CN103667105A

CN103667105A - 一种具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌及其应用

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Publication number: CN103667105A
Application number: CN201310467439.0A
Authority: CN
Inventors: 李桂英; 梁志梳; 张正雍; 安太成
Original assignee: Guangzhou Institute of Geochemistry of CAS
Current assignee: Guangzhou Institute of Geochemistry of CAS
Priority date: 2013-10-09
Filing date: 2013-10-09
Publication date: 2014-03-26
Anticipated expiration: 2033-10-09
Also published as: CN103667105B

Abstract

本发明公开了一种具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌及其在环境修复中的应用。本发明通过对广州市河涌中活性污泥中细菌进行分离纯化，得到一株对二甲基二硫醚具有良好降解能力的蜡状芽孢杆菌，将此蜡状芽孢杆菌命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）GIGAN2，于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013395。本发明分离得到的蜡状芽孢杆菌GIGAN2可高效降解环境中二甲基二硫醚，将其应用于环境中二甲基二硫醚污染治理，可以达到环境修复的目的。

Description

一种具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，特别涉及一种具有二甲基二硫醚（DimethylDisulfide，DMDS）降解能力的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）及其在环境修复中的应用。

背景技术

二甲基二硫醚（Dimethyl Disulfide，DMDS），又称二硫化二甲基，是一种重要的化工产品，广泛应用于溶剂、结焦剂、催化剂的减速剂、农药中间体，与甲硫醚、甲硫醇、硫化氢一样是属于嗅阈值非常低的恶臭化合物。环境中的二甲基二硫醚主要来源于木浆厂、炼油厂、堆肥厂和污水处理厂等，随着工业的发展，此类污染物的累积不仅使人产生不愉快，烦躁和厌恶的情绪，对人体的身心健康造成严重的威胁，而且还会参与大气硫循环形成酸雨和气溶胶，改变全球的气候。因此，寻求一种可以有效降解这些含硫恶臭污染物的方法已成为环境科学工作者的研究焦点。与常规的脱臭方法相比，生物除臭法由于成本低、工艺简单、操作方便、运行稳定、处理效果好引起人们的广泛关注。然而，到目前为止，虽然采用生物法降解这些恶臭有机污染物的研究已有文献报道但是主要集中在H₂S的净化研究方面，而且采用单一菌种降解二甲基二硫醚的研究目前还却十分有限。蜡状芽孢杆菌呈杆状，革兰氏染色为阳性，在固体培养基表面菌体可形成不透明、边缘整齐的白色菌落。而且目前还没有发现有关蜡状芽孢杆菌降解二甲基二硫醚方面的报道及专利。

发明内容

为了克服现有技术的缺点与不足，本发明的首要目的在于提供一种具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌。

本发明的另一目的在于提供所述具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌的应用。

本发明的目的通过下述技术方案实现：一种具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌，命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）GIGAN2，于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013395；

所述具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌具有如下的形态和生理生化特性：

该蜡状芽孢杆菌菌体的形态特性如下：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，得出所筛选的蜡状芽孢杆菌为革兰氏阳性菌；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，菌体大小为0.5～0.8×6～8μm，周生鞭毛（如图1所示）；

b.菌落的形态特性为：在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，乳白色，不透明，菌落直径为2～3mm；

c.根据《伯杰氏细菌鉴定手册》第八版，对细菌生理生化指标进行检测，主要的生理生化特征如表1：

表1检测菌体的生理生化检测指标

所述具有降解二甲基二硫醚能力的蜡状芽孢杆菌的16S rDNA序列如SEQID:No.1所示。

所述具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌能够应用于环境修复，可降解环境中，如大气、水体和土壤中的二甲基二硫醚。

本发明相对于现有技术，具有如下的优点及污染治理效果：

（1）本发明的菌株是从广东省广州市某河涌底泥筛选得到具有降解二甲基二硫醚能力的新菌株——蜡状芽孢杆菌。

（2）本发明的蜡状芽孢杆菌具有较好降解二甲基二硫醚的能力，在底物浓度为5mg/L条件下降解72h，降解率可达100.0%。

附图说明

图1是本发明的蜡状芽孢杆菌GIGAN2在电子显微镜下的形态图。

具体实施方式

下面结合实施例及附图对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。

实施例1

本发明所述的具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌，是在以二甲基二硫醚为唯一的碳源和能量物质时，从广东省广州市某河涌底泥中进行筛选分离、纯化而得。其分离纯化方法如下：二甲基二硫醚筛选采用的无机盐培养基配方（g/L）（K₂HPO₄·3H₂O1.2，KH₂PO₄1.2，NH₄Cl0.4，MgSO₄·7H₂O0.2，FeSO₄·7H₂O0.01，1ml微量元素（g/L）:CaCl₂·2H₂O0.2，MnSO₄·4H₂O0.2，CuSO₄·2H₂O0.01，ZnSO₄·7H₂O0.2，CoCl₂·6H₂O0.09，Na₂MoO₄·2H₂O0.12，H₃BO₃0.006）。驯化底物浓度依次为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L。首先取1g污泥加入含1mg/L二甲基二硫醚的无机盐培养基，37℃驯化5天后，以10%接种量移入下一浓度中接着驯化，以此类推逐步提高二甲基二硫醚的浓度进行驯化。驯化结束后将终浓度的增均液稀释10^-1～10^-7各取0.2ml分别均匀涂布在以二甲基二硫醚为唯一碳源的固体培养基（每升上述无机盐培养基中加入琼脂粉18g和二甲基二硫醚10mg）中，挑选生长速度快、边缘整齐的单菌落富集培养后进行二甲基二硫醚的降解实验，将具有降解效果最好的菌落进行保存并做菌种鉴定，鉴定结果如下：

（1）菌体的形态特性：

a.采用常规的细菌生理生化鉴定方法和电子显微镜观察，得出所筛选的蜡状芽孢杆菌为革兰氏阳性菌；在电子显微镜下观察，其形态为杆状，周生鞭毛，如图1所示；

b.菌落的形态特性：在LB固体培养基培养24h后，菌落形态为圆形，乳白色，不透明，菌落直径为2～3mm；

c.主要的生理生化特征如表2：

表2检测菌体的生理生化特征

上述结果表明本发明所筛选的细菌与蜡状芽孢杆菌属的生理生化特性很相似。

（2）采用DNA提取试剂盒提取细菌总DNA。采用细菌的16S rDNA通用引物：

上游引物：F27（5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3'）

下游引物:R1492（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'）

扩增其16S rDNA基因，测序结果如下（SEQ ID:No.1）：

GGGGCTTGCCGCGTGCCTATACATGCAGTCGAGCGAATGGATTAAGAGCTTGCTCTTATGAAGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCATAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACATTTTGAACCGCATGGTTCGAAATTGAAAGGCGGCTTCGGCTGTCACTTATGGATGGACCCGCGTCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCAACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCTAGTTGAATAAGCTGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGTGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGAGACTTGAGTGCAGAAGAGGAAAGTGGAATTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATATGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTTTCTGGTCTGTAACTGACACTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGAAGTTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCTCCTTCGGGAGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCATCATTTAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAAAGAGCTGCAAGACCGCGAGGTGGAGCTAATCTCATAAAACCGTTCTCAGTTCGGATTGTAGGCTGCAACTCGCCTACATGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGT

将长为1396bp的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析发现菌株与Bacillus cereus strain ML267最相似，相似度为98%。

综合上述的生理生化特性、16S rRNA基因序列结果，本发明所筛选的细菌应归属蜡状芽孢杆菌属的一个新变种，命名为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）GIGAN2。

所述菌株于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013395

实施例2

本发明筛选得到的蜡状芽孢杆菌GIGAN2对二甲基二硫醚具有较好的降解能力：

根据降解实验需要，配置无机盐培养基：在装有100mL的去离子水的血清瓶中加入K₂HPO₄·3H₂O0.12g，KH₂PO₄0.12g，NH₄Cl0.04g，MgSO₄·7H₂O0.02g，FeSO₄·7H₂O0.001g，100ul微量元素（g/L）（CaCl₂·2H₂O0.2g，MnSO₄·4H₂O0.2g，CuSO₄·2H₂O0.01g，ZnSO₄·7H₂O0.2g，CoCl₂·6H₂O0.09g，Na₂MoO₄·2H₂O0.12g，H₃BO₃0.006g），高压灭菌30min。首先将筛选的二甲基二硫醚降解菌在营养肉汤培养基中（牛肉膏3.0g/L、蛋白胨10.0g/L、NaCl5.0g/L）富集增菌培养24h后，菌液离心，收集菌体，并用磷酸盐缓冲液洗涤三次，然后以10%接种量悬浮在上述装有100mL无机盐培养基的血清瓶中，然后加入二甲基二硫醚使得其浓度分别为5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L，加盖密封后在摇床温度30℃，振动频率200r/min条件下进行降解试验，使用安装氢焰离子化检测器（FID）HP6890气相色谱仪，定期从血清瓶顶空取样，测定气相中二甲基二硫醚的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中的降解率。气相色谱装备HP-5MS毛细管柱（0.25mm×0.25μm×30m,Agilent Technologies），检测条件为：检测器温度230℃，进样口温度200℃，柱温80℃保持2分钟，以10℃/min升高至150℃。采用Agilent500μL气密针进样，进样量为300μL，不分流模式。结果如表3所示：

表3不同初始浓度的二甲基二硫醚的降解率

二甲基二硫醚浓度	降解率
		5mg/L	100.0％
8mg/L	95.7％
		10mg/L	90.4％
15mg/L	77.1％
		20mg/L	66.6％
25mg/L	54.3％

从表3中可以看出，本发明筛选得到蜡状芽孢杆菌GIGAN2对二甲基二硫醚的降解能力最高可达100.0%。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

Claims

1.一种具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus），其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌的名称为蜡状芽孢杆菌（Bacillus cereus）GIGAN2，于2013年09月08日保藏于中国典型培养物保藏中心（CCTCC），地址：中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M2013395。

2.权利要求1所述的具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌在环境修复中的应用。

3.根据权利要求2所述的具有二甲基二硫醚降解能力的蜡状芽孢杆菌在环境修复中的应用，其特征在于：所述蜡状芽孢杆菌能够降解大气、水体或土壤中的二甲基二硫醚。