CN105483036A - 一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用 - Google Patents

一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用 Download PDF

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本发明公开了一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用，属于微生物领域。该粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQ？IN？NO:1所示。该制备方法包括：在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品，加入无菌水中并充分振荡，静置后得到上清液，将上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上，在培养基上加入重金属离子培养，从培养基上挑取单菌落接种到斜面培养基上，得到原始菌株；在液体培养基上接种原始菌株，恒温振荡培养过夜，得到菌液，取菌液稀释后分别放置于灭菌平皿中，进行紫外线照射后涂布于固体培养基上，恒温静置培养后进行富集重金属分析并得到所述粘质沙雷氏菌。所述粘质沙雷氏菌对Cr2+、Cd2+、Pb2+具有良好的吸附性能，是良好的生物吸附材料。

Description

一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用
技术领域
本发明涉及微生物领域，特别涉及一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用。
背景技术
随着我国工业的快速发展，重金属污染也越来越严重，重金属污染会导致土壤微生物活性降低，使土壤肥力和质量严重下降，重金属还会通过食物链在人体内富集，危害人体健康。因此，重金属污染的治理迫在眉睫。
重金属污染的传统处理方法包括：化学沉淀法、离子交换法、活性炭及硅胶吸附法、电化学法及膜分离法等，但是采用传统方法处理重金属离子的成本较高。近年来，生物修复技术因成本低廉而得到了广泛的应用，取得了较理想的结果。然而，国内外关于生物修复重金属污染的研究较少，使得现有已开发的微生物吸附材料的种类少，而且现有的微生物吸附材料的吸附能力差。
发明内容
为了解决现有技术中微生物吸附材料吸附能力差的问题，本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌及其制备方法和应用。所述技术方案如下：
一方面，本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌，所述粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQINNO:1所示。
另一方面，本发明实施例提供了一种制备上述的粘质沙雷氏菌的方法，所述方法包括：
在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品，将所述土壤样品加入无菌水中并充分振荡，静置后得到上清液，将所述上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上，在所述培养基上加入重金属离子，将所述培养基倒置并于28℃培养7d，从所述培养基上挑取表面光滑的圆形单菌落接种到斜面培养基上，在所述斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株；
在液体培养基上接种所述原始菌株，于37℃恒温振荡培养过夜，得到菌液，取1mL所述菌液稀释至10-5倍，分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液，进行紫外线照射后分别吸取200μL所述稀释菌液涂布于含有6.0mg/L3-氨基-9-乙基咔唑的基本固体培养基上，于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析得到所述粘质沙雷氏菌。
具体地，采用紫外线灯进行所述紫外线照射，所述紫外线灯的参数为：功率25W，紫外线波长253nm。
具体地，在进行紫外线照射时，6个铺有10mL稀释菌液的所述灭菌平皿的照射时间分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。
具体地，将所述上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释，得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的菌液分别涂布到所述培养基上。
具体地，所述培养基为含有Cr2+的肉汤培养基。
具体地，所述方法还包括：将所述粘质沙雷氏菌进行摇瓶发酵培养，所述摇瓶发酵培养的条件为：发酵温度35-37℃，发酵时间30-36h，转速200-225r/min。
具体地，所述方法还包括：将所述粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中进行试发酵，所述试发酵的条件为：装入4-7L发酵培养基，接种量3-5％，接种菌液浓度为2×108CFU/mL，发酵温度35-37℃，pH6.5-7.5，发酵时间30-36h，转速300-400r/min，通气量1：1。
具体地，在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括：Cd2+、Pb2+和Cr2+。
又一方面，本发明实施例提供了一种粘质沙雷氏菌的应用，所述粘质沙雷氏菌用于修复重金属污染。
本发明实施例提供的技术方案带来的有益效果是：本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌对Cr2+、Cd2+、Pb2+具有良好的吸附性能，是良好的生物吸附材料。
附图说明
为了更清楚地说明本发明实施例中的技术方案，下面将结合附图对实施例描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
图1是本发明实施例提供的系统发育树图。
该细菌已于2015年7月29日送往中国典型培养物保藏中心进行保藏，分类命名：沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌XA07，拉丁文学名SerratiamarcescensXA07；保藏编号：CCTCCM2015476；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将对本发明实施方式作进一步地详细描述。
实施例
本发明实施例提供一种制备上述粘质沙雷氏菌的方法，该方法包括：
筛选：在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取深度为15-20cm的土壤样品，将1g土壤样品加入9ml无菌水中并充分振荡，静置5min后得到上清液，将上清液稀释后分别涂布到培养基上，在培养基上加入重金属离子，将培养基倒置并于28℃培养箱中培养7d，从培养基上挑取表面光滑圆形单菌落接种到斜面培养基上，在斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株。如果发现有非纯培养的菌株，再用接种环挑取少许菌苔在平板上划线分离，直至分离得到纯培养的原始菌株。
诱变和富集驯化：在液体培养基上接种原始菌株，于37℃恒温振荡培养过夜，得到菌液，取1mL菌液稀释10-5倍，分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液，进行紫外线照射后分别吸取200μL稀释菌液涂布于含有6.0mg/L3-氨基-9-乙基咔唑(AEC)的基本固体培养基上，于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析并得到粘质沙雷氏菌，该粘质沙雷氏菌的分类命名：沙雷氏菌属粘质沙雷氏菌XA07，拉丁文学名SerratiamarcescensXA07；保藏日期：2015年7月29日；保藏编号：CCTCCM2015476；保藏单位：中国典型培养物保藏中心；保藏地址：中国湖北省武汉市珞珈山武汉大学。
具体地，采用紫外线灯进行紫外线照射，紫外线灯的参数为：功率25W，紫外线波长253nm，阴极离光源距离40cm。
具体地，在进行紫外线照射时，6个铺有10mL稀释菌液的灭菌平皿的照射时间可以分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。
具体地，当土壤样品加入无菌水振荡时，可以采用涡旋器振荡10min使土壤样品和无菌水振荡充分。
具体地，将上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释，分别得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的菌液分别涂布到培养基上。
具体地，培养基为含有Cr2+的肉汤培养基(LB平板培养基)。LB(Luria-Bertani)平板培养基的成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、琼脂粉15g和去离子水1000mL，pH6.8-7.2。
具体地，液体培养基为LB液体培养基，LB液体培养基的成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g和去离子水1000mL，pH6.8-7.2。
具体地，在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括：Cd2+、Pb2+和Cr2+。
具体地，将所获得的粘质沙雷氏菌的摇瓶发酵培养条件为：发酵温度35-37℃，发酵时间30-36h，转速200-225r/min。
具体地，所获得的粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中试发酵条件为：装入4-7L发酵培养基，接种量3-5％，接种菌液浓度为2×108CFU/mL，发酵温度35-37℃，pH6.5-7.5，发酵时间30-36h，转速300-400r/min，通气量1：1。
进一步地，摇瓶发酵培养基和发酵培养基均为LB(Luria-Bertani)培养基。LB培养基成分为：胰蛋白胨10g、酵母浸出物5g、氯化钠10g、去离子水1000mL，pH6.8-7.2。
其中，所获得的粘质沙雷氏菌可以在pH4-10、以及盐浓度10％以下环境中生长；在18℃-36℃条件下，粘质沙雷氏菌能够在平板培养基中生长良好，而在4℃和42℃的极端环境下，粘质沙雷氏菌也能够在平板培养基中生长。
将粘质沙雷氏菌XA07进行Biolog(GN2/GP2)自动鉴定分析(GP板透光率：28％±3％，GN板透光率：52％±3％)，具体步骤包括：
挑取待测的粘质沙雷氏菌XA07的菌苔接种于Biolog平板上，在28℃下培养至对数生长期。用灭菌棉签蘸取BiologIF液体后将平板上的菌苔刮下，再溶入BiologIF液体中，振荡混匀得到菌悬液；使用Biolog浊度仪调浊度至指定范围(GP板透光率：28％±3％，GN板透光率：52％±3％)；再用移液枪将菌悬液加入Biolog鉴定板中，每孔150μL；然后在28℃培养16-24h取出Biolog鉴定板，用BiologMicroStation分析仪对Biolog鉴定板进行数据读取和分析，具体结果见表1。
表1：自动鉴定结果
将得到的粘质沙雷氏菌XA07进行16SrRNA基因序列分析，并得出其16SrRNA的基因核苷酸序列如序列表中的SEQIDNO:1所示，通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析，得出该菌种属于沙雷氏菌属，发明人将其命名为XA07。
具体地，将粘质沙雷氏菌XA07的16SrRNA基因序列分析，具体方法包括：
(1)染色体DNA(小量)的提取
1.取1.5mL粘质沙雷氏菌XA07菌液加入1.5mLEppendorf(EP)管(微量离心管)中，12000r/min离心5min。
2.静置弃上清，得到沉淀，向该沉淀中加入900μL磷酸缓冲液(PBS)重悬沉淀，于4℃12000r/min离心5min。
3.再静置弃上清，得到沉淀，向该沉淀中加入300TE(Tris-EDTA缓冲液)和200μL10mg/mL溶菌酶，通过吹吸混匀，于37℃温育1h，在温育期间每隔15min颠倒混匀一次。
4.向EP管中加入600TENS裂解液(200mmol/LNaCl，100mmol/LTril-HClpH8.0，2.0％SDS，50mmol/LEDTA，0.5％TritonX-100)和20mg/mL蛋白酶K10μL，颠倒混匀，于55℃温育1h，在温育期间每隔15min颠倒混匀一次。
5.将EP管于4℃12000r/min离心5min，取上清液。
6.向上清液中加入体积比为25︰24︰1的苯酚︰氯仿︰异丙醇并充分混匀，于4℃12000r/min离心10min。
7.重复步骤6。
8.将上清液转入新的EP管中，向新的EP管中加入1/10上清液体积的3mol/L醋酸钠，2倍上清液体积的无水乙醇，混匀，于-20℃下放置60min后，于4℃12000r/min离心10min。
9.弃上清，得到沉淀，将装有沉淀的EP管倒扣在吸水纸上，吸水纸吸干液体后将EP管中的沉淀风干，风干后得到粘质沙雷氏菌XA07的染色体DNA，向染色体DNA中加入30μL无菌水和10mg/mLRNaseA0.5μL，于-20℃保存。
(2)PCR扩增
以刚提取的染色体DNA为模板，利用由上海英骏生物技术有限公司合成的引物(上游引物27F，5’-AGAGTTTGATCTGGCTCAG-3’，下游引物1527R，5’-AAGGAGGTGATCCAGCC-3’)进行16SrRNA基因序列的PCR扩增，具体PCR扩增体系见表2。
表2：PCR扩增体系
PCR扩增条件：
Step1，预变性94℃10min；
Step2，变性95℃30s，
复性60℃1min，
延伸72℃1min；共30个循环。
Step3延伸72℃10min。得到粘质沙雷氏菌XA07的16SrRNA基因的PCR产物。
(3)16SrRNA基因PCR产物的纯化
(参照OmegaBio-tek公司PCR产物纯化试剂盒说明书)
1.将上述PCR产物从琼脂糖胶上相应的位置切下回收至EP管中，向EP管中加人Bindingbuffer(1g/mL)，在65℃水浴7min直到琼脂糖胶完全溶解。
2.将溶液转移至吸附柱中，10000r/min离心1min，弃收集管中废液。
3.向吸附柱中加入300μL的Bindingbuffer，10000r/min离心1min，弃收集管中废液。
4.向吸附柱中加入700μL的SPWbuffer，室温下放置2-3min，10000r/min离心1min，弃收集管中废液。重复一次。
5.于10000r/min空柱离心2min，弃收集管中废液。
6.将吸附柱放入一个干净的EP管中，加入30-50μL的Elutionbuffer，12000r/min离心2min收集产物，该产物用于基因序列。
(4)16SrRNA基因的测序
16SrRNA基因序列测定由上海英骏公司完成，测序结果见序列表中的序列1。
(5)16SrRNA基因序列相似度分析
将测序后的16SrRNA基因序列通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/和http://eztaxon-e.ezbiocloud.net/网页中的比对程序进行同源性分析。
(6)基于16SrRNA基因序列的系统发育分析
利用Clustalx1.8，MEGA5.0软件，根据16SrRNA基因序列相似度分析的结果，选取相关模式菌株的16SrRNA基因序列，分别采用neigbor-joining(NJ，邻位相接法)算法得到相应的系统发育树，见图1。
通过http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/网页中的比对程序进行同源性分析，得出同源性排名前十的菌种如下表3。
表3同源性比对分析
由表3可知，本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌属于沙雷氏菌属粘质沙雷菌，将其命名为XA07。
将粘质沙雷氏菌XA07进行脂肪酸自动鉴定分析，具体方法包括：
1.获取菌体
采用4区划线将粘质沙雷氏菌XA07的菌株接种在TSB(胰酪胨大豆肉汤培养基)平板上。刮取第3区约40mg的菌量，涂抹在带有特氟龙螺旋盖的试管底部，同时做好标记。
2.皂化
(1)吸取1.0(±0.1)mL的皂化试剂，注入试管内，将含内垫的螺旋盖旋紧，Vortex振荡5～10s；
(2)将试管浸入95～100℃的水浴锅中5min；
(3)取出试管，不要拧开螺旋盖，用Vortex振荡5～10s；
(4)放回95～100℃的水浴锅中反应25min，注意螺旋盖是否旋紧；
(5)取出试管，放入冷水中冷却。
3.甲基化
(1)拧开螺旋盖，加入2.0(±0.1)mL的甲基化试剂；
(2)拧紧螺旋盖，用Vortex振荡5～10s；
(3)放入80±1℃的水浴锅中反应10(±1)min；
(4)取出试管，放入冷水中冷却。
4.萃取
(1)拧开螺旋盖，加入1.25(±0.1)mL的萃取试剂；
(2)拧紧螺旋盖，将试管轻柔颠倒混合10min；
(3)拧开螺旋盖，用玻璃吸管取出下层液体，弃去，保留上层液体。
5.洗涤
(1)加入3.0(±0.1)mL的洗涤试剂；
(2)拧紧螺旋盖，将试管轻柔颠倒混合5min；
(3)静置等待分层，若分层不够清晰，加入4～5滴的饱和NaCl溶液；
(4)用干净玻璃吸管取出约200μL的上层液体，即提取的样品，移到GC(GasChromatography)小管中，准备气相色谱分析。
6.脂肪酸气相分析
利用Agilent气相色谱仪和MIDISherlock程序对提取的样品进行脂肪酸组分和系统分析。色谱条件：氢离子火焰检测器(FID)，检测器温度为300℃；色谱柱为HP-ULTRA2型毛细柱；汽化室温度为250℃；载气为H2，30mL/min；进样量为0.2μL；炉温由170℃保持5℃/min上升到260℃。脂肪酸气相分析结果见表4。
表4：脂肪酸组分百分比含量
脂肪酸组分 百分含量％
C12:00 2.40
C12:02OH 0.35
C14:00 6.33
C16:1w5c 0.18
C16:00 31.76
C17:0 cyclo 8.82
C17:00 0.78
C18:1w9c 0.49
C18:00 1.60
C19:0cyclo w8c 0.20
Summed Feature 2 7.17
Summed Feature 3 24.60
Summed Feature 8 10.33
其中，SummedFeature为此脂肪酸组分中难区分的脂肪酸成分。SummedFeature2为C12:0(aldehyde)、C16:1isoI或C14:03OH；SummedFeature3为C16:1w7c或C16:1 w6c；SummedFeature8为C18:1w7c或C18:1w6c。
对粘质沙雷氏菌XA07的耐盐、耐pH及温度实验
1)用LB培养基活化粘质沙雷氏菌XA07菌株；
2)将LB固体培养基800mL，分装于16个三角瓶中，将其中9瓶三角瓶的pH值分别调为3、4、5、6、7、8、9、10、11，再将剩余的7瓶三角瓶中的NaCl含量调为2％、4％、6％、8％、10％、11％、12％并用高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min，将上述16个三角瓶内的部分液体倒入平板内；
3)向上述16个三角瓶内各接种总体积的1％的活化的粘质沙雷氏菌XA07菌株，同时，在平板上用推棒涂布粘质沙雷氏菌XA07菌株。
4)将接种好的三角瓶放入30℃的恒温摇床内，180r培养24h。将平板分别放入4℃、15℃、28℃、36℃、42℃下静置培养；
5)培养24h后，用分光光度计测量液体培养基的OD600数值，并检查平板中涂布的菌是否生长。
实验结果表明，在pH4-10之间粘质沙雷氏菌XA07均能生长；盐浓度10％以下粘质沙雷氏菌XA07均能生长；在15℃-36℃下粘质沙雷氏菌XA07能够在平板中生长良好，而在4℃和42℃的环境下，粘质沙雷氏菌XA07也能够在平板中生长。
对粘质沙雷氏菌XA07进行耐受重金属实验
1)用LB培养基活化粘质沙雷氏菌XA07菌株，并分别配制好100mL100mmol/LCr2+；100mL100mmol/LPb2+；100mL100mmol/LCd2+的重金属离子溶液；
2)配制LB培养基500mL，分装于48支试管中，并用高温蒸汽灭菌锅在121℃下灭菌15min；
3)将先配好并灭菌的Cr2+、Cd2+、Pb2+重金属离子溶液分别加入到LB培养
基中，使各试管中的金属离子终浓度按表5所示分别加入两支试管中；
表5：粘质沙雷氏菌XA07耐受重金属试验结果
处理组 1 2 3 4 5 6 7 8
Cr2+mmol/L 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0
Cd2+mmol/L 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0
Pb2+mmol/L 2.0 4.0 6.0 8.0 10.0 12.0 14.0 16.0
4)向每支试管内接种1％的活化的粘质沙雷氏菌XA07菌株，同一浓度的金属离子的试管只接种一支，另外一支作为空白对照；
5)将接种好的试管放入30℃的恒温摇床内，于200r/min下培养24h；
6)将培养好的菌液用分光光度计在OD600下测其吸光值，每一支都用其空白对照进行调零。
试验结果表明，粘质沙雷氏菌XA07对Cr2+的最大耐受能力为14mmol/L，对Cd2+的最大耐受能力为10mmol/L，对Pb2+的最大耐受能力为6mmol/L。
具体地，本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌XA07可用于修复重金属污染。
对粘质沙雷氏菌XA07进行吸附重金属实验
1)在分别为4mmol/L的Cr2+、Cd2+、Pb2+重金属离子浓度下培养几批菌体，培养时间分别为12h、24h、36h；
2)将培养好的菌体离心、清洗、烘干后准确称取干菌体的重量；
3)用原子吸收光谱仪检测样干菌体，粘质沙雷氏菌XA07的干菌体所能吸附Cr2+金属离子的量可达14.5μg/g，Cd2+金属离子的量可达10.8μg/g，Pb2+金属离子的量可达5.5μg/g。
由此可见，本发明实施例提供的粘质沙雷氏菌对Cr2+、Cd2+、Pb2+具有良好的吸附性能，是良好的生物吸附材料。
以上所述仅为本发明的较佳实施例，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (10)

1.一种粘质沙雷氏菌，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌的序列如序列表中SEQINNO:1所示。
2.一种制备如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括：
在固废垃圾处理厂的废电池与重金属填埋地周边提取土壤样品，将所述土壤样品加入无菌水中并充分振荡，静置后得到上清液，将所述上清液稀释至不同倍数后分别涂布到培养基上，在所述培养基上加入重金属离子，将所述培养基倒置并于28℃培养7d，从所述培养基上挑取表面光滑的圆形单菌落接种到斜面培养基上，在所述斜面培养基上得到粘质沙雷氏菌的原始菌株；
在液体培养基上接种所述原始菌株，于37℃恒温振荡培养过夜，得到菌液，取1mL所述菌液稀释至10-5倍，分别在6个灭菌平皿上铺上10mL稀释菌液，进行紫外线照射后分别吸取200μL所述稀释菌液涂布于含有6.0mg/L3-氨基-9-乙基咔唑的基本固体培养基上，于37℃恒温静置培养10h后进行富集重金属分析得到所述粘质沙雷氏菌。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，采用紫外线灯进行所述紫外线照射，所述紫外线灯的参数为：功率25W，紫外线波长253nm。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行紫外线照射时，6个铺有10mL稀释菌液的所述灭菌平皿的照射时间分别为0min、2min、4min、6min、8min和10min。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，将所述上清液采用10倍梯度稀释法进行稀释，得到浓度为10-2、10-3、10-4和10-5的菌液分别涂布到所述培养基上。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述培养基为含有Cr2+的肉汤培养基。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述粘质沙雷氏菌进行摇瓶发酵培养，所述摇瓶发酵培养的条件为：发酵温度35-37℃，发酵时间30-36h，转速200-225r/min。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述方法还包括：将所述粘质沙雷氏菌在10L发酵罐中进行试发酵，所述试发酵的条件为：装入4-7L发酵培养基，接种量3-5％，接种菌液浓度为2×108CFU/mL，发酵温度35-37℃，pH6.5-7.5，发酵时间30-36h，转速300-400r/min，通气量1：1。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，在进行富集重金属分析时所采用的重金属离子包括：Cd2+、Pb2+和Cr2+。
10.一种如权利要求1所述的粘质沙雷氏菌的应用，其特征在于，所述粘质沙雷氏菌用于修复重金属污染。
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