CN114908008B - 一株粘质沙雷氏菌菌株及其应用 - Google Patents

一株粘质沙雷氏菌菌株及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株粘质沙雷氏菌菌株及其应用，所述的菌株为粘质沙雷氏菌SerratiamarcescensLJY‑002，保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏编号为CCTCCNO.M20211467。本发明的菌株对市政污水治理中总磷的去除效果明显，且经过多次传代、反复验证仍具有较强的总磷去除能力，遗传稳定性好；污水处理厂在受到一定浓度铅离子冲击的条件下，常规生化污泥系统除磷能力受到严重影响，而投有本发明菌株的生化系统仍可保持较高水平的除磷能力，菌株对铅离子具有较好的耐受性，可提高生化系统抗冲击能力。因此，本菌株可提高污水处理生化系统除总磷能力，降低化学药剂的投加量，同时可以作为应急菌株，在受到含铅离子工业污水冲击下，恢复系统除磷能力，具有安全、绿色、高效的优点。

Description

一株粘质沙雷氏菌菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一株粘质沙雷氏菌菌株及其应用。本发明属于环境微生物领域。
背景技术
随着城市经济发展规模的迅速扩大，污水排放量持续增长，国家对水质的关注点也越来越高，污水厂排放水标准逐渐由《城镇污水处理厂污染物排放标准》(GB18918-2002)一级B提升至一级A。为实现污水深度处理与污水资源化，进一步提高城镇生活污水处理的除磷效果，各种水处理方法纷纷涌现，尽管有利用物理、化学作用除磷的除磷制剂产品上市，但价格高，使用工艺复杂，并且存在二次污染的可能。而除磷微生物制剂可以避免化学产品或其他药剂带来的水体污染，避免药剂残留对人和动物的危害，且具有能耗低、污染少、起效快和效率高等优点。
我国大多数城市的排水系统，下水道不仅输送生活污水还输送工业废水，由这两者所组成的城市混合污水中，不可避免地含有一定浓度的重金属盐类。在污水生物处理中，微生物作为污染物的重要分解者，重金属离子的过量存在会对活性污泥微生物的生理生化活性产生影响，消除敏感种或个体，进而影响活性污泥微生物群落的结构，并最终导致污水生物处理效率降低。而在生物除磷过程中Pb2+浓度增高时，对聚磷菌在好氧状态下吸磷会表现出毒性作用，出水磷含量超标。传统的重金属污染处理方法存在运行成本高、操作复杂且二次污染等问题，生物法具有操作简单、处理效率高、投资少、无二次污染等众多优点，尤其对处理低浓度含铅废水具有一定优势，其中微生物特别是细菌在此方面具有很大潜力，且自然界中种类多、分布广。
发明内容
为了解决污水处理工艺中总磷处理效率低、生产运营成本高且操作复杂等问题，本发明的首要目的在于提供一株粘质沙雷氏菌菌株。该菌株的发酵液可以与生化系统中的土著微生物共存，提高生化系统的除磷能力。
本发明的另一目的是作为应急菌株，在受到含铅离子工业污水冲击下，恢复生化系统除磷能力。
为实现上述目的，本发明提供一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002，是从生化池活性污泥分离纯化获得。
所述的粘质沙雷氏菌，命名为Serratia marcescens LJY-002，分类命名为Serratia marcescens LJY-002，保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center forType Culture Collection，简称CCTCC)，保藏日期：2021年11月22日，保藏地址：中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211467。
进一步的，本发明还提出了所述的粘质沙雷氏菌在污水处理中的应用。
其中，优选的，所述的污水为含铅离子工业污水。
其中，所述的粘质沙雷氏菌能够与生化系统中的微生物共存，提高生化系统除磷效率。
其中，所述的粘质沙雷氏菌对重金属铅有较好的耐受性，在含一定浓度铅离子污水冲击下，仍可以稳定发挥除磷作用。
其中，优选的，所述的铅离子浓度为30-120mg/L。
与现有技术相比，本发明的有益成果为：
(1)本发明提供的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002菌株，是水和土壤中的常居菌群，为细菌中最小者，生长繁殖速度较快。
(2)本发明的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002菌株可以与生化系统中的土著微生物共存，通过协同作用提高生物除磷效率。
(3)粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002菌株具有较强的重金属铅离子耐受能力，在受到含铅离子工业污水冲击下，仍可大量生长繁殖，维持稳定的除磷能力。
附图说明
图1是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002在YG固体培养基上的菌落形态图；
图2是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002经过异染颗粒染色反应结果；
图3是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002淀粉水解试验结果；
图4是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002油脂水解试验结果；
图5是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002明胶水解试验结果；
图6是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002葡萄糖发酵试验结果；
图7是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002乳糖发酵试验结果；
图8是粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002的生长曲线。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明作进一步说明，但本发明并不限于以下实施例。本领域技术人员应该理解的是，在不偏离本发明的精神及范围下可对本发明技术方案的细节和形式进行修改或替换，但这些修改和替换均落入本发明的保护范围内。
实施例1：菌种的筛选方法
1.1菌株的培养、分离、纯化
菌株来自于稳定运行的黑龙江省哈尔滨市文昌污水处理厂的生化池。取1mL活性污泥，加入100mL(100mL培养基装于250mL三角瓶中)YG液体培养基，150rpm/min，30℃震荡培养24h，取1mL菌液再次接入YG液体培养基中，置于相同条件培养，重复操作3次。
所述的YG液体培养基：酵母膏1g/L，葡萄糖1g/L，K2HPO4 0.3 g/L，KH2PO4 0.25g/L，MgSO4 0.2g/L，pH 7.0～7.2，121℃、30min高温灭菌处理。
YG固体培养基则在液体培养基配方的基础上，每1000mL液体培养基中加入琼脂20g加热融化制成。
用无菌移液枪分别吸出0.5mL的培养液于盛有4.5mL无菌水的离心管中，混匀，依次类推，制成10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7等不同浓度梯度的菌悬液。再分别吸出0.2mL各浓度梯度的稀释液，并用无菌三角玻璃刮刀将其均匀涂布于YG固体培养基上，每种稀释液重复涂布3次。然后把稀释涂布后的YG固体培养基倒置放入30℃的生化培养箱中，培养48h后，从各个稀释梯度平板上挑选出形态、大小不同的菌落，并于YG固体平板上开始划线分离，直到获得菌落形态特征一致的单一菌落，放入4℃的冰箱中保存备用。图1为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002在YG固体培养基上的菌落形态图。
1.2菌株的筛选
菌株初筛：Albert异染颗粒染色实验
①甲液:甲苯胺蓝0.15g，孔雀绿0.20g，冰醋酸1mL，酒精(95％)2mL，蒸馏水100mL。②乙液:碘2g，碘化钾3g，蒸馏水300mL。将上述筛选出的菌株好氧培养后，将菌液涂布在洗净消毒的载玻片上，自然风干，滴加甲液于载片上，15～30s后水洗风干，用乙液复染10～30s，用水洗净风干后，在电镜下观察异染颗粒的分布情况，选择具有异染粒颗粒的菌株。图2为粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002染色反应结果。
菌株复筛实验：
将初筛得到的菌株，接入合成废水，置于160rpm/min、30℃培养。并取相同菌量接入合成废水厌氧培养，测定好氧条件及厌氧条件下培养前后合成废水中磷含量，计算菌体吸磷和释磷量。重复筛选实验两次，根据菌体吸磷和释磷量大小进行复筛。
1.3菌种鉴定
分离纯化的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002菌株的16sDNA序列与Serratia marcescens的16sDNA序列的相似度为99％，基于16sDNA聚类分析显示该菌株LJY-002与Serratia marcescens聚为一支。
将所述的粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002菌株保藏在中国典型培养物保藏中心(China Center forType Culture Collection，简称CCTCC)，地址在中国.武汉.武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 20211467，保藏日期为2021年11月22日。
实施例2：菌株Serratia marcescens LJY-002的生理生化试验
对粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)LJY-002菌株的进行了一系列的生理生化试验，其中淀粉培养基组分为：蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，牛肉膏5g/L，可溶性淀粉2g/L，蒸馏水1000mL，琼脂15-20g，121℃、30min高温灭菌处理。
油脂培养基：蛋白胨10g/L，牛肉膏5g/L，NaCl 5g/L，香油或花生油10g/L，
1.6％中性红水溶液1mL，琼脂15-20g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.2，121℃、30min高温灭菌处理。
明胶培养基：牛肉膏蛋白胨液100mL，明胶12-18g，在水浴锅中将上述成分熔化，不断搅拌，熔化后调pH 7.2-7.4，121℃、30min高温灭菌处理。
蛋白胨水培养基：蛋白胨10g/L，NaCl 5g/L，蒸馏水1000mL，pH 7.6，121℃、30min高温灭菌处理。
糖发酵培养基：蛋白胨水培养基1000mL，1.6％溴甲酚紫乙醇溶液1-2mL，pH 7.6，另配20％糖溶液(葡萄糖，乳糖等)各10mL。将上述含指示剂的蛋白胨水培养基分装于试管中，在每管内放一倒置的小玻璃管，使充满培养液。将已分装好的蛋白胨水和20％的各种糖溶液分别灭菌，蛋白胨水121℃灭菌30min。灭菌后，每管以无菌操作分别加入20％的无菌糖溶液0.5mL(按每10mL培养基中加入20％的糖溶液0.5mL，则成1％的浓度)。
发酵培养基为牛肉膏蛋白胨培养基，其组分为：牛肉膏3g/L，蛋白胨10g/L，NaCl5g/L，KH2PO40.25g/L，pH 7.0～7.2，121℃、30min高温灭菌处理。
2.1淀粉水解试验
首先将固体淀粉培养基熔化后冷却至50℃左右，无菌操作制成平板。用记号笔在平板底部划成2部分。在不同的部分划线接种，将平板倒置在37℃温箱中培养24h，观察菌的生长情况，打开平板盖子，滴入少量卢戈氏碘液于平板中，轻轻旋转平板，使碘液均匀铺满整个平板。实验结果见图3，菌苔周围无透明圈出现，菌株Serratia marcescens LJY-002无产生胞外淀粉酶的能力。
2.2油脂水解试验
将熔化的固体油脂培养基冷却至50℃左右时，充分摇荡，使油脂均匀分布，无菌操作倒入平板，待凝，用记号笔在平板底部划成2部分，分别在两部分标上菌名，用无菌操作将菌株Serratia marcescens LJY-002接种于平板的相对应部分的中心，将平板倒置，37℃温箱中培养24h，取出平板，观察菌苔颜色。实验结果见图4，出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。
2.3明胶水解试验
取两只明胶培养基试管，用接种针分别穿刺接种菌株Serratia marcescens LJY-002，并将接种后的试管置20℃中培养2-5d，观察明胶液化情况。实验结果见图5，菌株Serratia marcescens LJY-002有明胶水解的能力。
2.4糖发酵试验
取葡萄糖发酵培养基试管2支，第一支不接种，作为对照，第二支接入菌株Serratia marcescens LJY-002。同样的，取乳糖发酵培养基试管2支，第一支不接种，作为对照，第二支接入菌株Serratia marcescens LJY-002。在接种后，轻缓摇动试管，使其均匀，防止倒置的小管进入气泡。将接过种和作为对照的试管均置37℃中培养24-48h。观察各试管颜色变化及德汉氏小管中有无气泡。实验结果分别见图6和图7，菌株Serratiamarcescens LJY-002葡萄糖发酵实验可产生颜色变化，而乳糖发酵则无变化。
2.5生长曲线的绘制
将菌株Serratia marcescens LJY-002接种至液体发酵培养基中，在无菌条件下，每三小时取样测定OD600，每组设置三组平行实验，取平均值。实验结果见图8，前18h为增长期，18h后菌株进入稳定期。
实施例3：菌株Serratia marcescens LJY-002的除磷效果验证
3.1污水模拟除磷验证实验
室温条件下，以文昌曝气沉砂池后端污水为验证对象，实验组接入粘质沙雷氏菌菌株Serratia marcescens LJY-002发酵液，投加量为体积比的10％，以未投加菌液为对照组，利用间歇曝气和净沉相结合的方式模拟生化反应，测定总磷，比较总磷的去除情况，进行两次重复实验，避免偶然性。实验结果见表1，在高浓度TP进水的条件下，反应24h后，对照组总磷去除率为77.8％，实验组总磷去除率为88.99％，投加菌株Serratia marcescensLJY-002发酵液后，总磷去除优势明显。
表1.污水模拟验证实验结果
进水TP(mg/L) 出水TP(mg/L) 去除率
对照组 13.4 2.975 77.8％
实验组 13.4 1.475 88.99％
3.2生化模拟除磷验证实验
为了验证菌种Serratia marcescens LJY-002的遗传稳定性，首先对菌种进行5次平板划线传代，再进行生化模拟验证实验。室温条件下，取文昌生化池泥水混合物为验证对象，实验组接入粘质沙雷氏菌菌株Serratia marcescens LJY-002发酵液，投加量为10％，未投加菌株Serratia marcescens LJY-002发酵液为对照组，利用间歇曝气和净沉相结合的方式模拟生化反应，测定总磷，比较总磷的去除情况，实验重复两次，避免偶然性。实验结果见表2，在正常进水条件下，对照组总磷去除率为70.86％；实验组总磷去除率为97.42％，且将总磷降至0.5以下，总磷去除效果明显，粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002可与土著微生物共同作用，提高生化系统的除磷能力。
表2.生化模拟验证实验结果
进水TP(mg/L) 出水TP(mg/L) 去除率
对照组 4.65 1.355 70.86％
实验组 4.65 0.12 97.42％
实施例4：重金属耐受性验证实验
4.1重金属耐受性筛选实验
本实验设置了9个实验组和1个对照组，实验分别取文昌生化池泥水混合物2L，实验组由1号至4号分别加入金属离子：Cu2+浓度20mg/L、Zn2+浓度95mg/L、Pb2+浓度90mg/L和Ni3+浓度35mg/L(注：关于重金属离子浓度的选择是由实验前期研究得到的，对生化系统总磷处理能力产生影响的崩溃值)；实验组5号至8号除分别加入与上述等量的重金属离子外，均加入粘质沙雷氏菌菌株Serratia marcescens LJY-002发酵液，接菌量均为10％；实验组9号仅加入菌株Serratia marcescens LJY-002发酵液，对照组加入相同量的无菌发酵液。利用间歇曝气和净沉相结合的方式模拟生化反应，测定总磷，比较总磷的去除情况。实验结果见表3，结果表明，在高浓度金属离子冲击下，生化污泥系统除磷能力降低；在浓度为90mg/L的Pb2+冲击下，生化系统总磷去除率为28.28％，而投加了菌株发酵液后，生化系统总磷去除率为80.33％，表明粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002对Pb2+具有较强的耐受性，可稳定维持系统除磷能力。
表3.重金属耐受性筛选实验结果
4.2粘质沙雷氏菌Serratia marcescens LJY-002对Pb2+的耐受性实验
为了确定菌株Serratia marcescens LJY-002对Pb2+的耐受程度，进行不同浓度Pb2+冲击耐受实验。本实验设置了9个实验组和1个对照组，实验分别取文昌生化池泥水混合物2L，实验组1号至4号分别加入的Pb2+浓度为：30mg/L、60mg/L、90mg/L和120mg/L。实验组5号至8号除分别加入与上述等量的重金属离子外，均加入粘质沙雷氏菌菌株Serratiamarcescens LJY-002发酵液，接菌量均为10％；实验组9号仅加入菌株Serratiamarcescens LJY-002发酵液，对照组加入相同量的无菌发酵液。利用间歇曝气和净沉相结合的方式模拟生化反应，测定总磷，比较总磷的去除情况。实验结果见表4，结果表明，随着Pb2+浓度的不断升高，生化污泥系统除磷能力逐渐降低，在Pb2+冲击浓度为120mg/L时总磷去除率仅为1.86％；而投加了粘质沙雷氏菌菌株Serratia marcescens LJY-002发酵液的实验组，随着Pb2+冲击浓度的不断升高，除磷效率虽呈现下降趋势，但去除率仍保持较高水平，在Pb2+冲击浓度为120mg/L时总磷去除率为85.29％，甚至高于未加菌的去除率为75.42％对照组。
表4.Pb2+耐受性实验结果

Claims (6)

1.一株粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)，命名为Serratia marcescens LJY-002，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 20211467。
2.权利要求1所述的粘质沙雷氏菌在污水处理中的应用。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的污水为含铅离子工业污水。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的粘质沙雷氏菌能够与生化系统中的微生物共存，提高生化系统除磷效率。
5.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的粘质沙雷氏菌对重金属铅有较好的耐受性，在含一定浓度铅离子污水冲击下，仍可以稳定发挥除磷作用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的铅离子浓度为30-120mg/L。
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