CN113174351A - 一种抗病促生型混合微生物菌群 - Google Patents

一种抗病促生型混合微生物菌群 Download PDF

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Abstract

本发明公开一种抗病促生型混合微生物菌群，属于微生物技术领域。本发明菌群包括黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌种分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×1010CFU/mL发酵液，按比例后混合得到。本发明筛选具有生防促生功能的菌种组成混合菌群，协同增效，在有效防控黄瓜根结线虫病的同时，有效提升黄瓜品质和产量。

Description

一种抗病促生型混合微生物菌群
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种抗病促生型混合微生物菌群。
背景技术
根结线虫(Meloidogyne spp.)是一类重要的土传性病原物。我国温室蔬菜存在不同程度的根结线虫为害，每年造成的经济损失非常大。目前，施用化学农药仍是防治线虫病害的主要措施，而由此带来的环境及食品安全问题成为发展有机农业的主要障碍。目前黄瓜根结线虫在长年连作的设施内危害越来越严重，在对其防治上主要以化学防治为主，化学药剂毒性高、效果差，且污染环境、影响产品的质量安全。大量的研究表明，利用自然界线虫天敌微生物进行生物防治及生态调控是控制线虫病害最为安全、有效的措施，也是目前国内外研究的热点。
根际促生菌是自由生活在根围土壤或附生于根表、根内的可促进植物生长及其对矿质营养的吸收和利用，并能抑制有害生物的有益菌类。根际促生菌可以通过一种或多种机制直接或间接的促进植物生长。通过固氮、解磷、解钾、产植物激素、酶解降低乙烯等作用，增加土壤养分，促进根系对矿质的吸收利用，直接刺激和调节植物生长；另一方面，通过产生抗生素和分泌铁载体、HCN等物质，其可以抑制土壤中有害病原微生物，间接的保护和促进植物生长。接种根际促生菌，不但能够减少化肥农药的使用，也能减轻因大量使用化肥农药而造成的环境污染和食品安全问题。
将生防菌和促生菌组成复配菌剂，一方面可以提升作物抗病虫害的功效，另一方面可以促进作物生长，提升产量和品质。
发明内容
本发明筛选具有生防促生功能的菌种组成混合菌群，协同增效，在有效防控黄瓜根结线虫病的同时，有效提升黄瓜品质和产量。
为实现上述技术目的，本发明所采用的技术方案为：
一种抗病促生型混合微生物菌群，包括黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌种分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×10 10CFU/mL发酵液，按比例后混合得到本发明混合菌液。
进一步的，所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，pH值7.2—7.4，121℃灭菌19min，固体培养基另加琼脂粉15g。
进一步的，菌种在LB固体培养基上活化的条件为：25-28℃恒温培养10-18h。
进一步的，LB液体培养基扩大培养的条件为：往复式摇床150r·min-1，28℃恒温培养24h。
进一步的，发酵液的混合比例为1-3:2-6:5-10。
根据实际使用情况，可将菌群制备成固体颗粒使用，这样更利于方面快捷的施用。
具体制备方法为：
将本发明混合菌液加入到无菌的草炭土中，同时加入膨润土作为粘结剂，可溶性淀粉作为崩解剂，获得含功能菌株的固形物，置于阴凉处风干1-2d。然后用造粒机造粒得到混合菌的微粒。
其中，黄麻链霉菌Streptomyces corchorusii，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月5日，保藏编号：CGMCC4.7392。
其中，副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月20日，保藏编号：CGMCC1.15832。
其中，解纤维素根瘤菌Rhizobium cellulosilyticum，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月30日，保藏编号：CGMCC1.15995。
在黄瓜种植过程中，常年施肥和使用农药，会严重的导致土壤板结、富营养化等各种土壤问题，而过渡使用农药则会造成致病菌抗药性增强，最终只会导致黄瓜品质和产量的整体性下降。
本发明为使用具有生物活性的微生物菌种组成的菌剂，利用其产生的活性物质，提升土壤生态活性，同时促进黄瓜生长提升抗病能力。本发明三种菌均属于根际促生菌，具备溶磷解钾固氮等多种益生功效，其中黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌能够产生赤霉素等抗生素、水解酶和酶抑制剂等生物活性物质，能够降低根结线虫卵和2龄幼虫(J2)活性，同时所产生的活性物质在与黄瓜病原菌的互作过程中产生的蛋白激发子能激发植物防御反应，提高作物免疫力，预防或减轻病害发生；而解纤维素根瘤菌不仅具有一定的固氮能力，还可分泌IAA、产铁载体、溶磷和解钾的特性，为黄瓜提供天然的营养元素。三种菌相互配合、协同增效，共同实现对黄瓜的抗病促生作用。
附图说明
图1为本发明种植试验黄瓜根际照片，其中s3为实施例3、d1-d3为对比例1-3、CK为空白对照组。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明的技术方案做进一步说明，但不限于此。
实施例1
一种抗病促生型混合微生物菌群，包括黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌种分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×10 10CFU/mL发酵液，按比例后混合得到本发明混合菌液。
进一步的，所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，pH值7.2—7.4，121℃灭菌19min，固体培养基另加琼脂粉15g。
进一步的，菌种在LB固体培养基上活化的条件为：25℃恒温培养10h。
进一步的，LB液体培养基扩大培养的条件为：往复式摇床150r·min-1，28℃恒温培养24h。
进一步的，发酵液的混合比例为1:2:5。
根据实际使用情况，可将菌群制备成固体颗粒使用，这样更利于方面快捷的施用。
具体制备方法为：
将本发明混合菌液加入到无菌的草炭土中，同时加入膨润土作为粘结剂，可溶性淀粉作为崩解剂，获得含功能菌株的固形物，置于阴凉处风干1-2d。然后用造粒机造粒得到混合菌的微粒。
其中，黄麻链霉菌Streptomyces corchorusii，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月5日，保藏编号：CGMCC4.7392。
其中，副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月20日，保藏编号：CGMCC1.15832。
其中，解纤维素根瘤菌Rhizobium cellulosilyticum，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月30日，保藏编号：CGMCC1.15995。
实施例2
一种抗病促生型混合微生物菌群，包括黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌种分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×10 10CFU/mL发酵液，按比例后混合得到本发明混合菌液。
进一步的，所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，pH值7.2—7.4，121℃灭菌19min，固体培养基另加琼脂粉15g。
进一步的，菌种在LB固体培养基上活化的条件为：28℃恒温培养15h。
进一步的，LB液体培养基扩大培养的条件为：往复式摇床150r·min-1，28℃恒温培养24h。
进一步的，发酵液的混合比例为2:4:7。
根据实际使用情况，可将菌群制备成固体颗粒使用，这样更利于方面快捷的施用。
具体制备方法为：
将本发明混合菌液加入到无菌的草炭土中，同时加入膨润土作为粘结剂，可溶性淀粉作为崩解剂，获得含功能菌株的固形物，置于阴凉处风干1-2d。然后用造粒机造粒得到混合菌的微粒。
其中，黄麻链霉菌Streptomyces corchorusii，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月5日，保藏编号：CGMCC4.7392。
其中，副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月20日，保藏编号：CGMCC1.15832。
其中，解纤维素根瘤菌Rhizobium cellulosilyticum，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月30日，保藏编号：CGMCC1.15995。
实施例3
一种抗病促生型混合微生物菌群，包括黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌种分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×10 10CFU/mL发酵液，按比例后混合得到本发明混合菌液。
进一步的，所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，pH值7.2—7.4，121℃灭菌19min，固体培养基另加琼脂粉15g。
进一步的，菌种在LB固体培养基上活化的条件为：28℃恒温培养18h。
进一步的，LB液体培养基扩大培养的条件为：往复式摇床150r·min-1，28℃恒温培养24h。
进一步的，发酵液的混合比例为3:6:10。
根据实际使用情况，可将菌群制备成固体颗粒使用，这样更利于方面快捷的施用。
具体制备方法为：
将本发明混合菌液加入到无菌的草炭土中，同时加入膨润土作为粘结剂，可溶性淀粉作为崩解剂，获得含功能菌株的固形物，置于阴凉处风干1-2d。然后用造粒机造粒得到混合菌的微粒。
其中，黄麻链霉菌Streptomyces corchorusii，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月5日，保藏编号：CGMCC4.7392。
其中，副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月20日，保藏编号：CGMCC1.15832。
其中，解纤维素根瘤菌Rhizobium cellulosilyticum，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月30日，保藏编号：CGMCC1.15995。
对比例1
一种抗病促生型混合微生物菌群，包括黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×1010CFU/mL发酵液，按比例后混合得到本发明混合菌液。
进一步的，所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，pH值7.2—7.4，121℃灭菌19min，固体培养基另加琼脂粉15g。
进一步的，菌种在LB固体培养基上活化的条件为：28℃恒温培养18h。
进一步的，LB液体培养基扩大培养的条件为：往复式摇床150r·min-1，28℃恒温培养24h。
进一步的，发酵液的混合比例为3:6。
根据实际使用情况，可将菌群制备成固体颗粒使用，这样更利于方面快捷的施用。
具体制备方法为：
将本发明混合菌液加入到无菌的草炭土中，同时加入膨润土作为粘结剂，可溶性淀粉作为崩解剂，获得含功能菌株的固形物，置于阴凉处风干1-2d。然后用造粒机造粒得到混合菌的微粒。
其中，黄麻链霉菌Streptomyces corchorusii，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年11月5日，保藏编号：CGMCC4.7392。
其中，副地衣芽孢杆菌Bacillus paralicheniformis，购自中国普通微生物菌种保藏管理中心(China General Microbiological Culture Collection Center,CGMCC)，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2016年9月20日，保藏编号：CGMCC1.15832。
本对比例除不添加解纤维素根瘤菌外，其余均同实施例3。
对比例2
一种抗病促生型混合微生物菌群，包括黄麻链霉菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、解纤维素根瘤菌分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×1010CFU/mL发酵液，按比例后混合得到本发明混合菌液。
本对比例除不添加副地衣芽孢杆菌外，其余均同实施例3。
对比例3
一种抗病促生型混合微生物菌群，包括副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌种分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×1010CFU/mL发酵液，按比例后混合得到本发明混合菌液。
本对比例除不添加黄麻链霉菌外，其余均同实施例3。
测试
分泌IAA能力的测定
测定方法：将实施例1-3、对比例1-3扩大培养的混合菌液10000r/min、4℃下离心10min，取上清液1m L加1m L比色液于黑暗下静置30min后，迅速用分光光度计于530nm波长下比色测定吸光度，根据吸光度计算IAA的含量。标准曲线用纯吲哚乙酸制作。
溶磷能力的测定
将50m L液体PKO无机磷(或蒙金娜有机磷)培养基装入150m L三角瓶，121℃灭菌20min，待冷却后分别将500μL各待测实施例和对比例的菌悬液(将菌悬液的浓度调至108cfu/m L)接种至三角瓶中。每个试验设3个重复，以不接种菌株的基础培养基作为对照。将上述三角瓶置于28℃、160r/min摇床上振荡培养12d后，将培养液在10000r/min、4℃下离心15min，取上清液，以钼锑抗比色法测定出有效磷含量(mg/L)的增量。
表1实验测试结果
Figure BDA0003112542860000071
本发明菌群具有良好的营养元素分解能力和分泌生长素的能力，三种菌相互配合共同作用，而缺少了任意菌种的对比例，其分解磷以及生长素的分泌量则显著下降。
种植试验
供试黄瓜品种：长春密刺，购买于山东新泰市裕园种业有限公司
土壤状况：土壤全氮含量2.84g/kg，有效磷459mg/kg，速效钾199mg/kg，有机质39.1g/kg，全盐2.98g/kg，pH 7.2。
实验设计
本试验共设7个处理，分别为实施例1-3、对比例1-3和空白对照组。施用量均为50kg/hm2。
分别为3次重复，小区面积9m2(1.5m×6.0m)。定植前深翻土地，施复合肥100kg·667m-2，磷酸二铵50kg·667m-2，撒施根结线虫侵染严重的黄瓜根腐化料15kg·667m-2，然后整平备用。
测定项目及方法
分别测量株高、茎粗、叶片数等植株农艺性状，产量以及拉秧当天调查全部黄瓜植株根部的线虫危害情况，通过黄瓜植株农艺性状、产量、病情指数等方面综合评价几种防治方法的防治效果。以空白对照组数据为对照计算防控效果。
根结线虫的病害程度分为6级(0-5级，0级为无根结线虫症状，5级为根结线虫危害症状最重)，由研究人员统一调查各处理小区内每株植株的根结线虫病害程度等级。
病情指数＝∑处理中每株病害程度等级/(处理中植株株数×7)
防控效果(％)＝(处理病情指数－对照病情指数)/对照病情指数×100
增产率(％)＝(处理产量－对照产量)/对照产量×100
种植效果如下表所示：
表2黄瓜种植结果
Figure BDA0003112542860000081
从根际照片图1也可以看出，S3(实施例3)根结线虫侵染较少、d1-d3(对比例1-3)有不同程度侵染，空白对照组(CK)呈现较为严重的侵染。
需要说明的是，上述实施例仅仅是实现本发明的优选方式的部分实施例，而非全部实施例。显然，基于本发明的上述实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动的前提下所获得的其他所有实施例，都应当属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，包括黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌；所述微生物菌群是采用以下方法制备得到的：将黄麻链霉菌、副地衣芽孢杆菌和解纤维素根瘤菌种分别接种于LB固体培养基上活化，按照2％接种量分别接种于LB液体培养基中扩大培养，分别得1.5×1010CFU/mL发酵液，按比例后混合得到。
2.根据权利要求1所述抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，所述LB培养基的组成为：胰蛋白胨10g、酵母提取物5g、NaCl 10g、蒸馏水1000mL，pH值7.2—7.4，121℃灭菌19min，固体培养基另加琼脂粉15g。
3.根据权利要求1所述抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，菌种在LB固体培养基上活化的条件为：25-28℃恒温培养10-18h。
4.根据权利要求1所述抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，LB液体培养基扩大培养的条件为：往复式摇床150r·min-1，28℃恒温培养24h。
5.根据权利要求1所述抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，发酵液的混合比例为1-3:2-6:5-10。
6.根据权利要求1-5任意一项所述抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，所述黄麻链霉菌为黄麻链霉菌CGMCC4.7392。
7.根据权利要求1-5任意一项所述抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，所述副地衣芽孢杆菌为副地衣芽孢杆菌CGMCC1.15832。
8.根据权利要求1-5任意一项所述抗病促生型混合微生物菌群，其特征在于，所述解纤维素根瘤菌为解纤维素根瘤菌CGMCC1.15995。
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