CN103667104B - 一种具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌及其在环境修复中的应用。本发明通过对广州市某河涌中活性污泥进行分离纯化，筛选出了一株对乙硫醇具有良好降解能力的芽孢杆菌，并将此芽孢杆菌命名为芽孢杆菌（Bacillussp.）GIGAN3，于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013396。本发明所得到的芽孢杆菌GIGAN3对环境中乙硫醇降解效果较好，可将其应用于降解环境中乙硫醇，实现环境修复的目的。

Description

一种具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有乙硫醇（Ethanethiol，EtSH）降解能力的芽孢杆菌及其在环境修复中的应用。

背景技术

乙硫醇（Ethanethiol,EtSH）是一种典型的恶臭有机污染物，具有低至0.00019ppm嗅阈值，高达710000ppm挥发性（25℃）。在乙硫醇浓度较低时就可以产生恶臭味，且容易被皮肤以及衣服等所吸附，对人体的生理及心理健康产生不利影响，如危害人体的中枢神经系统、呼吸系统、循环系统和消化系统。随着石油、化工和造纸业等的发展，越来越多的乙硫醇挥发到环境中，此外市政污水和垃圾处理厂也是乙硫醇的重要来源。现阶段国内外对乙硫醇的物理和化学治理方法主要包括有吸附法、吸收法、氧化法、燃烧法、光催化法等，同这些物理和化学方法相比，采用微生物法降解恶臭污染物具有成本低、降解彻底、无二次污染等优点，因此一直受到国内外研究者的关注。据报道，目前已有一部分研究者通过接种活性污泥或者接种混合菌种对乙硫醇进行降解研究，然而，使用分离培养新的单一菌种对乙硫醇进行降解研究的文献报道却非常有限，因此筛选出高效率、低成本的乙硫醇降解菌在恶臭有机废气的净化方面具有非常重要的意义。芽孢杆菌是一种革兰氏阳性菌、杆状，在固体培养基表面，菌体可形成白色、圆形、边缘整齐的菌落。迄今为止，还没有见到有关使用芽孢杆菌降解乙硫醇的相关报道及专利。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌。

本发明的另一目的在于提供所述具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌在环境修复方面的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌，命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）GIGAN3，于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013396；

所述具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌具有如下的形态和生理生化特性：

该芽孢杆菌菌体的形态特性如下：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的芽孢杆菌的细胞染色为革兰氏阳性，杆状（如图1）。

b.菌落的形态特性为：在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，乳白，不透明，菌落直径为1～2mm；

c.主要的生理生化特征如表1：

表1各项生理生化特征

所述具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQ ID:No.1所示。

所述具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌能够应用于修复环境，可降解环境中，如大气、水体和土壤中的乙硫醇。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及效果：

（1）本发明的菌株是首次从广东省广州市某河涌底泥筛选得到具有降解乙硫醇能力的芽孢杆菌。

（2）本发明的芽孢杆菌具有高效降解乙硫醇的能力，在底物浓度为2mg/L条件下降解120h，降解率可达100.0%。

附图说明

图1是本发明的芽孢杆菌GIGAN3在电子显微镜下的形态图。

具体实施方式

下面结合实例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明所述的具有降解乙硫醇能力的芽孢杆菌分离筛选自广东省广州市某河涌底泥。其分离纯化方法如下：所用的驯化培养基为无机盐培养基g/L（K₂HPO₄·3H₂O1.2，KH₂PO₄1.2，NH₄Cl0.4，MgSO₄·7H₂O0.2，FeSO₄·7H₂O0.2，1ml微量元素液（g/L）：CaCl₂·2H₂O0.2，MnSO₄·4H₂O0.2，CuSO₄·2H₂O0.01，ZnSO₄·7H₂O0.2，CoCl₂·6H₂O0.09，Na₂MoO₄·2H₂O0.12，H₃BO₃0.006）。首先取1g活性污泥，接种至含乙硫醇的无机盐培养基，在摇床温度35℃、转速150r/min驯化5天后，以15%接种量移入含下一浓度乙硫醇无机盐中接着驯化，底物驯化浓度梯度依次是2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L。将终驯化浓度稀释10^-1-10^-7倍，分别取稀释10^-6、10^-7倍的稀释液200ul涂布到以乙硫醇为唯一碳源的固体琼脂平板（含乙硫醇的固体培养基为：每升上述无机盐培养基中加入琼脂粉18g和乙硫醇4mg）上，放入37℃恒温箱中培养3天，挑选不同形态单菌落进行乙硫醇降解率的测定，选择降解率最高的菌种进行菌种鉴定。

将挑选得到的菌落进行鉴定，鉴定结果如下：

（1）菌体的形态特性：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，所筛选的芽孢杆菌的细胞染色为革兰氏阳性；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为0.5～0.8×6～8μm，周生鞭毛，如图1所示；

b.菌落的形态特性：在LB固体培养基培养24h后，菌落边缘整齐，圆形，乳白色，不透明，菌落直径为1～2mm；

c.主要的生理生化特征如表2所示：

表2各项生理生化特征

上述结果表明本发明所筛选的细菌与芽孢杆菌属的生理生化特性很相似。

（2）提取细菌基因组DNA，采用细菌的16S rDNA通用引物：

上游引物：F27（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）

下游引物:R1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）

扩增其16S rDNA全部基因，测序结果如下（SEQ ID:No.1）：

GTGCTATACATGCAAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGT-CGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGGGGTAACCTT

将长为1416bp的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与Bacillus sp.cp-h24的同源性高达99%。

综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属芽孢杆菌属的一个新变种，命名为芽孢杆菌（Bacillus sp.）GIGAN3。

所述菌株于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013396。

实施例2

本发明筛选得到的芽孢杆菌GIGAN3对乙硫醇具有较好的降解能力：

往300ml的血清瓶中加入无机盐溶液100ml（每100ml无机盐溶液含：K₂HPO₄·3H₂O0.12g，KH₂PO₄0.12g，NH₄Cl0.04g，MgSO₄·7H₂O0.02g，FeSO₄·7H₂O0.001g，CaCl₂·2H₂O0.02g，MnSO₄·4H₂O0.02g，CuSO₄·2H₂O0.001g，ZnSO₄·7H₂O0.02g，CoCl₂·6H₂O0.009g，Na₂MoO₄·2H₂O0.012g，H₃BO₃0.0006g，双蒸水100ml）,于121℃高压灭菌30min。将斜面保存的GIGAN3菌种接种至LB富集培养基，在30℃，200r/min的摇床中活化菌体24h，菌液离心，收集菌体，以5%的接种量接入含上述无机盐血清瓶中，加入乙硫醇使其初始浓度依次为2mg/L、4mg/L、8mg/L、16mg/L、24mg/L，加盖密封后在摇床温度30℃、振荡频率120r/min下开始降解试验，采用装有氢焰离子化检测器（FID）HP6890气相色谱定期从血清瓶顶空中取样测定气相中乙硫醇浓度的变化，同时利用亨利定律获得其在液相中的降解率。气相色谱装备HP-5MS毛细管柱（0.25mm×0.25μm×30m,Agilent Technologies），检测条件为：检测器温度230℃，进样口温度200℃，柱温40℃保持2分钟，以5℃/min升高至100℃后保留1分钟，以25℃/min升高至230℃。采用Agilent500μL气密针进样，进样量为300μL，不分流模式。结果如表3所示：

表3不同初始浓度的乙硫醇的降解率

乙硫醇浓度	降解率
		2mg/L	100.0%
4mg/L	81.1%
		8mg/L	76.7%
16mg/L	71.7%
		24mg/L	52.3%

从表3中可以看出，本发明筛选得到芽孢杆菌GIGAN3对乙硫醇的降解能力最高可达100.0%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims (3)

1.一种具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌（Bacillus sp.），其特征在于：所述菌种的名称为芽孢杆菌（Bacillus sp.）GIGAN3，于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013396。

2.权利要求1所述的具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌在环境修复中的应用。

3.根据权利要求2所述的具有乙硫醇降解能力的芽孢杆菌在环境修复中的应用，其主要特征是：所述芽孢杆菌能够降解大气、水体或土壤中的乙硫醇。