CN109868227A - 一种发酵生产β-胡萝卜素的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083；一种发酵生产β‑胡萝卜素方法，它包括：1）取红发夫酵母菌，活化，接种到发酵培养基，摇床培养，得发酵液；2）将发酵液离心，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清，加入3 mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡，沸水浴，降温，离心，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；3）加入丙酮，在避光条件下震荡浸提，离心，收集上清液，得到浸提液；4）减压蒸干，加入甲醇，得甲醇β‑胡萝卜素溶液，转移至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，得到β‑胡萝卜素；制备的β‑胡萝卜素含量为15.008mg/g干菌体。

Description

一种发酵生产β-胡萝卜素的方法

技术领域

本发明属于微生物发酵技术领域，具体涉及一种发酵生产β-胡萝卜素的方法。

背景技术

β-胡萝卜素，其分子式为 C₄₀H₅₆，紫红或暗红色的结晶性粉末。不溶于水，微溶于乙醇和乙醚，易溶于氯仿苯和油，熔点176-180 ℃。在动物体内可转变为维生素A的物质称为前维生素A。其代表性物质就是胡萝卜素，胡萝卜素分为α-、β-、γ-三种异构体，其中β-胡萝卜素比较稳定，效力也强。β-胡萝卜素是类胡萝卜素之一，也是橘黄色脂溶性化合物，它是自然界中最普遍存在也是最稳定的天然色素，已被联合国粮农组织(FAO)和世界卫生组织(WHO)等国际组织认定为 A 类营养色素，并在50多个国家和地区获准作为营养和着色双重功用的食品添加剂与饲料添加剂。β-胡萝卜素具有保护视力、抗氧化、抗肿瘤、抗衰老、抗辐射、抗骨质疏松、提高免疫力和预防血管硬化等许多重要的生理功能，在食品、药品及保健品领域具有广阔的应用前景。

β-胡萝卜素的生产方法有化学合成法、植物提取法和微生物发酵法3种。发达国家以化学合成法为主，技术复杂但产品售价远不如天然品的高，化学合成的β-胡萝卜素成本较低，但合成β-胡萝卜素的生物活性低。除此之外，毒性问题也越来越受到人们的关注，因而近年已转向对天然制品的开发。从植物中提取天然β-胡萝卜素，受原料含量、气候、产地和运输等条件限制，难以大量生产。随着人们对天然产品的偏爱，利用微生物技术合成β-胡萝卜素并实现工厂化生产是发展的方向。目前微生物发酵法制备β-胡萝卜素，主要菌种有三孢布拉霉和红酵母，其中三孢布拉霉β-胡萝卜素产率较高，但具有发酵周期长、营养要求复杂等缺点。采用红酵母发酵生产β-胡萝卜素，虽然其色素含量较三孢布拉霉要低许多，但红酵母生长周期短，营养要求较低也易于培养，菌体无毒且含有丰富的蛋白质的优点，有重要的研究意义和开发前景，是一种很有潜力的菌种，因此，提高红酵母β-胡萝卜素的合成能力成为研究的热点。

Ananda N等人利用酒糟发酵生产和优化可溶性类胡萝卜素中，β-胡萝卜素的含量为278 µg/g；Schroeder W A等人研究了单线态氧对红酵母类胡萝卜素生成的影响，结果表明其中的β-胡萝卜素的含量为63 µg/g；Lewis M J等人用3-紫罗兰酮筛选高产虾青素的突变株，β-胡萝卜素的含量为77 µg/g；Chun, S等人利用原生质体融合对红发夫酵母菌株的改良后β-胡萝卜素含量为140µg/g。

发明内容

本发明的目的是为解决β-胡萝卜素产量低的问题，而提供一种发酵生产β-胡萝卜素的方法。

一种发酵生产β-胡萝卜素方法，它包括：

1）取红发夫酵母菌，活化，按1~15%的接菌量接种到发酵培养基，在18~28℃、120~300r/min下摇床培养，发酵48~96h，得发酵液；

2）将发酵液在4000~6000 r / min、0~4 ℃下离心8~15 min，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清得到酵母泥，加入所述发酵液的20~30%体积的3 mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡25~35 min，沸水浴4~5分钟，冰浴降温；在4000~6000 r / min下离心8~15 min去除盐酸溶液，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；

3）细胞碎片加入丙酮，在避光条件下震荡浸提1~3 min，在4000~8000 r/min下离心8~15 min，收集上清液，得到浸提液；

4）将步骤3）得到的浸提液，在40~50℃下减压蒸干，加入甲醇，得甲醇β-胡萝卜素溶液，转移所述的甲醇β-胡萝卜素溶液至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，40~50℃减压蒸干，得到β-胡萝卜素；

步骤1）所述的红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083；

步骤1）所述的发酵培养基，它的重量组分包括：酵母浸粉1~3kg，麦芽浸粉1~4kg，玉米浆2~12kg，蛋白胨2~8kg，葡萄糖5~15kg，水1000kg；

步骤1）所述的在20℃、180 r/min下摇床培养72 h；

步骤2）所述的浸泡，时间30min；

步骤4）所述的色谱柱为C18固相萃取柱。

本发明提供了一种发酵生产β-胡萝卜素方法，它包括：1）取红发夫酵母菌，活化，接种到发酵培养基，摇床培养，得发酵液；2）将发酵液离心，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清，加入3 mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡，沸水浴，降温，离心，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；3）加入丙酮，在避光条件下震荡浸提，离心，收集上清液，得到浸提液；4）减压蒸干，加入甲醇，得甲醇β-胡萝卜素溶液，转移至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，减压蒸干，得到β-胡萝卜素；制备的β-胡萝卜素含量为15.008mg/g干菌体。

附图说明

图1 红发夫酵母（CCTCC M 2019083）26s D1/D2区的系统发育树。

具体实施方式

实施例1 红发夫酵母菌种的制备

采集吉林农业大学果园土壤，将该果园土壤接种于YPD培养基平板，20-28℃恒温培养48-96 h，选择红色菌落接种于YEPD培养基中，进行20-28℃恒温摇床150-270r/min培养48-96h，进行番茄红素产量测定，获得番茄红素产量较高的菌株即为PR106，然后进行菌体形态、生理生化及26s rRNA鉴定，26s rRNA RNA长度为522bp，通过系统发育树比较该菌株为红发夫酵母（Phaffia rhodozyma），命名为红发夫酵母PR106，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏时间2019年1月24日，地址湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC M2019083。

实施例2菌种培养

菌种活化：取红发夫酵母PR106，摇瓶培养后，进行划线培养，在生化培养箱中20-28℃条件下培养，7天后选取大而颜色深的单菌落接入液体培养基中，液体培养基121℃条件下灭菌15min，菌种在18-28℃、150-270r/min培养48-96h，按此步骤传三代；

种子培养：传代培养后的活化菌种，使用YEPD液体培养基，接菌量1-10%，在摇床中18-28℃、120-300r/min的条件下培养48-96h。

实施例3 β-胡萝卜素的提取纯化

红发夫酵母PR106按10%的接菌量，接种到装有30mL发酵培养基的100mL三角烧瓶中，20℃、180r/min摇床培养72h；溶氧40-90%，流加碱液控制，pH6.0-7.5；所述的发酵培养基也可以替换为YEPD培养基，但综合考虑生产成本及发酵周期，以发酵培养基最为合适；然后进行细胞破碎，取20 ml发酵液装入50 ml离心管中， 5000 r / min，4 ℃离心10 min收集沉淀得到菌体，用蒸馏水水洗离心弃上清三次后得到酵母泥，加入5 ml预配的3 mol/L的盐酸溶液，震荡均匀后浸泡30 min以酸化酵母细胞壁，沸水浴4-5分钟，然后立即放到冰水中降温；将破壁细胞浆以5000 r/min 离心10 min去除盐酸，收集沉淀重复离心水洗3次弃上清，得细胞碎片。沉淀在4 ℃下储存，用于后期的测定；

采用丙酮萃取方法提取β-胡萝卜素；取20 ml发酵液进行细胞破碎后加入5 ml丙酮，在避光条件下震荡浸提1 min，5000 r/min离心10 min，收集上清液，得到色素丙酮浸提液，若是未完全提取，加入丙酮进行再次提取，直到细胞呈无色；

每1.5 ml离心管中加入1mL的提取液，45℃减压蒸干后加入100 µL甲醇溶解粗提品，取5 mL甲醇活化CNW C18 固相萃取柱，然后转移2mL甲醇β-胡萝卜素溶液至C18柱中。用10mL甲醇洗脱，分4次添加到柱中，收集全部洗脱液，45 ℃减压蒸干，得到β-胡萝卜素。

实施例4 高效液相色谱法分析β-胡萝卜素

采用紫外检测器高效液相色谱法测定红发夫酵母中β-胡萝卜素的含量，色谱条件为：

1）色谱柱：C18柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），或具同等性能的色谱柱；

2）流动相：三氯甲烷：乙腈：甲醇=3：12：85，将1 L的流动相中加入0.4 g的抗坏血酸，经0.45 μm膜过滤后备用；

3）流速：1.0 mL/min；

4）检测波长：450 nm；

5）柱温：室温；

6）进样体积：20 μL，等度洗脱，浓度不变。

制备的β-胡萝卜素，加甲醇复溶，过0.22 nm的有机滤膜，作为待测样品检测；高效液相色谱法分析红发夫酵母PR106中的β-胡萝卜素含量为15.008 mg/g干菌体。

实施例5 培养基的制备

实施例1-4所述的YPD、YEPD以及发酵培养基，其组分分别为：

1）YPD培养基：酵母浸粉2.0 g，麦芽浸粉3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，琼脂20.0g，自来水1.0 L；

2）YEPD培养基：酵母浸粉2.0 g，麦芽浸粉3.0 g，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0 g，自来水1.0 L；

3）发酵培养基：酵母浸粉2.0 g，麦芽浸粉3.0 g，玉米浆8.0kg，蛋白胨5.0 g，葡萄糖10.0kg，自来水1000.0L。

三种培养基的制备方法按常规方法制备。

<110> 吉林农业大学

<120>一种发酵生产β-胡萝卜素的方法

<160> 1

<210>1

<211>522

<212>DNA

<213> rRNA RNA

<400>1

tagtacggcg agtgaagcgg gatgagctca aatttgaaat ctggcagcct ccggttgtcc 60

gagttgtaaa ctagagaagc gttttccgtg ccggcctgtg tacaagtccc ttggaatagg 120

gcgtcataga gggtgagaat cccgtccttg acacagacca ccggtgctat gtgatacgct 180

ctcgacgagt cgagttgttt gggaatgcag ctcaaattgg gtggtaaatt ccatctaagg 240

ctaaatattg gcgagagacc gatagcgaac aagtaccgtg agggaaagat gaaaagcact 300

ttggaaagag agttaaacag tacgtgaaat tgttgaaagg gaaacgattg aagtcagtca 360

tgcgtgctcg gactcagctg ggttcgtccc agtctatttc cgggtgccgc aggtcagcat 420

cagtttcggg cggtggaaaa cgggcggggg aaggtggcat ctccggatgt gttatagccc 480

ccgtttggat gcatcgcgtg ggactgagga acgcagcgcg cc 522

Claims (7)

1. 一株红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083。

2.一种发酵生产β-胡萝卜素方法，它包括：

1）取红发夫酵母菌，活化，按1~15%的接菌量接种到发酵培养基，在18~28℃、120~300r/min下摇床培养，发酵48~96h，得发酵液；

2）将发酵液在4000~6000 r / min、0~4 ℃下离心8~15 min，收集沉淀得到菌体，水洗，离心，弃上清得到酵母泥，加入所述发酵液的20~30%体积的3 mol/L盐酸溶液，震荡均匀，浸泡25~35 min，沸水浴4~5分钟，冰浴降温；在4000~6000 r / min下离心8~15 min去除盐酸溶液，收集沉淀，水洗、离心，弃上清，得细胞碎片；

3）细胞碎片加入丙酮，在避光条件下震荡浸提1~3 min，在4000~8000 r/min下离心8~15 min，收集上清液，得到浸提液；

4）将步骤3）得到的浸提液，在40~50℃下减压蒸干，加入甲醇，得甲醇β-胡萝卜素溶液，转移所述的甲醇β-胡萝卜素溶液至色谱柱，用甲醇洗脱，收集洗脱液，40~50℃减压蒸干，得到β-胡萝卜素。

3. 根据权利要求2所述的一种发酵生产β-胡萝卜素方法，其特征在于：步骤1）所述的红发夫酵母菌，它的保藏编号为CCTCC M 2019083。

4.根据权利要求2或3所述的一种发酵生产β-胡萝卜素方法，其特征在于：步骤1）所述的发酵培养基，它的重量组分包括：酵母浸粉1~3kg，麦芽浸粉1~4kg，玉米浆2~12kg，蛋白胨2~8kg，葡萄糖5~15kg，水1000kg。

5. 根据权利要求4所述的一种发酵生产β-胡萝卜素方法，其特征在于：步骤1）所述的在20℃、180 r/min下摇床培养72 h。

6.根据权利要求5所述的一种发酵生产β-胡萝卜素方法，其特征在于：步骤2）所述的浸泡，时间30min。

7.根据权利要求6所述的一种发酵生产β-胡萝卜素方法，其特征在于：步骤4）所述的色谱柱为C18固相萃取柱。