CN110590723A - 烟草中一种甾醇类化合物及其制备方法与应用 - Google Patents

烟草中一种甾醇类化合物及其制备方法与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及烟草中一种甾醇类化合物及其制备方法与应用，属于烟草化学技术领域。所述的甾醇类化合物是从云南地方晾晒烟中分离得到，命名为烟草甾醇‑A，英文名为Tobsterol‑A，分子式为C22H34O3，为白色粉末，结构式如式（I）所示：，式（I）；其制备方法包括浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤。本发明化合物制备工艺简单，工业化生产容易实现，具备大规模推广应用的条件。同时，本发明化合物展现出良好的抗烟草黑茎病活性，本发明中甾醇类化合物抑菌圈直径为14.5±1.4 mm，化合物的抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素。且本发明化合物具有显著的烟草黑茎病防治效果，易于推广应用。

Description

烟草中一种甾醇类化合物及其制备方法与应用
技术领域
本发明属于烟草化学技术领域，具体涉及烟草中一种甾醇类化合物及其制备方法与应用，特别涉及一种云南地方晾晒烟中甾醇类化合物及其制备方法与应用。
背景技术
云南地方晾晒烟是烟草的云南特有变种，烟草从明万历末年进入云南，至清乾隆年间成为当地常见的农作物。云南自然条件好，温暖的河谷、冷凉的半山区、山区都适应烟草的生长。而且由于云南多样的气候、地理环境，烟草在多年的栽培过程中形成了很多个具有地方特色的晾晒烟品种，其中著名的有：罗平八大河烟、师宗五洛河烟、会泽乐业烟、蒙自新安所烟、富源大河烟、大姚赵户冲烟、云龙天登烟、宾川白塔烟、巍山南门烟、南涧乐居烟、腾冲绮罗生烟等。这些晾晒烟在当地常盛产不衰；但对其次生代谢产物的研究较少。
甾醇是以环戊烷多氢菲为基本结构的一类化合物，由于含有羟基，故称为固醇类化合物。植物甾醇是一种活性成分，在植物的根、茎、叶、果实和种子中均广泛存在。甾醇类化合物种类繁多、结构多样，具有多种活性，目前是药物和生物农药活性分子的重要来源。
烟草黑茎病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，又称烟草疫病，烟农称为“黑杆疯”、“黑根”、“乌头病”。中国各主要产烟区均有不同程度发生，其中安徽、山东、河南省为历史上的重病区；云南、贵州、四川、湖南、广东、广西、福建等南方烟区发生亦相当普遍。目前黑茎病的防治主要通过轮作栽培、品种基因改良、生物农药等方法实现防治。其中用生物农药防治是最常用且最容易实现的方法。
基于以上考虑，我们对产自云南的云南地方晾晒烟干燥全株的化学成分进行了研究，并从中分离到一个新的甾醇类化合物，该化合物至今尚未见到相关报道。值得一提的是该化合物具有显著的抗烟草黑茎病活性。
发明内容
本发明的第一目的在于提供一种甾醇类化合物；第二目的在于提供所述的甾醇类化合物的制备方法；第三目的在于提供所述的甾醇类化合物的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
本发明的第一目的是这样实现的，所述的甾醇类化合物是从云南地方晾晒烟中分离得到，命名为：烟草甾醇-A，英文名为：Tobsterol-A，其分子式为C22H34O3，为白色粉末，具有下述结构式：
本发明的第二目的是这样实现的：烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎过筛，用云南地方晾晒烟重量3～10倍的有机溶剂超声提取3～5次，每次30～60min，合并提取液浓缩得到浸膏a；
B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2～8倍量的160～300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，依次以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
进一步，优选的是，A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎后过30～50目筛，取筛下物。
进一步，优选的是，A步骤中所述的有机溶剂为体积百分浓度60～90％的丙酮、80～100％的乙醇或80～100％的甲醇。
进一步，优选的是，浸膏a在经硅胶柱层析前，用浸膏a重量比1.5～3倍的有机溶剂溶解，然后用浸膏a重量0.8～1.5倍的80～100目硅胶拌样。
进一步，优选的是，所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。
进一步，优选的是，C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
进一步，优选的是，制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
以上述方法制备的甾醇类化合物的结构是通过以下方法鉴定出来的：
本发明化合物为白色粉末；
HRESI-MS显示其准分子离子峰为345.2436[M-H]-(计算值345.2430)，结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C22H34O3，不饱和度为6。
红外光谱中显示了羟基(3415cm-1)和羰基(1742cm-1)的共振吸收峰；
紫外光谱在226和242nm有弱吸收峰。
化合物的1H、13C和DEPT核磁共振谱数据(图1、图2和表1)显示其含有22个碳和34个氢，这些信号可分类为6个甲基、4个亚甲基、7个次甲基(包括2个双键次甲基)、5个季碳(包括1个氧化的季碳和2个双键季碳)。
表1本发明化合物的核磁共振数据(500/125MHz，溶剂为CDCl3)
δ<sub>C</sub> δ<sub>H</sub>(m,J,Hz) No. δ<sub>C</sub> δ<sub>H</sub>(m,J,Hz)
170.9s - 12 11.7q 0.66s
122.6d 5.62(d,J＝1.7) 13 34.4d 2.37m
170.3s - 14 20.6q 0.97(d,J＝6.6)
104.3s - 15 130.9d 4.92(d,J＝10.0)
35.5t 2.29(m),1.89(m) 16 136.2s
35.1t 1.97(m),1.61(m) 17 13.1q 1.51(d,J＝1.2)
48.6s - 18 17.2q 0.96(d,J＝6.8)
50.1d 2.63(ddd,J＝1.7,7.0,12.3) 19 50.4d 1.67m
21.6t 1.72(m),1.54(m) 20 30.7d 1.53m
28.4t 1.94(m),1.36(m) 21 21.3q 0.79(d,J＝6.6)
56.4d 1.55(m) 22 20.0q 0.84(d,J＝6.6)
通过1H-1H COSY和关键HMBC相关(图3)分析，可推测该化合物为甾醇类化合物。
通过进一步的文献数据对比，发现本发明化合物结构和文献(J Nat Prod.68:331-336)报道的化合物demethylincisterol A结构接近，本发明化合物在16位多了一个甲基，而demethylincisterol A中16位是氢，该甲基取代在16为可通过甲基氢(H3-17)与C-15、C-16、C-19，以及H-15和H-19与C-17的HMB C相关得到证实；
此外，还通过NOESY相关确定了化合物的构型。
至此，化合物的结构得到确定，并命名化合物为：烟草甾醇-A，英文名为：Tobsterol-A。
化合物的红外、紫外和质谱数据：UV(甲醇)，λmax(logε)226.0(2.18),242(3.18)nm；[α]20 D+252(c 0.012,CHCl3)；IR(溴化钾压片)：νmax 3342、2950、2928、1742、1660、1455、1048cm-1；1H和13C NMR数据(500和125MHz,CDCl3)，见表1；负离子模式ESIMS m/z 345[M-H]-；负离子模式H RESIMS m/z 345.2436[M-H]-(计算值C22H33O3，345.2430)。
本发明的第三目的是这样实现的，所述的甾醇类化合物在制备抑菌剂中的应用。
所述的甾醇类化合物在制备抗烟草黑茎病生物农药中的应用。
烟草黑茎病是由烟草疫霉菌浸染而导致的，本发明中先测定化合物的抑制疫霉菌活性。包括以下步骤：
(1)燕麦片琼脂培养基的制备：燕麦片30g、琼脂17～20g、葡萄糖20g，加水1000mL，加热使琼脂完全熔化后，在沸水浴上加热1小时，加水补足1000m L，然后趁热用纱布(中间加脱脂棉)过滤于三角瓶中，121℃、15磅灭菌20min，取出冷却至43～48℃，于无菌操作台上加入氨苄青霉素至终浓度为5mg/100mL，混匀后倾倒于平皿中，28℃培养48小时，经检查无菌后待用。
(2)抑菌实验：取直径5mm的圆形滤纸，放入培养皿中，置于15磅高压灭菌30min，烘干后分别浸入20μM的化合物(溶剂为DMSO)、75％乙醇溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2mL烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上(菌液浓度为1×103～1×104株/mL)。用三角玻璃涂棒涂布均匀，将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上，置28℃培养观察实验结果，测定抑菌圈大小。同时，以20μM农用氯霉素(溶剂为DMSO)作为阳性对照，处理方法和测试化合物相同。
测试结果表明：本发明的甾醇类化合物抑菌圈直径为14.5±1.4mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.2±1.0mm。说明本发明化合物的抑抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑茎病活性。
化合物的烟草黑茎病防治效果：烟苗移栽到直径10cm，高10cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1)，每盆1株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10g/株(菌谷的制备：将500g谷子加水1L煮开至半数谷粒呈开花状，装入500mL三角瓶，于120℃灭菌30min，作为菌谷备用。无菌条件下取1cm×1cm烟草黑胫病菌菌块转接到含有菌谷的三角瓶内，28℃培养14d备用)，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30℃，黑夜28℃，光照∶黑暗(12h:12h)，相对湿度95％，使烟苗发病。在黑茎病发病前使用20μM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10mL；共浇2次。每个处理10株，重复3次，14d后调查发病情况，计算病情指数。结果表明：本发明化合物对烟草黑茎病防治效果为(70.6±3.2)％，具有显著的烟草黑茎病防治效果。
本发明与现有技术相比，其有益效果为：
(1)本发明化合物从云南地方晾晒烟中分离得到，云南地方晾晒烟为常见的烟草品种，生物产量大，种植技术成熟，化合物分离、制备原料成本低。
(2)本发明化合物制备工艺简单，工业化生产容易实现，具备大规模推广应用的条件。
(3)本发明化合物展现出良好的抗烟草黑茎病活性，本发明中甾醇类化合物抑菌圈直径为14.5±1.4mm，化合物的抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素。实际防治效果也表明，本发明化合物对烟草黑茎病防治效果为(70.6±3.2)％，具有显著的烟草黑茎病防治效果。烟草黑茎病是烟草生产上最具毁灭性的病害之一，本发明化合物的应用，将给烟草黑茎病防治提供高效、安全的新型生物农药分子结构。
附图说明
图1为本发明甾醇类化合物的核磁共振碳谱；
图2为本发明甾醇类化合物的核磁共振氢谱；
图3为本发明甾醇类化合物的主要HMBC和1H-1H COSY相关。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步的详细描述。
本领域技术人员将会理解，下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件或者按照产品说明书进行。所用材料或设备未注明生产厂商者，均为可以通过购买获得的常规产品。
本发明所使用的云南地方晾晒烟为普通市售干制品，对于含水率没有具体限制。
本发明除非另有说明，否则百分数为质量百分数，比例为质量比。
本发明采用硅胶柱层析分离时，也可同时采用TLC薄层色谱点板跟踪。
本发明所述的甾醇类化合物是从云南地方晾晒烟中分离得到，命名为：烟草甾醇-A，英文名为：Tobsterol-A，其分子式为C22H34O3，为白色粉末，具有下述结构式：
实施例1-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于云南红河)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量3倍的体积百分浓度为60％的丙酮超声提取3次，每次30min，合并提取液浓缩得到浸膏a；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比1.5倍的纯甲醇溶解，然后用浸膏a重量0.8倍的80目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量2倍量的300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例2-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于云南红河)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量10倍的体积百分浓度为90％的丙酮超声提取5次，每次60min，合并提取液浓缩得到浸膏a；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比3倍的纯乙醇溶解，然后用浸膏a重量01.5倍的100目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量8倍量的160目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例3-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于云南元江)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将5.8kg云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量5倍的体积百分浓度为75％的丙酮超声提取3次，每次50min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a 427g；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比1.6倍的纯甲醇溶解，然后用浸膏a重量1.2倍的90目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量7倍量的180目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例4-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于广西百色)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量3倍的体积浓度为80％的乙醇超声提取3次，每次30min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比1.5倍的纯丙酮溶解，然后用浸膏a重量0.8倍的80目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量2倍量的160目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例5-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于广西百色)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量8倍的纯乙醇超声提取4次，每次45min，合并提取液浓缩得到可流动的粘稠状浸膏a；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比2倍的纯甲醇溶解，然后用浸膏a重量1倍的900目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量5倍量的200目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例6-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于广西百色)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将4.2kg云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量6倍的体积浓度为95％的乙醇超声提取4次，每次40min，合并提取液浓缩得到浸膏a 302g；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比2倍的纯甲醇溶解，然后用浸膏a重量1.1倍的80目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量7倍量的200目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例7-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于云南红河)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将2.5kg云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量10倍的体积百分浓度为95％的甲醇超声提取5次，每次45min，合并提取液浓缩得到浸膏a165g；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比2倍的纯甲醇溶解，然后用浸膏a重量0.95倍的100目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量6倍量的160目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例8-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于云南红河)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量3倍的纯甲醇超声提取3次，每次30min，合并提取液浓缩得到浸膏a；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比1.5倍的纯甲醇溶解，然后用浸膏a重量0.8倍的80目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量2倍量的160目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例9-化合物的制备
烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，是以云南地方晾晒烟为原料(来源于云南红河)，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎至30～50目，用云南地方晾晒烟重量10倍的体积浓度为80％的甲醇超声提取5次，每次60min，合并提取液浓缩得到浸膏a；
B、硅胶柱层析：将A步骤得到的浸膏a先用浸膏a重量比3倍的纯乙醇溶解，然后用浸膏a重量1.5倍的100目硅胶拌样，同时，用浸膏a重量8倍量的300目硅胶干法装柱，进行硅胶柱层析，以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式(I)所示化合物粗品。
C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70％的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式(I)所示化合物粗品。
制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式(I)所示化合物的流出部分，得到式(I)所示化合物纯品。
实施例10-化合物结构鉴定
取实施例1-9制备的化合物，通过以下方法测定化合物结构，结果如图1-3所示：
本发明化合物为白色粉末；
HRESI-MS显示其准分子离子峰为345.2436[M-H]-(计算值345.2430)，结合1H NMR和DEPT谱确定其分子式为C22H34O3，不饱和度为6。
红外光谱中显示了羟基(3415cm-1)和羰基(1742cm-1)的共振吸收峰；
紫外光谱在226和242nm有弱吸收峰。
化合物的1H、13C和DEPT核磁共振谱数据(图1、图2和表1)显示其含有22个碳和34个氢，这些信号可分类为6个甲基、4个亚甲基、7个次甲基(包括2个双键次甲基)、5个季碳(包括1个氧化的季碳和2个双键季碳)。
通过1H-1H COSY和关键HMBC相关(图3)分析，可推测该化合物为甾醇类化合物。
通过进一步的文献数据对比，发现本发明化合物结构和文献(J Nat Prod.68:331-336)报道的化合物demethylincisterol A结构接近，本发明化合物在16位多了一个甲基，而demethylincisterol A中16位是氢，该甲基取代在16为可通过甲基氢(H3-17)与C-15、C-16、C-19，以及H-15和H-19与C-17的HMB C相关得到证实；
此外，还通过NOESY相关确定了化合物的构型。
至此，化合物的结构得到确定，并命名化合物为：烟草甾醇-A，英文名为：Tobsterol-A。
实施例11-化合物抗菌活性试验
取实施例1-9制备的甾醇类化合物进行抑制疫霉菌活性测试，主要包括以下步骤：
(1)燕麦片琼脂培养基的制备：燕麦片30g、琼脂17～20g、葡萄糖20g，加水1000mL，加热使琼脂完全熔化后，在沸水浴上加热1小时，加水补足1000m L，然后趁热用纱布(中间加脱脂棉)过滤于三角瓶中，121℃、15磅灭菌20min，取出冷却至43～48℃，于无菌操作台上加入氨苄青霉素至终浓度为5mg/100mL，混匀后倾倒于平皿中，28℃培养48小时，经检查无菌后待用。
(2)抑菌实验：取直径5mm的圆形滤纸，放入培养皿中，置于15磅高压灭菌30min，烘干后分别浸入20μM的化合物(溶剂为DMSO)、75％乙醇溶液及灭菌蒸馏水中。于无菌操作台上用无菌吸管分别吸取0.2mL烟草疫霉菌的新鲜菌液于燕麦片琼脂培养基平板上(菌液浓度为1×103～1×104株/mL)。用三角玻璃涂棒涂布均匀，将滤纸片用镊子分别轻贴于相应的平板上，置28℃培养观察实验结果，测定抑菌圈大小。同时，以20μM农用氯霉素(溶剂为DMSO)作为阳性对照，处理方法和测试化合物相同。
测试结果表明：本发明的甾醇类化合物抑菌圈直径为14.5±1.4mm，阳性对照农用氯霉素的抑菌圈直径为12.2±1.0mm。说明本发明化合物的抑抑制烟草疫霉菌效果显著优于阳性对照农用氯霉素，具有突出的抑制黑茎病活性。
实施例12-化合物的烟草黑茎病防治效果实验
取实施例1-9制备的甾醇类化合物进行烟草黑茎病防治效果测试，主要包括以下步骤：
化合物的烟草黑茎病防治效果：烟苗移栽到直径10cm，高10cm的花盆中，栽培基质为：灭菌土壤、草炭、珍珠岩培养(2:2:1)，每盆1株。移栽缓苗后于根部加入菌谷10g/株(菌谷的制备：将500g谷子加水1L煮开至半数谷粒呈开花状，装入500mL三角瓶，于120℃灭菌30min，作为菌谷备用。无菌条件下取1cm×1cm烟草黑胫病菌菌块转接到含有菌谷的三角瓶内，28℃培养14d备用)，将烟苗置于人工气候室内培养，白天30℃，黑夜28℃，光照∶黑暗(12h:12h)，相对湿度95％，使烟苗发病。在黑茎病发病前使用20μM的本发明化合物对烟苗进行灌根处理，每株浇10mL；共浇2次。每个处理10株，重复3次，14d后调查发病情况，计算病情指数。结果表明：本发明化合物对烟草黑茎病防治效果为(70.6±3.2)％，具有显著的烟草黑茎病防治效果。
以上显示和描述了本发明的基本原理、主要特征和本发明的优点。本行业的技术人员应该了解，本发明不受上述实施例的限制，上述实施例和说明书中描述的只是说明本发明的原理，在不脱离本发明精神和范围的前提下，本发明还会有各种变化和改进，这些变化和改进都落入要求保护的本发明范围内。本发明要求保护范围由所附的权利要求书及其等效物界定。

Claims (10)

1.烟草中一种甾醇类化合物，其特征在于，结构式如式（I）所示：
， 式（I）。
2.权利要求1所述的烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，其特征在于，以云南地方晾晒烟为原料，经浸膏提取、硅胶柱层析和高压液相色谱分离纯化步骤制得，具体包括如下步骤：
A、浸膏提取：将云南地方晾晒烟粉碎过筛，用云南地方晾晒烟重量3~10倍的有机溶剂超声提取3~5次，每次30~60 min，合并提取液浓缩得到浸膏a；
B、硅胶柱层析：浸膏a用浸膏a重量2~8倍量的160~300目硅胶干法装柱进行硅胶柱层析，依次以体积配比为1:0、20:1、9:1、8:2、7:3、6:4、1:1和1:2的氯仿和丙酮混合溶剂进行梯度洗脱，每一梯度洗脱至没有成分洗下后换下一梯度，收集梯度洗脱液，合并相同的部分并浓缩；
C、高压液相色谱分离：将B步骤采用9:1氯仿和丙酮混合溶剂进行洗脱得到的洗脱液经反相C18制备液相色谱分离纯化，得到式（I）所示化合物粗品。
3.根据权利要求2所述的烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，其特征在于，A步骤中所述的粉碎过筛是粉碎后过30~50目筛，取筛下物。
4.根据权利要求2所述的烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，其特征在于，A步骤中所述的有机溶剂为体积百分浓度60~90%的丙酮、80~100%的乙醇或80~100%的甲醇。
5.根据权利要求2所述的烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，其特征在于，浸膏a在经硅胶柱层析前，用浸膏a重量比1.5~3倍的有机溶剂溶解，然后用浸膏a重量0.8~1.5倍的80~100目硅胶拌样。
6.根据权利要求5所述的烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，其特征在于，所述的有机溶剂为纯甲醇、纯乙醇或纯丙酮。
7.根据权利要求2所述的烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，其特征在于，C步骤中的反相C18制备色谱分离纯化是以21.2mm×250 mm、5μm的C18色谱柱为固定相，以体积浓度为70%的甲醇为流动相，流速为20mL/min，紫外检测器检测波长为220nm，每次进样500μL，收集36.7min的色谱峰，多次累加后蒸干，得到式（I）所示化合物粗品。
8.根据权利要求2或7所述的烟草中一种甾醇类化合物的制备方法，其特征在于，制备色谱分离纯化后的全部化合物粗品再次用纯甲醇溶解，再以纯甲醇为流动相，用葡萄糖凝胶Sephadex LH-20柱层析分离，收集式（I）所示化合物的流出部分，得到式（I）所示化合物纯品。
9.权利要求1所述的烟草中一种甾醇类化合物作为制备疫霉菌抑菌剂中的应用。
10.权利要求1所述的烟草中一种甾醇类化合物作为制备抗烟草黑茎病生物农药中的应用。
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