CN105670962A - 一株芳香烃的高效降解菌及其应用 - Google Patents

一株芳香烃的高效降解菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明公开了一株芳香烃的高效降解菌及其应用，属于环境污染物生物处理技术领域。本发明的纤维化纤维微细菌SS-2，保藏编号为：CCTCC？NO:M2016031。该菌株对苯、甲苯、苯乙烯均都具有较好的降解能力，说明该菌株具有较宽的底物利用能力和较强的有机溶剂耐受性。用该菌的生长态细胞在同时含有苯、甲苯、苯乙烯的无机盐培养基中培养发现该菌能够在较高的苯类底物浓度范围内以其为碳源快速生长，这从另一方面也说明该菌株具有较强的有机溶剂耐受性。该菌适于工业废水废气中苯类物质的降解，以期提高现有生物处理该类物质的效率。

Description

一株芳香烃的高效降解菌及其应用
技术领域
本发明涉及一株芳香烃的高效降解菌及其在单环芳香烃降解方面的应用，属于环境污染物生物处理技术领域。
背景技术
随着经济社会的快速发展，生活水平的不断提高，人们的生活状态已经不再是解决基本温饱问题和物质需求了，而是转变为对优质安全的生存环境的渴求，环境污染问题也越来越受到人们的重视，研究人员也一直致力于研究微生物对芳香烃类污染物的降解机理的研究。一些芳香烃类化合物能给人们的安全健康带来较大威胁，如苯、甲苯、苯乙烯能够对中枢神经系统产生麻痹作用，引起急性中毒，且对皮肤黏膜有刺激作用，其中苯已是明确的易致癌物。目前，处理含挥发性的芳香烃废气的方法主要有燃烧法、吸附法、吸收法、冷凝法、生物法。其中燃烧法对于处理低浓度和高浓度的有机废气均有较高的处理效率；吸收法、冷凝法处理高浓度的有机废气的效率较高；而吸附法和生物法则适用于处理低浓度有机废气。燃烧法处理过程一些有机物可能不能完全转化，产生有毒的中间产物；吸附法的运行成本高，且吸收液仍需进行再次处理；吸收法需要提供很高的压力，且吸收液需要回收；冷凝法的工艺较为复杂，样品的入口要求严格。生物法是利用微生物的自身代谢，通过微生物体内的酶促作用使苯环断裂，进一步代谢为其他中间产物，继而被微生物降解为二氧化碳和水。对于石油化工等产业中大量低浓度的芳香烃的治理而言，生物法与其他方法相比，在经济和技术方面都有较大的优越性。生物法处理挥发性有机化合物的工艺简单，成本低廉，且无二次污染，已经在一些国家得到广泛应用。但该技术在实际应用中仍然存在很多问题，其中一个问题是生物法处理低浓度的有机废气效果较好，但是处理高浓度的废气效果却很低。
因此，筛选一株耐有机溶剂并能高效降解芳香烃的单环芳香烃降解菌，对于进一步促进生物法降解单环芳香烃的应用极为重要。
发明内容
本发明的主要目的就是针对以上存在的问题与不足，提供一株能高效降解单环芳香烃的菌株使其应用于石油化工废水废气的处理。
本发明解决的第一个问题是提供了一株能高效降解单环芳香烃的菌株，所述菌株命名为纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)SS-2。
所述菌株筛选来自某公司的污水处理系统，其是通过构建快速筛选法而得到的。
优选地，所属菌株的16SrRNA基因序列的GenBank登录号为KU170621，与CellulosimicrobiumcellulansB107(GenBank:HQ877779.1)具有100％的相似性。
优选地，本发明所提供的菌株，属于革兰氏阳性菌，在LB培养基上为黄色，表面光滑湿润规则，边缘整齐，凸起，不透明，粘性较强。所述菌株能以单环芳烃为碳源进行生长。
所述菌株的筛选方法：在污水处理系统取样，采用加有苯、甲苯、苯乙烯的无机盐培养基驯化培养，在最后几次驯化完成的摇瓶中取培养液50uL均匀涂布于平板驯化筛选培养基培养，挑选出在平板培养基上单独的且长势较好的菌落划线分离，在平板驯化筛选培养基上转接3次得到纯化菌株。
所述菌株的适宜生长温度为25-30℃，能在模拟含单环芳香烃的废水中生长，并能降解其中的芳香烃。
本发明解决的另一个技术问题是提供了一株所述的纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)SS-2在单环芳香烃降解方面的应用。
所述应用，在本发明的一种实施方式中，是将对数生长期(即生长态细胞)的CellulosimicrobiumcellulansSS-2接种于含有苯类化合物(即苯、甲苯、苯乙烯)的无机盐培养基中进行培养，降解培养基中的单环芳香烃。所述培养，在本发明中的一种实施方式中，是指在温度为30℃，pH为7.0，转速为180r/min振荡培养40h以上。
本发明提供的纤维化纤维微细菌CellulosimicrobiumcellulansSS-2，与近十年文献报道新发现的苯类物质降解菌株相比，具有以下有益效果：(1)纤维化纤维微细菌CellulosimicrobiumcellulansSS-2能降解废水中的苯、甲苯、苯乙烯；(2)对苯、甲苯、苯乙烯具有较高的降解效率，当底物浓度约为30mg/L时，48h的降解率可达86％以上；(3)能够耐受较高浓度的单环芳香烃，在高浓度的单环芳香烃的混合液中仍能生长。
生物材料保藏
纤维化纤维微细菌CellulosimicrobiumcellulansSS-2，分类学命名为纤维化纤维微细菌CellulosimicrobiumcellulansSS-2，于2016年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2016031。
附图说明
图1：纤维化纤维微细菌SS-2在透射电镜下的细胞形态。
图2：纤维化纤维微细菌SS-2在含不同浓度甲苯的无机盐培养基中的降解曲线。
图3：纤维化纤维微细菌SS-2在含不同浓度苯乙烯的无机盐培养基中的降解曲线。
图4：纤维化纤维微细菌SS-2在含不同浓度苯的无机盐培养基中的降解曲线。
图5：纤维化纤维微细菌SS-2在含30mg/L苯、甲苯、苯乙烯的无机盐培养基中的降解曲线。
具体实施方式
实施例1：菌株驯化筛选
取石油污水处理系统中的污水2ml加入含50ml无机盐培养基的250ml锥形瓶中，之后加入苯、甲苯、苯乙烯的混合液5μl(苯、甲苯、苯乙烯浓度比为8:10:5)，密封瓶口(防止苯类物质的挥发)，在30℃，180r/min条件下摇床培养2d。然后以5％的接种量转接到新鲜的无机盐培养基中继续驯化(培养基中的苯类物质含量依次上升，摇瓶中苯类混合液添加量依次为5μl、15μl、25μl、40μl、50μl、60μl、75μl、90μl、100μl)。第六次驯化完成后(有菌落长出则继续提高驯化浓度)，每次取驯化后的菌液50uL均匀涂布于平板驯化筛选培养基培养4d，在平板培养基上选择出单独的且长势较好的菌落——划线分离，平板培养基转接3次获得纯菌。
实施例2：菌株鉴定
采用细菌全基因组快速抽提试剂盒，提取菌株纯培养物的全基因组，并通过16SrDNA通用引物进行PCR扩增，PCR扩增体系如下：50μlPCR反应体系含有双蒸水39.5μl，5μl的10倍缓冲液，1μl的dNTP，上游引物和下游引物各1μl，TaqDNA聚合酶1.25国际单位，基因组模板2μl。将扩增产物进行测序，通过序列对比鉴定出该菌株为纤维化纤维微细菌，命名为纤维化纤维微细菌SS-2(CellulosimicrobiumcellulansSS-2)。
实施例3：菌株生理生化研究
采用透射电镜观察上述SS-2的形态如图1。由图可知该菌为杆状，有荚膜、无鞭毛。该菌在25-30℃均能较好生长。
通过对该菌株进行革兰氏染色、荚膜染色、甲基红试验、V-P试验、接触酶试验等等生理生化试验确定该菌为革兰氏阳性、无鞭毛、有荚膜、甲基红试验为阳性、V-P试验为阴性、接触酶为阳性。
实施例4：生长态细胞菌株在单一单环芳香烃底物降解方面的应用
将处于对数生长期的纤维化纤维微细菌SS-2按2％的接种量接种到含单一芳香烃底物(分别为苯、甲苯、苯乙烯)的梯度浓度的的无机盐培养基中，浓度分别为30mg/L、60mg/L、90mg/L，控制初始pH为7.0，在30℃，180r/min摇床培养48h，每隔8h取一次样，做顶空气相色谱测培养液中的苯、甲苯和苯乙烯的含量。
其中无机盐培养基组成为：25mL磷酸盐缓冲液(K2HPO462g，NaH2PO433g，蒸馏水1000mL，调节pH至7.5)，NH4NO31g，MgSO4·7H2O0.5g，CaCl2·2H2O0.1g，1mL微量元素溶液(FeSO4·7H2O4.5g，ZnSO4·7H2O0.148g，MnSO4·H2O0.258g，CoCl2·6H2O0.024g，NiSO4·7H2O0.022g，CuCl20.013g，Na2MoO4·2H2O0.10g，H3BO30.062g，蒸馏水1000mL)，蒸馏水1000mL，121℃高压蒸汽灭菌20min，固体加2％琼脂。根据需要用移液枪加入适量苯、甲苯、苯乙烯混合物。
纤维化纤维微细菌SS-2对单一的苯类化合物均有较好的降解效果，在30mg/L、60mg/L、90mg/L的初始甲苯的浓度时，该菌的降解率分别为85％、80.8％、81.7％。在30mg/L、60mg/L、90mg/L的苯乙烯梯度浓度下，其降解率分别为88.7％、80.8％、83.8％。在该梯度下的苯底物中，该菌的降解率为74.7％、78％、79％。
该菌株的生长态细胞在含不同浓度苯、甲苯、苯乙烯的无机盐培养基中的降解情况如图图2、图3和图4所示。
实施例5：生长态细胞菌株在苯、甲苯、苯乙烯混合底物降解方面的应用
将处于对数生长期的纤维化纤维微细菌SS-2按2％的接种量接种到含30mg/L的苯、甲苯、苯乙烯混合底物的无机盐培养基中，控制初始pH为7.0，在30℃，180r/min摇床培养48h，每隔8h取一次样，做顶空气相色谱测培养液中的苯、甲苯和苯乙烯的含量。
纤维化纤维微细菌SS-2对苯类化合物具有较强的降解能力，当苯、甲苯、苯乙烯混合底物的初始浓度为30mg/L时，菌株在48h内对该三种芳香族化合物的降解均达到86％以上。
该菌株的生长态细胞在含苯类化合物的无机盐培养基中的苯类降解情况如图5所示。
在此说明书中，本发明已参照其特定的实施例作了描述。但是，很显然仍可以作出各种修改和变换而不背离本发明的精神和范围。因此，说明书和附图应被认为是说明性的而非限制性的。

Claims (5)

1.一株纤维化纤维微细菌(Cellulosimicrobiumcellulans)SS-2，2016年1月11日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2016031。
2.根据权利要求1所述纤维化纤维微细菌在降解人们生产过程中产生的单环芳香烃中的应用。
3.根据权利要求1所述纤维化纤维微细菌在降解苯、甲苯、苯乙烯这类含有单个苯环的物质中的应用。
4.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述降解单环芳香烃最适pH为7.0。
5.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述降解是化工产业产生的废水废气中单环芳烃的降解。
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