CN112919628A - 厌氧副梭状芽孢杆菌s2及其在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用 - Google Patents

厌氧副梭状芽孢杆菌s2及其在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于抗生素降解技术领域，具体涉及厌氧副梭状芽孢杆菌S2在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用，为挖掘具有高效降解氟喹诺酮类抗生素的厌氧菌，本发明从处理环丙沙星的生物反应器污泥中分离纯化出一株环丙沙星耐受厌氧菌，该菌属Paraclostridium属，是一株厌氧副梭状芽孢杆菌，即Paraclostridium bifermentans S2，该菌对环丙沙星、恩诺沙星以及氧氟沙星均具有较高的降解效率，可应用于含氟喹诺酮类抗生素废水的厌氧生物处理中；本发明不仅提供了厌氧副梭状芽孢杆菌S2的新应用方向，而且为氟喹诺酮类抗生素的降解以及含氟喹诺酮类抗生素废水的处理提供了新的途径。

Description

厌氧副梭状芽孢杆菌S2及其在降解氟喹诺酮类抗生素中的 应用
技术领域
本发明属于抗生素降解技术领域，具体涉及厌氧副梭状芽孢杆菌S2在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用。
背景技术
抗生素自发现以来，被广泛用于细菌感染性疾病的治疗。抗生素除了用于人类疾病的治疗以外，还同时作为饲料添加剂被大量应用于畜禽养殖业。我国是抗生素的生产和消费大国，据2013年的一项研究显示，我国抗生素总使用量约为16.2万吨，其中48％为人用抗生素，其余为兽用抗生素。氟喹诺酮类抗生素是第三代喹诺酮类抗生素，是目前世界上使用最广泛的广谱类抗生素之一。临床上应用的主要有恩诺沙星、氧氟沙星、环丙沙星、诺氟沙星以及洛美沙星等。其中，环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星是生活中常用的三种抗生素，是氟喹诺酮类抗生素中的代表性药物。
氟喹诺酮类抗生素在为人类带来便利的同时，也带来了环境污染问题。抗生素生产和使用过程中会产生大量废水，且由于其本身的抗菌性，含有抗生素的废水会对微生物产生一定的毒性，过高的毒性会使微生物死亡，从而影响生物处理的效果。含抗生素废水经传统污水处理工艺处理后排放到环境中，其中残留的抗生素可生物降解性低，容易在环境中长期存在造成严重的环境污染问题，如加剧细菌的耐药性，还可能抑制植物的光合作用，进而危害到整个水生态系统及人类健康。
目前废水中抗生素的去除主要有物理法、化学法和生物法。相较其他方法，生物法因其经济可行、对环境不易造成二次污染而成为目前重要的研究方向。其中采用好氧生物为主的废水处理工艺，存在能耗高、运行成本高、剩余污泥产量大的缺点，而厌氧生物处理因其适用于处理高浓度废水、运行成本低、污泥产量低等优点，在废水处理领域得到了广泛关注。因此，挖掘具有高效降解氟喹诺酮类抗生素的厌氧菌具有重要意义。
发明内容
为了克服上述现有技术的不足，本发明提出了厌氧副梭状芽孢杆菌S2(Paraclostridium bifermentans S2)在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用，该菌株具有高效降解氟喹诺酮类抗生素的功效，特别是对含氟喹诺酮类抗生素废水的厌氧生物处理具有重要意义。
为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：
本发明提供了厌氧副梭状芽孢杆菌S2在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用。
本发明还提供了厌氧副梭状芽孢杆菌S2在处理含氟喹诺酮类抗生素废水中的应用。
优选地，所述氟喹诺酮类抗生素包括但不限于环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星。
优选地，所述氟喹诺酮类抗生素的浓度不大于20mg/L。
本发明从处理环丙沙星的生物反应器污泥中分离纯化出一株环丙沙星耐受厌氧菌，经鉴定，该菌与菌种Paraclostridium bifermentans strain W18006C2(GenBank编号为KP944166.1)的相似程度高达100％，属于Paraclostridium属，是一株厌氧副梭状芽孢杆菌，并将其命名为Paraclostridium bifermentans S2(厌氧副梭状芽孢杆菌S2)，于2020年11月19日送往广东省微生物菌种保藏中心进行保藏，保藏编号为GDMCC NO：61295；经环丙沙星、恩诺沙星以及氧氟沙星去除实验发现，该菌对5mg/L、10mg/L和20mg/L环丙沙星的去除率分别为74.0％、76.7％和63.9％；对5mg/L、10mg/L和20mg/L恩诺沙星的去除率分别为85.4％、72.9％和34.4％；对5mg/L、10mg/L和20mg/L氧氟沙星的去除率分别为63.9％、72.2％和52.7％；说明该菌对环丙沙星、恩诺沙星以及氧氟沙星均具有较高的降解效率，可应用于含氟喹诺酮类抗生素废水的厌氧生物处理中。
优选地，在应用时，将厌氧副梭状芽孢杆菌S2直接使用或固定化后使用。
本发明还提供了一种降解氟喹诺酮类抗生素的菌剂，所述菌剂以厌氧副梭状芽孢杆菌S2作为主要活性成分。
优选地，所述菌剂还包括菌剂领域上可接受的辅料，比如液体培养基以及其他填充剂或者载体。
优选地，所述氟喹诺酮类抗生素包括但不限于环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星。
本发明还提供了上述的降解氟喹诺酮类抗生素的菌剂的制备方法，即将厌氧副梭状芽孢杆菌S2接种到液体培养基中，经过培养后收集菌液即得。
优选地，所述液体培养基包括Na2SO4，NH4Cl，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4，酵母提取物，CH3COONa，FeSO4·7H2O，C3H8ClNO2S·H2O(L-半胱氨酸盐酸盐水合物)，微量元素储备液。
进一步地，所述液体培养基的具体组成为：
每1000mL培养基组成为：1000mgNa2SO4，1000mgNH4Cl，100mg CaCl2·2H2O，2000mgMgSO4·7H2O，500mg KH2PO4，1000mg酵母提取物，1000mg CH3COONa，500mg FeSO4·7H2O，500mg C3H8ClNO2S·H2O(L-半胱氨酸盐酸盐水合物)，5mL微量元素储备液，其余为水。
更优选地，所述微量元素储备液包括KI，FeCl3·6H2O，H3BO3，CuSO4，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O。
进一步地，所述微量元素储备液每1000mL组成为：0.2mg KI，5mg FeCl3·6H2O，0.5mg H3BO3，0.5mg CuSO4，0.625mg MnSO4·H2O，0.375mg ZnSO4·7H2O，其余为水。
优选地，所述培养为35℃恒温静置培养不少于1天。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
本发明从处理环丙沙星的生物反应器污泥中分离纯化出一株环丙沙星耐受厌氧菌，该菌属Paraclostridium属，是一株厌氧副梭状芽孢杆菌，即Paraclostridiumbifermentans S2，该菌对环丙沙星、恩诺沙星以及氧氟沙星均具有较高的降解效率，可应用于含氟喹诺酮类抗生素废水的厌氧生物处理中；本发明不仅提供了厌氧副梭状芽孢杆菌S2的新应用方向，而且为氟喹诺酮类抗生素的降解以及氟喹诺酮类废水的处理提供了新的途径。
附图说明
图1为厌氧副梭状芽孢杆菌S2的获取流程图；
图2为厌氧副梭状芽孢杆菌S2对三种具有代表性氟喹诺酮类抗生素的去除率；
图3为厌氧副梭状芽孢杆菌S2凝胶小球对环丙沙星的去除率。
具体实施方式
下面对本发明的具体实施方式作进一步说明。在此需要说明的是，对于这些实施方式的说明用于帮助理解本发明，但并不构成对本发明的限定。此外，下面所描述的本发明各个实施方式中所涉及的技术特征只要彼此之间未构成冲突就可以相互组合。
下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法，下述实施例中所用的试验材料，如无特殊说明，均为可通过常规的商业途径购买得到的。
实施例1厌氧副梭状芽孢杆菌S2的获取
本实施例所用到的液体培养基的具体组成如下：
每1000mL培养基组成为：1000mgNa2SO4，1000mgNH4Cl，100mg CaCl2·2H2O，2000mgMgSO4·7H2O，500mg KH2PO4，1000mg酵母提取物，1000mg CH3COONa，500mg FeSO4·7H2O，500mg C3H8ClNO2S·H2O(L-半胱氨酸盐酸盐水合物)，5mL微量元素储备液，其余为水。
所添加的微量元素储备液每1000mL组成为：0.2mg KI，5mg FeCl3·6H2O，0.5mgH3BO3，0.5mg CuSO4，0.625mg MnSO4·H2O，0.375mg ZnSO4·7H2O，其余为水。
如图1所示，厌氧副梭状芽孢杆菌S2的获取方法包括以下步骤：
(1)筛选富集
将处理环丙沙星生物反应器内的污泥混合均匀，从中取出10mL污泥，接种到100mL血清瓶中，血清瓶中事先装有90mL环丙沙星浓度为10mg/L的灭菌液体培养基，经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养10天，得到第一次筛选富集后的菌液。然后从中取10mL上清液，转移到100mL血清瓶中，血清瓶中事先装有90mL环丙沙星浓度为20mg/L的灭菌液体培养基，经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养10天，得到二次筛选富集后的菌液。接着以10mg/L的浓度梯度提高液体培养基中环丙沙星的浓度，按上述方法再重复操作三次，直至在环丙沙星浓度为50mg/L的灭菌液体培养基中培养10天，得到最终的混合菌液。
(2)梯度稀释
取1mL步骤(1)中最终所得的混合菌液，使用厌氧管分别按照101、102、103、104、105、106、107、108、109的梯度进行梯度稀释。
(3)纯化富集
将上述9个稀释梯度的混合菌液各设置三次平行重复进行平板涂布：取0.1mL菌液进行平板涂布，使菌液均匀地涂布在已灭菌的固体培养基(环丙沙星浓度为50mg/L，其余成分组成除了加入2％的琼脂以外，与前述液体培养基相同)上，在35℃的恒温厌氧培养箱中倒置培养14天。
通过观察，选取菌落清晰可见且菌落数量适中的两个梯度(105和106)对应的平板，进行下一步的纯化分离。
挑取培养基上差异明显、特征典型的优势单菌落，接种至100mL的血清瓶中进行富集培养，血清瓶中事先盛有100mL已灭菌的液体培养基(环丙沙星浓度为50mg/L)。经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养10天，可明显观察到血清瓶中存在黑色絮状体。
(4)纯化
对上述步骤所得菌液，分别在已灭菌的固体培养基(环丙沙星浓度为50mg/L，其余成分组成除了加入2％的琼脂以外，与前述液体培养基相同)上进行平板划线，并将固体培养基在35℃恒温厌氧培养箱中倒置培养14天。
然后将平板上生长完好的菌落接种至100mL血清瓶中进行富集培养，血清瓶中事先盛有100mL灭菌液体培养基(环丙沙星浓度为50mg/L)。经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养10天。重复上述步骤三次，直至平板上的菌落形态一致、无差异，即初步判定为纯菌，最终成功分离出1株环丙沙星耐受厌氧菌株。
将富集得到的环丙沙星耐受厌氧菌株送上海派森诺生物科技有限公司检测，经过16S rRNA序列检测及NCBI数据库比对，其与菌种Paraclostridium bifermentans strainW18006C2(GenBank编号为KP944166.1)的相似程度高达100％，属于Paraclostridium属，是一株厌氧副梭状芽孢杆菌，并将其命名为Paraclostridium bifermentans S2(厌氧副梭状芽孢杆菌S2)，最后将该菌株送至菌种保藏中心进行保藏，具体保藏信息如下：
菌株的分类地位：Paraclostridium bifermentans；
菌株名称：Paraclostridium bifermentans S2；
保藏编号：GDMCC NO：61295；
保藏日期：2020年11月19日；
保藏单位名称：广东省微生物菌种保藏中心；
保藏单位地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例2环丙沙星去除实验
采用实施例1分离得到的厌氧副梭状芽孢杆菌S2进行环丙沙星去除实验，检测目的菌株对环丙沙星的去除能力，包括如下步骤：
将厌氧副梭状芽孢杆菌S2接种至100mL的血清瓶中进行富集培养，血清瓶中事先盛有100mL已灭菌的液体培养基(成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养1天，可明显观察到血清瓶中存在黑色絮状体，经过搅拌混匀得到厌氧副梭状芽孢杆菌S2的菌液。
接种10mL上述步骤富集所得的菌液(OD600＝1)至100mL血清瓶中(已提前充入氮气以排出空气)，血清瓶中装有90mL已灭菌液体培养基(环丙沙星浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L，其余成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡使液体混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养3天，测定所得菌株对环丙沙星的去除情况。
如图2所示，厌氧副梭状芽孢杆菌S2对5mg/L、10mg/L和20mg/L环丙沙星的去除率分别为74.0％、76.7％和63.9％。
原生物反应器(功能微生物为硫酸盐还原菌)处理5mg/L环丙沙星的去除率仅为62.0％(Jia,Y.,Khanal,S.K.,Shu,H.,Zhang,H.,Chen,G.H.,Lu,H.,2018.Ciprofloxacindegradation in anaerobic sulfate-reducing bacteria(SRB)sludge system:Mechanism andpathways.Water Res.136,64-74.)。可见，与原生物反应器去除环丙沙星的能力相比，本发明的厌氧副梭状芽孢杆菌S2对5mg/L环丙沙星的去除率提高了12.0％，证明厌氧副梭状芽孢杆菌S2是一种高效降解环丙沙星的厌氧菌。
实施例3恩诺沙星去除实验
采用实施例1分离得到的厌氧副梭状芽孢杆菌S2进行恩诺沙星去除实验，检测目的菌株对恩诺沙星的去除能力，包括如下步骤：
将厌氧副梭状芽孢杆菌S2接种至100mL的血清瓶中进行富集培养，血清瓶中事先盛有100mL已灭菌的液体培养基(成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养1天，可明显观察到血清瓶中存在黑色絮状体，经过搅拌混匀得到厌氧副梭状芽孢杆菌S2的菌液。
接种10mL上述步骤富集所得的菌液(OD600＝1)至100mL血清瓶中(已提前充入氮气以排出空气)，血清瓶中装有90mL已灭菌液体培养基(恩诺沙星浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L，其余成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡使液体混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养3天，测定所得菌株对恩诺沙星的去除情况。
如图2所示，厌氧副梭状芽孢杆菌S2对5mg/L、10mg/L和20mg/L恩诺沙星的去除率分别为85.4％、72.9％和34.4％。
实施例4氧氟沙星去除实验
采用实施例1分离得到的厌氧副梭状芽孢杆菌S2进行氧氟沙星去除实验，检测目的菌株对氧氟沙星的去除能力，包括如下步骤：
将厌氧副梭状芽孢杆菌S2接种至100mL的血清瓶中进行富集培养，血清瓶中事先盛有100mL已灭菌的液体培养基(成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养1天，可明显观察到血清瓶中存在黑色絮状体，经过搅拌混匀得到厌氧副梭状芽孢杆菌S2的菌液。
接种10mL上述步骤富集所得的菌液(OD600＝1)至100mL血清瓶中(已提前充入氮气以排出空气)，血清瓶中装有90mL已灭菌液体培养基(氧氟沙星浓度分别为5mg/L、10mg/L、20mg/L，其余成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡使液体混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养3天，测定所得菌株对氧氟沙星的去除情况。
如图2所示，厌氧副梭状芽孢杆菌S2对5mg/L、10mg/L和20mg/L氧氟沙星的去除率分别为63.9％、72.2％和52.7％。
实施例5厌氧副梭状芽孢杆菌S2的固定化及其对环丙沙星的去除效果
采用实施例1分离得到的厌氧副梭状芽孢杆菌S2进行固定化，包括如下步骤：
将厌氧副梭状芽孢杆菌S2接种至100mL的血清瓶中进行富集培养，血清瓶中事先盛有100mL已灭菌的液体培养基(成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养1天，可明显观察到血清瓶中存在黑色絮状体，经过搅拌混匀得到厌氧副梭状芽孢杆菌S2的菌液。
用去离子水制备50mL 2～6％(w/v)的海藻酸钠溶液、500mL 3％～5％(w/v)的CaCl2溶液，灭菌。
待海藻酸钠溶液与CaCl2溶液冷却至室温后，将等体积的厌氧副梭状芽孢杆菌S2的菌液(OD600＝1)与海藻酸钠溶液混合均匀。将该混合液匀速滴入不断搅拌的CaCl2溶液中，交联2～6h。形成的凝胶小球用去离子水冲洗三次，置于0.9％的NaCl溶液中于4℃下保存备用。
下面对本应用例的具体实施方式作进一步说明：
将已灭菌且冷却后的50mL 4％(w/v)的海藻酸钠溶液与等体积的厌氧副梭状芽孢杆菌S2菌液(OD600＝1)混合均匀。将该混合液匀速滴入不断搅拌的500mL 4％(w/v)的CaCl2溶液，交联2h。形成的凝胶小球用去离子水冲洗三次，置于0.9％的NaCl溶液中于4℃下保存备用。
按10％v/v的体积比，将凝胶小球加入至100mL血清瓶中(已提前充入氮气以排出空气)，血清瓶中装有90mL已灭菌液体培养基(环丙沙星浓度为5mg/L，其余成分组成与实施例1所述的液体培养基相同)。经充分震荡使液体混合均匀后置于35℃恒温培养箱中静置培养3天，测定凝胶小球对环丙沙星的去除情况。
如图3所示，凝胶小球对5mg/L环丙沙星的去除率为66.36％。
综合实施例2-5可见，厌氧副梭状芽孢杆菌S2对环丙沙星、恩诺沙星以及氧氟沙星均具有较高的降解效率，可应用于含氟喹诺酮类抗生素废水的厌氧生物处理中。
以上对本发明的实施方式作了详细说明，但本发明不限于所描述的实施方式。对于本领域的技术人员而言，在不脱离本发明原理和精神的情况下，对这些实施方式进行多种变化、修改、替换和变型，仍落入本发明的保护范围内。

Claims (10)

1.厌氧副梭状芽孢杆菌S2在降解氟喹诺酮类抗生素中的应用。
2.厌氧副梭状芽孢杆菌S2在处理含氟喹诺酮类抗生素废水中的应用。
3.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，所述氟喹诺酮类抗生素包括但不限于环丙沙星、恩诺沙星、氧氟沙星。
4.根据权利要求1或2所述的应用，其特征在于，在应用时，将厌氧副梭状芽孢杆菌S2直接使用或固定化后使用。
5.一种降解氟喹诺酮类抗生素的菌剂，其特征在于，所述菌剂以厌氧副梭状芽孢杆菌S2作为主要活性成分。
6.权利要求5所述的降解氟喹诺酮类抗生素的菌剂的制备方法，其特征在于，将厌氧副梭状芽孢杆菌S2接种到液体培养基中，经过培养后收集菌液即得。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述菌剂还包括菌剂领域上可接受的辅料。
8.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述液体培养基包括Na2SO4，NH4Cl，CaCl2·2H2O，MgSO4·7H2O，KH2PO4，酵母提取物，CH3COONa，FeSO4·7H2O，C3H8ClNO2S·H2O(L-半胱氨酸盐酸盐水合物)，微量元素储备液。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，所述微量元素储备液包括KI，FeCl3·6H2O，H3BO3，CuSO4，MnSO4·H2O，ZnSO4·7H2O。
10.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，所述培养为35℃恒温静置培养不少于1天。
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