述条件下，即当种子罐种子培养达到1200U/mL时进行种子液转种，共进行5次2吨发酵罐发酵实验，结果2吨发酵罐发酵最高酶活均出现在第六天，其中酶活最高的一批为49000U/mL，最低的一批为47210U/mL，5次实验的平均数据曲线如图2所示。

根据15L发酵罐发酵试验，发酵液分割的最佳时机是酶活线性增长末端。从图2可见，在2吨发酵罐发酵试验中，第5天即120 h是酶活线性增长末端，发酵液分割的最佳时机应该在120 h左右。据此，选择120 h及115 h及125 h进行发酵液的分割，进行1罐分割为3罐的试验，分割后发酵酶活进程曲线如图3所示。

由图3可见，发酵液分割时机对分割后发酵进程有明显影响。在120小时进行发酵液分割最有利于酶活的快速增长，分割后只需要42小时就可以达到最高酶活，最高酶活为48500U/mL。分割时机太早或太晚均会出现一个较长时间的酶活增长缓慢期。在130小时进行发酵液分割虽然最终发酵酶活稍高于120小时分割的情况，但达到最高酶活所需要的时间延长至分割后第50小时，影响发酵罐利用率，增加电力消耗。

进一步在120小时左右进行更为精细的实验，结果如表5所示。

表5 发酵液分割时机对发酵进程的影响

注：分割时机表示进行发酵液分割的时间点

由表5可见，发酵液分割时机选择在发酵进行到114-124 h之间时，分割后的最高发酵酶活均在48500U/mL以上，差异很小，但发酵时间的差异较大，在118-120 h之间进行发酵液分割，则分割后的发酵时间最短，只需要42小时。按其他时机进行分割则分割后发酵时间均有所增加，可见最佳的分割时机是发酵进行到118-120小时的时候。

综上所述，本发明获得的黑曲霉GB0506发酵生产糖化酶的最优化的发酵液分割工艺为：当种子液发酵酶活达到1200U/mL时，按照10%的接种量接种2吨发酵罐发酵培养基（装液量为1.6吨），在发酵进行到118-120小时的时候进行发酵液分割，每一罐发酵液平均分割为3罐。图4是某1次典型的一分三工艺条件下，第一个发酵罐中酶活变化的记录。

由图4可直观的看到，在一分三工艺条件下，在发酵进行到120小时的时候，将发酵液平均分配到3个发酵罐中，原发酵罐在补充发酵培养基后，酶活被稀释，降为原来的1/3，但酶活的快速线性增长阶段又维持了大约24小时，在分罐后总计大约40小时（分罐过程使用了大约1小时）后获得的发酵液酶活为48550U/mL，与正常发酵获得的酶活相当。在后补充的两个发酵罐中，酶活增长情况相似，即使用了大约40小时酶活增长到48000U/mL以上，因此实际上得到了3罐发酵液。

在上述最优化的发酵条件下，用编号为A、D、E的三个2吨发酵罐进一步进行了3次发酵试验。试验均以种子培养液接种A发酵罐进行发酵，当A发酵罐的发酵进行到118-120小时的时候，将各1/3体积的发酵液通过无菌管道分配到D，E发酵罐中（D、E发酵罐事先已经准备了相当于2/3发酵体积的无菌发酵培养基），再从连消器储罐分配相当于2/3发酵液体积的无菌发酵培养基到A发酵罐中，继续进行分割后的发酵。三次分割发酵的结果如表6所示。

表6 2吨发酵罐一分三工艺试验结果

注：分割后发酵时间是指发酵液分割后达到最高酶活的时间，发酵终点酶活是指发酵达到的最高酶活。

由表6可见，三次实验的发酵酶活均在48000U/mL以上。

实施例4：采用1罐分割为3罐工艺条件下的发酵罐组合使用

使用5个2吨发酵罐按照1罐发酵液分割为3罐工艺（以下简称一分三工艺）进行中试规模的试生产，其中A、B、C三个发酵罐轮流作为第一罐发酵（以下称一级发酵）按48小时一罐间隔进行种子罐种子接种，D、E两个发酵罐固定用作发酵液分割后发酵（称二级发酵）。一级发酵至120小时将发酵液各1/3分配到已经准备好无菌发酵培养基的D、E二级发酵罐中，再从联消器储罐分配相当于2/3发酵体积的发酵培养基至只剩下1/3体积发酵液的一级发酵罐中，三个发酵罐经40-42小时发酵后结束发酵。结束发酵后安排大约6小时间隔，可用于放罐、发酵罐清洗、培养基灭菌等准备工作。D、E发酵罐每周使用三次，于每周日进行一天的清洗和检修。

按照1周一个循环的方式安排发酵，下文具体叙述。为便于叙述和理解，以一周的周一早晨8点至下一周的周一早晨8点为一个循环，称为一周，并叙述其中一周的发酵安排，这一周称为本周。

在本周一早晨8点，将已经培养了5天的A发酵罐发酵液各1/3分割到D、E发酵罐中，然后与D、E罐一起进行分割后的二级发酵。其中A发酵罐是在上周三早晨8点接入的种子培养液。本周三凌晨约2点A罐与D、E罐均达到发酵终点，一起放罐，放罐后有大约4-8小时间隔时间可用于发酵罐清洗、培养基灭菌等工作。周三早晨8点A罐再次从种子罐接入种子培养液，培养至下周一再次用于下一轮发酵液分割及二级发酵。B发酵罐发酵液应该在上一周的周五早晨8点从种子罐接入种子培养液，培养至本周三早晨用于发酵液分割及发酵，于本周五凌晨约2点与D、E罐一起放罐，然后于周五早晨8点再次接种种子培养液，培养至下周三再次用于下一轮发酵液分割及二级发酵。C发酵罐发酵液应该在上一周的周日早晨8点接入种子培养液，培养至本周五早晨8点用于发酵液分割及二级发酵，并于本周日凌晨约2点放罐，放罐后C发酵罐在同一天早晨8点再次接入种子培养液用于下一轮发酵，一般是培养至下周五用于发酵液分割及二级发酵。发酵罐D、E在周日凌晨放罐后可以安排1天的时间进行检修及准备工作，下周一上午再次用于下一循环的发酵。采用一分三发酵工艺后，一次发酵使用三个发酵罐，其中一级发酵罐使用时间一般为162小时，两个二级发酵罐发酵时间均只有42小时，三个发酵罐使用的总时间为246小时，平均单罐发酵时间仅为82小时，而采用传统发酵工艺三个发酵罐均需要使用144小时，因此使用发酵液分割工艺可以在获得同样数量和酶活发酵液的前提下大幅度缩短发酵罐使用时间。由于糖化酶发酵过程需要高强度的通风和搅拌，在一分三工艺中，平均每一个发酵罐的发酵时间缩短了62小时，相应的可以大幅度节省发酵过程中搅拌、通风等能量消耗。

由于糖化酶的发酵操作相对简单、不容易发生染菌，对上述操作连续进行了2周，成功进行了6次分罐发酵，共计成功获得18罐糖化酶发酵液，其中最高酶活为48990 U/mL，最低酶活为47900 U/mL，平均为48581 U/mL。平均每周可获得9罐发酵液，每天为9/7罐。与此相对应，如果采用原有的发酵工艺，发酵周期为6天，即使不考虑准备工作的时间，5个发酵罐6天也只能获得5罐发酵液，平均每天获得5/6罐。因此在新工艺条件不需要增加发酵罐设备，糖化酶的生产能力可以提高54 %。

Claims (1)

1.一种利用发酵液分割法提高发酵罐使用效率的糖化酶发酵工艺，针对糖化酶生产菌黑曲霉GB0506发酵前期菌体生长时间长并存在一个特殊的酶活快速增长期的特点建立的，其特征在于：在黑曲霉GB0506糖化酶发酵酶活线性增长末期：即在采用酶活为1200 -1400U/mL的种子培养液按10%接种量接种到发酵培养基的条件下，当发酵进行到118-120 小时的时候；将发酵液平均分配到3个发酵罐中，添加新鲜发酵培养基继续发酵40-42小时至发酵终点；

采用发酵罐组合使用的方法，组合使用5个发酵罐提高发酵罐使用效率，具体工艺如下：

在黑曲霉GB0506糖化酶发酵中，组合使用5个发酵罐，编号为A~E，按每周一个循环进行发酵；其中A、B、C三个发酵罐轮流作为第一罐发酵，即一级发酵，按48小时一罐间隔接入种子培养液，D、E两个发酵罐固定用作发酵液分割后发酵，即二级发酵；

一个一级发酵罐发酵至糖化酶酶活线性增长末期：即发酵进行到118-120小时的时候，将发酵液各1/3分配到已经准备好新鲜发酵培养基的D、E二级发酵罐中，再从联消器储罐分配相当于2/3发酵液体积的新鲜发酵培养基至该一级发酵罐中；

三个发酵罐一起进行二级发酵，再经40-42小时发酵后结束发酵；结束发酵后安排4-8小时间隔，用于放罐、发酵罐清洗、培养基配制及灭菌工作；该一级发酵罐接种新的种子培养液用于下一轮发酵；D、E发酵罐再次与另一个一级发酵罐一起进行发酵液分割及二级发酵；

以一周为一个循环的方式安排发酵，采用如下方式进行安排：

A发酵罐在每周三早晨接种种子培养液，发酵至下一周的周一早晨，与D、E罐进行发酵液分割并进行二级发酵；40-42小时后，A罐与D、E罐一起放罐；周三早晨A罐再次接入种子培养液，培养至下一周的周一再次用于下一循环的发酵液分割及二级发酵；B发酵罐在每周五早晨接种种子培养液，发酵至下一周的周三早晨，与D、E罐进行发酵液分割并进行二级发酵，于周五凌晨B罐与D、E罐一起放罐；于周五早晨再次接入种子培养液，发酵至下一周的周三再次用于下一循环的发酵液分割及二级发酵；C发酵罐在周日早晨接种种子培养液，发酵至下一周的周五早晨，与D、E罐进行发酵液分割并进行二级发酵，于周日凌晨C罐与D、E罐一起放罐；于周日早晨再次接种种子培养液，发酵至下一周的周五再次用于下一循环的发酵液分割及二级发酵。

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