CN111205991B

CN111205991B - 一种发酵生产左旋虾青素的方法

Info

Publication number: CN111205991B
Application number: CN202010118954.8A
Authority: CN
Inventors: 王玉华; 张晶; 李清儒; 卢彦宏; 刘佳欢; 李侠; 王秀娟
Original assignee: Jilin Agricultural University
Current assignee: Jilin Agricultural University
Priority date: 2020-02-26
Filing date: 2020-02-26
Publication date: 2022-08-16
Anticipated expiration: 2040-02-26
Also published as: CN111205991A

Abstract

本发明公开了一种发酵生产左旋虾青素的方法，它包括：1）取红发夫酵母菌，活化，接种，摇床培养；2）离心，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清得到酵母泥，加入盐酸溶液，震荡均匀，浸泡25~35 min，沸水浴4~5分钟，冰浴降温；在4000~6000 r/min下离心8~15 min去除盐酸溶液，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得破碎后细胞沉淀物；3）细胞沉淀物加入丙酮，避光震荡浸提，离心，收集上清液；4）干燥，加入甲醇，过C18柱，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，干燥，得到左旋虾青素；生产的虾青素含量为2.79 mg/g DCW，其中左旋虾青素占比为75.81±2.37%。

Description

一种发酵生产左旋虾青素的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产左旋虾青素的方法。

背景技术

虾青素（Astaxanthin），化学名称为3，3′-二羟基-β，β′-胡萝卜素-4，4′-二酮基，别名虾黄素，是酮式类胡萝卜素的一种，属于萜烯类不饱和化合物。其分子式C₄₀H₅₂O₄，相对分子量为596.86。类胡萝卜素可分为胡萝卜素和叶黄素，胡萝卜素主要包括β-胡萝卜素和α-胡萝卜素，而叶黄素主要包括玉米黄质，角黄素和虾青素。虾青素是600多种类胡萝卜素中的一种，是类胡萝卜素合成途径中的最终产物，分子结构中含有非常长的共轭双键和α-羟基酮，由于这些化学结构能够向自由基供应电子，从而使虾青素极易和自由基进行反应而清除了自由基，因其具有极强的抗氧化活性，被广泛应用于增强机体的免疫能力、抗癌、抗疲劳及预防骨质疏松等方面。并且最新的研究结果表明虾青素可保护脑组织免受缺血相关损伤和预防中枢神经系统疾病。自上世纪90年代至今，国内外科学界对虾青素引起高度关注并做了大量研究。虾青素的推出导致了抗氧化剂市场的革命，并且由于其独特的功能使其在医药、化妆品及饲料养殖等行业得到了广泛应用。虾青素有3种旋光异构体：左旋（3S，3’S）、消旋（3S，3’R）和右旋(3R，3’R)，具有最强的生物学活性，是“天然左旋虾青素”。

至今为止生产虾青素主要有三种途径：①化学合成法；②提取法；③微生物发酵法。

①化学合成法具有生产成本较低，产量高等优点，但是化学合成的虾青素只有25%左为左旋虾青素，动物机体只对左旋虾青素有较高的吸收利用率，抗氧化能力较低，而且不允许人体服用；

②提取法主要从水产品加工的废弃物中提取虾青素，提取前必须除去废弃物中的石灰质成分，提取费用高且容易污染，虾壳粉碎提取的虾青素是100%右旋虾青素，抗氧化性极低，对人体基本没有抗氧化作用；

③微生物发酵法主要有两种方式：一是利用藻类生产；二是利用酵母菌发酵生产。雨生红球藻因为虾青素含量高、而且全部为左旋结构已经成为国内外虾青素研究的热点，但其存在培养周期长（一般为 25-30天），细胞生长慢、生物量低，需要光照，生产场所受到限制，易污染，藻类破壁释放虾青素产率低，生产成本高等弊端。1976年，Andrewes等人在红发夫酵母中发现了虾青素，并且红发夫酵母为自然界中虾青素含量最多的菌株。红发夫酵母作为富含虾青素的微生物之一，具有以下几个优势：安全、无毒；可以利用多种糖类作为碳源；培养周期较短；可以进行高密度发酵培养；不需要光照；对环境无污染，这些优势利于工业生产。倪辉在《利用淀粉糖作碳源培养法夫酵母生产虾青素的研究》论文中报道以麦芽糖浆、果葡糖浆、标准糖浆3种淀粉糖为碳源进行发酵试验，但以标准糖浆为碳源的虾青素含量高于其它2种淀粉糖，达到0.38 mg虾青素/g干酵母；杨静在《红发夫酵母摇瓶培养条件的优化》一文中发现摇瓶培养正交试验优化条件下，得到最适糖质量分数4%，温度29℃，装液量30 mL，pH为9时，红发夫酵母的虾青素含量为0.70 μg/g，提高了66%。

但是目前报道的红法夫酵母生产虾青素多为右旋结构。张瑞莲在《左旋、右旋及外消旋虾青素抗脂质过氧化活性差异的研究》中报道，红法夫酵母合成的虾青素95%以上为3R,3´R（右旋结构）。

Andrewes等人在《(3R, 3'R)-astaxanthin from the yeast Phaffia rhodozyma》一文中分析了红发夫酵母中虾青素的构象，发现92%的异构体是右旋(3R，3’R)；而Gladis N. Coral-Hinostroza在《Plasma appearance of unesterified astaxanthingeometrical E/Z and optical R/S isomers in men given single doses of amixture of optical 3 and 3'R/S isomers of astaxanthin fatty acyl diesters》一文中研究表明左旋虾青素可被生物体很好的消化吸收；Chung-Chih Tseng在《Metabolicengineering probiotic yeast produces 3S, 3′S-astaxanthin to inhibit B16F10metastasis》一文中认为3S，3'S构型的虾青素是世界上清除自由基的最强大的抗氧化剂；金超在《转基因法夫酵母高产 3S, 3'S 虾青素的研究》一文中将外源的 β-胡萝卜素酮基酶和 β-胡萝卜素羟化酶基因转入红发夫酵母产 β-胡萝卜素突变株内，在转化子内积累了3S, 3'S 构型的虾青素，经过培养基优化后，红发夫酵母总类胡萝卜素产量达到 580 μg/gDCW，同时3S, 3'S构型的虾青素含量占到了17.22%。

发明内容

本发明目的是为解决现有技术发酵法生产虾青素产量低、成本高的问题，而提供一种成本低、操作简单的高产左旋虾青素的红发夫酵母Phaffia rhodozyma PR106及其生产左旋虾青素的方法。

红发夫酵母Phaffia rhodozyma PR106在生产左旋虾青素方面的用途，所述的红发夫酵母的保藏编号为CCTCC M 2019083。

一种发酵生产左旋虾青素的方法，它包括：

1）取红发夫酵母菌，活化，按1~10%的接菌量接种到发酵培养基，在20~28℃、150~270 r/min下摇床培养48~96 h，得发酵液；

2）将发酵液在4000~6000 r / min、0~4 ℃下离心8~15 min，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清得到酵母泥，加入所述发酵液的15~30%体积的3 mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡25~35 min，沸水浴4~5分钟，冰浴降温；在4000~6000 r / min下离心8~15 min去除盐酸溶液，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得破碎后细胞沉淀物；

3）细胞沉淀物加入丙酮，在避光条件下震荡浸提1~3min，4000~6000 r/min离心8~15min，收集上清液，得到色素丙酮浸提液；

4）色素丙酮浸提液干燥，加入甲醇，过C18柱，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，干燥，得到左旋虾青素。

步骤1）所述的红发夫酵母菌的保藏编号为CCTCC M 2019083；

步骤1）所述的发酵培养基，它的重量组分为：酵母浸粉1~8g、麦芽浸粉1~8g、蛋白胨4~10g、葡萄糖10~70g、无机盐0.01~1g、TiO₂0.1~1g、水1.0kg；

步骤1）所述的在20℃、180r/min下摇床培养72 h。

步骤4）所述的干燥为减压浓缩干燥。

本发明提供了一种发酵生产左旋虾青素的方法，它包括：1）取红发夫酵母菌，活化，接种，摇床培养；2）离心，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清得到酵母泥，加入盐酸溶液，震荡均匀，浸泡25~35 min，沸水浴4~5分钟，冰浴降温；在4000~6000 r / min下离心8~15 min去除盐酸溶液，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得破碎后细胞沉淀物；3）细胞沉淀物加入丙酮，避光震荡浸提，离心，收集上清液；4）干燥，加入甲醇，过C18柱，再用甲醇洗脱，收集洗脱液，干燥，得到左旋虾青素；生产的虾青素含量为2.79 mg/g DCW，其中左旋虾青素占比为75.81±2.37%，3S, 3'S构型（左旋）的虾青素含量为2.12 mg/g DCW左右，3R，3’R构型（右旋）的虾青素含量为0.67 mg/g DCW左右。

附图说明

图1 菌株的rDNA基因D1D2区序列测定结果及其系统发育树；

图2 显微镜观察的细胞形态；

图3 优化虾青素生产方法的单因素试验结果；培养基对红发夫酵母生物量和虾青素产量的影响，（A）酵母浸粉，图（B）麦芽浸粉，图（C）蛋白胨，图（D）葡萄糖；

图4 高效液相色谱法测定虾青素的色谱峰；

图5 高效液相色谱法测定虾青素的含量。

具体实施方式

实施例1 红发夫酵母菌种的制备

1.培养基的制备

1）YPD培养基：酵母浸粉1.0-8.0 g，麦芽浸粉1.0-8.0 g，蛋白胨4.0-10.0 g，葡萄糖10.0-70.0 g，琼脂20.0-50.0 g，自来水1.0 L；

2）YEPD培养基：酵母浸粉2.0 g，麦芽浸粉3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，自来水1.0L。

2.菌株的制备

采集吉林农业大学果园土壤，将该果园土壤接种于YPD培养基平板，20-28℃恒温培养48-96 h，选择红色菌落接种于YEPD培养基中，进行20-28℃恒温摇床150-270r/min培养48-96 h，进行虾青素含量测定，获得虾青素含量较高的菌株，然后进行菌体形态、生理生化及26S rDNA鉴定。

3.菌种培养

菌种活化：挑取-20℃甘油保存摇瓶培养后的菌种进行划线培养，在生化培养箱中20-28℃条件下培养，7 d后选取大而颜色深的单菌落接入液体培养基中，液体培养基121℃条件下灭菌15 min，菌种在20-28℃、150-270 r/min培养48-96h，按此步骤传三代。

发酵培养：使用液体培养基，接菌量1-10%，在摇床中18-28℃、120-300 r/min的条件下培养48-96 h。

4.菌种鉴定

1）理化特征鉴定

用不同的碳源和氮源发酵确定菌株的生长条件，研究其理化特征；见表1。

2）26s rRNA序列的确定

通过上海生工公司对菌种进行鉴定，首先提取菌株基因组DNA，按SK8257试剂盒操作；然后进行PCR扩增，菌株扩增引物为：

NL1(forward):5’-GCATATCAATAAGCGGAGGAAAAG-3’，

NL4(reverse):3’-GGTCCGTGTTTCAAGACGG-5’；

1%琼脂糖电泳，150 V、100mA、20 min电泳观察。PCR产物电泳条带切割所需DNA目的条带，PCR产物用PCR引物直接测序。菌株26s rRNA RNA长度为522bp，将测得的26s rDNA序列与核糖体数据库http://rdp.cme.msu.edu/index.jsp中已有的26s rDNA序列比对，结果该菌株的26S rDNA 与酵母的26S rDNA具有较高的同源性（系统发育树见图1）。结合菌体形态（图2）和生理生化及26s rDNA序列分析结果确定该菌株为红发夫酵母（Phaffia rhodozyma），命名为红发夫酵母PR106，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2019年1月24日，地址湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC M 2019083。

实施例2 虾青素的提取纯化

1、虾青素提取

红发夫酵母PR106按1-10%的接菌量，接种到装有30mL YEPD液体培养基（1.0%葡萄糖、0.5%蛋白胨、0.2%酵母浸粉、0.3%的麦芽浸粉）的100mL三角烧瓶中，20℃、180r/min摇床培养72h；然后进行细胞破碎，取20mL发酵液装入50mL离心管中，5000r/min，4℃离心10 min收集沉淀得到菌体，用蒸馏水水洗离心弃上清三次后得到酵母泥，加入5 mL预配的3 mol/L的盐酸溶液，震荡均匀后浸泡30 min以酸化酵母细胞壁，沸水浴4-5 min，然后立即放到冰水中降温。将破壁细胞浆以5000 r/min 离心10 min去除盐酸，收集沉淀重复离心水洗3次弃上清，得细胞碎片；沉淀在4℃下储存，用于后期的测定。

采用丙酮萃取方法提取虾青素。取20 mL发酵液进行细胞破碎后加入5 mL丙酮，在避光条件下震荡浸提1 min，5000 r/min离心10min，收集上清液，得到色素丙酮浸提液，若是未完全提取，加入丙酮进行再次提取，直到细胞呈无色。

2、虾青素的纯化

每1.5 mL离心管中加入1 mL的提取液，45℃减压蒸干后加入100 µL甲醇溶解粗提品，取5 mL甲醇活化CNW C18 固相萃取柱，然后转移2 mL甲醇虾青素溶液至C18柱中。用10mL甲醇洗脱，分4次添加到柱中，收集全部洗脱液，45℃减压蒸干，得到虾青素1.39 mg/gDCW左右。

实施例3 高效液相色谱法分析虾青素

采用紫外检测器高效液相色谱法测定红发夫酵母PR106中虾青素的含量；色谱条件为：

色谱柱：与C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），或具同等性能的色谱柱；

流动相：乙腈:水=95:5，将1L的流动相中加入0.4 g的抗坏血酸，经0.45 μm膜过滤后备用；

流速：1.0 mL/min；

检测波长：471nm；

柱温：室温；

进样体积：20 μL；

等度洗脱，浓度不变。

制备的虾青素，每1.5 mL离心管加46 µL甲醇复溶，过0.22 nm的有机滤膜，作为待测样品检测；高效液相色谱法分析红发夫酵母PR106中虾青素的含量为1.39 mg/g DCW左右。

实施例4 红发夫酵母生产虾青素的培养基优化实验

1、单因素试验

液体培养基中酵母浸粉的量分别为1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 g/L；麦芽浸粉的量分别为2.0、3.0、4.0、5.0、6.0g/L；蛋白胨的量分别为5.0、6.0、7.0、8.0g/L；葡萄糖的量分别为10.0、12.0、14.0、16.0、18.0g/L，以上均为单一变量，改变某一物质的量时其他成分不变。按2%的接种量接种红发夫酵母，20℃、180 r/min的条件下培养72h，测定红发夫酵母的生物量及虾青素的量，平行测定3次；

2、正交试验

根据单因素试验优化出的酵母浸粉、麦芽浸粉、蛋白胨和葡萄糖的量，采用四因素三水平进行正交试验L₉(3⁴)，试验设计见表2；测定红发夫酵母的生物量及虾青素的量，平行测定3次；正交实验结果见表3。

表3 正交实验设计及结果

通过单因素试验和正交试验结果表明，麦芽浸粉和酵母浸粉对红发夫酵母生物量和虾青素积累量影响程度较显著并且主次顺序相同，而蛋白胨和葡萄糖对两者的影响程度则相反；最适红发夫酵母PR106生长及虾青素积累的培养基为酵母浸粉5.0 g/L，麦芽浸粉4.0 g/L，蛋白胨7.0 g/L，葡萄糖18.0 g/L；最高的虾青素产量为7.3 mg/L，生物量为3.75g/L，分别比优化前提高了38%、13%；虾青素含量为1.70mg/g DCW。

实施例4 不同物质对红发夫酵母虾青素产量的影响

在培养基优化的基础上（培养基为酵母浸粉5.0 g/L，麦芽浸粉4.0 g/L，蛋白胨7.0 g/L，葡萄糖18.0 g/L），分别加入：

1）0、0.02、0.05或0.10 g/L的虾青素前体物质2-D-脱氧葡萄糖；

2）0、0.02、0.04、0.06或0.08 g/L 的无机盐FeCl₃. 6H₂O；

3）0、0.5、1.0或1.5 g/L的活性氧发生剂TiO₂；

上述三种物质的添加均为单独添加（比如添加2-D-脱氧葡萄糖，那么不添加另外两种物质）；使用分光光度计测定虾青素产量OD₄₇₅，结果表明再加入2-D-脱氧葡萄糖的量为0.05 g/L，FeCl₃. 6H₂O的量为0.02 g/L，TiO₂的量为0.5 g/L时，对红发夫酵母PR106虾青素产量影响较大；

高效液相色谱法测定当TiO₂的量为0.5g/L时对红发夫酵母PR106虾青素产量影响最大，红发夫酵母PR106虾青素产量为12.02mg/L；虾青素含量为2.79 mg/g DCW，其中左旋虾青素占比为75.81±2.37%，3S, 3'S构型（左旋）的虾青素含量为2.12 mg/g DCW左右，3R，3’R构型（右旋）的虾青素含量为0.67 mg/g DCW左右。

序列表

<110> 吉林农业大学

<120> 一种发酵生产左旋虾青素的方法

<141> 2020-02-25

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 522

<212> DNA

<213> rRNA RNA

<400> 1

tagtacggcg agtgaagcgg gatgagctca aatttgaaat ctggcagcct ccggttgtcc 60

gagttgtaaa ctagagaagc gttttccgtg ccggcctgtg tacaagtccc ttggaatagg 120

gcgtcataga gggtgagaat cccgtccttg acacagacca ccggtgctat gtgatacgct 180

ctcgacgagt cgagttgttt gggaatgcag ctcaaattgg gtggtaaatt ccatctaagg 240

ctaaatattg gcgagagacc gatagcgaac aagtaccgtg agggaaagat gaaaagcact 300

ttggaaagag agttaaacag tacgtgaaat tgttgaaagg gaaacgattg aagtcagtca 360

tgcgtgctcg gactcagctg ggttcgtccc agtctatttc cgggtgccgc aggtcagcat 420

cagtttcggg cggtggaaaa cgggcggggg aaggtggcat ctccggatgt gttatagccc 480

ccgtttggat gcatcgcgtg ggactgagga acgcagcgcg cc 522

Claims

1. 红发夫酵母（Phaffia rhodozyma）PR106在生产左旋虾青素方面的用途，所述的红发夫酵母的保藏编号为CCTCC M 2019083。

2.一种发酵生产左旋虾青素的方法，它包括：

1）取保藏编号为CCTCC M 2019083红发夫酵母菌，活化，按1~10%的接菌量接种到发酵培养基，在20~28℃、150~270 r/min下摇床培养48~96 h，得发酵液；

3.根据权利要求2所述的一种发酵生产左旋虾青素的方法，其特征在于：步骤1）所述的发酵培养基，它的重量组分为：酵母浸粉1~8g、麦芽浸粉1~8g、蛋白胨4~10g、葡萄糖10~70g、无机盐0.01~1g、TiO₂0.1~1g、水1.0kg。

4. 根据权利要求2或3所述的一种发酵生产左旋虾青素的方法，其特征在于：步骤1）所述的培养是在20℃、180r/min下摇床培养72 h。

5.根据权利要求4所述的一种发酵生产左旋虾青素的方法，其特征在于：步骤4）所述的干燥为减压浓缩干燥。