CN102559620B - 一种苯并[a]芘降解酶及其分离方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种苯并[a]芘降解酶及其分离方法。所述苯并[a]芘降解酶由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的，该产碱菌的菌种保藏号为CGMCC NO.3638。该降解酶在进行降解苯并[a]芘时，适宜pH值为6.5～8.5，最适宜pH值为7.5，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30～45℃，最适宜反应温度为35℃，当温度高于50℃易于失活变性，浓度为1mmol/L的Cu2+、Fe2+、Hg2+离子对酶活性有较强的抑制作用。本发明提供的苯并[a]芘降解酶可以有效降解苯并[a]芘，对于多环芳烃苯并[a]芘污染土壤及水体有应用潜力。
Description
技术领域
本发明属于生物工程技术与难降解有机污染物生物处理技术领域，特别涉及一种苯并[a]芘降解酶及其分离方法。
背景技术
多环芳烃(Polycyclic Aromatic Hydrocarbons，PAHs)是一类含有两个或两个以上苯环的有毒有机污染物，具有强烈的致癌作用、致畸作用和致突变作用。PAHs能通过生物累积及食物链的传递作用对生态环境和人体健康造成极大危害，已引起各国环境科学家的高度重视。美国环保局早在80年代就已把16种未带分支的PAHs确定为环境中的优先污染物，我国也把PAHs列入环境污染的黑名单中。
目前对环境中多环芳烃的治理技术主要有物理法、化学法和生物法。物理处理技术主要存在处理费用高与去除不彻底的缺点。在化学法中国内外有学者利用有机溶剂(如乙醇、正己烷、二氯甲烷、三氯甲烷、丙酮)及表面活性剂等洗脱环境中的多环芳烃，但会存在二次污染等问题。生物法具有操作简单、运行费用低、无二次污染等优点。一般来说，随着多环芳烃苯环数量的增加，其降解速率降低。因此，低分子量的多环芳烃在环境中能较快被降解，在环境中存在的时间较短，而高分子量的多环芳烃，例如苯并[a]芘、茚并[1，2，3-cd]芘等则难于降解，较长期存在于环境中。从降解微生物细胞中提取降解酶来强化降解已成为去除多环芳烃污染的一种重要方法。降解酶在多环芳烃降解的应用中具有降解效率高、作用底物浓度低及环境适应性强等优点，具有广阔的应用前景。但是，由于对多环芳烃降解微生物缺乏深入的研究，国内外缺少高环多环芳烃降解酶方面的研究报道。
发明内容
本发明提供一种苯并[a]芘降解酶及其分离方法。所述苯并[a]芘降解酶由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的。该降解酶在进行降解苯并[a]芘时，适宜pH值为6.5～8.5，最适宜pH值为7.5，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30～45℃，最适宜反应温度为35℃，当温度高于50℃易于失活变性，浓度为1mmol/L的Cu2+、Fe2+、Hg2+离子对降解酶活性有较强的抑制作用。
分离苯并[a]芘降解酶所用的菌株产碱菌Alcaligenes sp.在2010年3月1日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，该中心位于北京市朝阳区北辰西路1号院中国科学院微生物研究所，菌种保藏号为CGMCC NO.3638。从产碱菌Alcaligenes sp.中分离苯并[a]芘降解酶的具体方案为：
①向加入198ml诱导培养基、2.0ml微量金属液和0.2ml维生素c溶液的培养瓶内接种保 藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株产碱菌Alcaligenes sp.；然后用透气膜密封瓶口，将培养瓶在培养温度为25～28℃、转速为100r/min的振荡器中培养30d后即可得到扩增培养后的菌液；
②将步骤①中的菌液进行超声波破碎15min；破碎后的菌液在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
③向由步骤②分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
④向由步骤③分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
⑤合并由步骤②、③和④所收集的上清液，即可得到苯并[a]芘降解酶粗提液；
⑥向由步骤⑤得到的苯并[a]芘降解酶粗提液中加入碾细的(NH4)2SO4固体至65～70％饱和度，在转速为100r/min的振荡器中振荡1～2h，然后在8000r/min条件下离心15min，分离出沉淀；
⑦将由步骤⑥得到的沉淀溶于少量pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中透析24h；将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，分离出上清液；
⑧将由步骤⑦得到的上清液上到已用pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液平衡的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值为7.0～7.2内含0.25mol/L氯化钠的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液线形洗脱梯度洗脱结合的苯并[a]芘降解酶，洗脱速度为20ml/h；运用容积为10ml的试管收集洗脱液，其中每支试管收集洗脱液5ml；用紫外分光光度计在吸收波长为280nm处检测洗脱液，收集吸光度大于0.01的洗脱液；测定降解酶的活性，选择活性部分备用。
所述步骤①中诱导培养基的组成为：NaNO3：2.5g/L，NH4Cl：1.5g·L-1，KH2PO4：1.5g·L-1，MgCl2：0.2g·L-1，CaCl2·2H2O：0.15g·L-1，苯并[a]芘：0.01g·L-1。
所述步骤①中微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O：35mg·L-1，CuCl2：0.25mg·L-1，H3BO3：6.0mg·L-1，MnCl2·4H2O：30mg·L-1，Na2MoO4·2H2O：3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O：2.5mg·L-1，ZnCl2：2.5mg·L-1。
所述步骤步骤②、③和④中超声波破碎的条件为：电流35％、脉冲9.0s、处理时间15min。
本发明得到的苯并[a]芘降解酶可以有效降解苯并[a]芘，对于多环芳烃苯并[a]芘污染土壤及水体有应用潜力。
具体实施方式
下面结合实例进一步说明本发明。
材料：(1)保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株产碱菌Alcaligenes sp.，菌种保藏号为CGMCC NO.3638；
(2)苯并[a]芘(纯度≥99％，Sigma Aldrich)；
(3)NaCl、(NH4)2SO4：分析纯；
(4)pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液，pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的磷酸缓冲液；
(5)诱导培养基1L，其组成及各组分的浓度为：NaNO3：2.0g/L，NH4Cl：1.0g·L-1，KH2PO4：1.0g·L-1，MgCl2：0.1g·L-1，CaCl2·2H2O：0.05g·L-1，苯并[a]芘：0.01g·L-1；
(6)微量金属液1L，其组成及各组分的浓度为：CoCl2·6H2O：35mg·L-1，CuCl2：0.25mg·L-1，H3BO3：6.0mg·L-1，MnCl2·4H2O：30mg·L-1，Na2MoO4·2H2O：3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O：2.5mg·L-1，ZnCl2：2.5mg·L-1。
苯并[a]芘降解酶活性的检测方法：以苯并[a]芘降解酶与苯并[a]芘反应消耗的苯并[a]芘量来确定酶的活性。取0.2mL苯并[a]芘降解酶和4.8mL含有苯并[a]芘浓度为3.5μg/L pH值为7.5的磷酸缓冲液混合，在温度为35℃条件下反应24h，加入0.3mL浓度为2.0mol/L的HCl终止酶反应，测定降解结束后苯并[a]芘浓度的变化。
实施例
向已加入198ml诱导培养基、2.0ml微量金属液和0.2ml维生素c溶液的培养瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株产碱菌Alcaligenes sp.，然后将培养瓶在培养温度为25～28℃、转速为100r/min的振荡器中培养30d，得到扩增培养后的菌液。
将得到的菌液超声波破碎15min后在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液。向分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液，重复2次。合并3次所收集的上清液，得到苯并[a]芘降解酶粗提液。
向苯并[a]芘降解酶粗提液中加入碾细的(NH4)2SO4固体至65％饱和度，在转速为100r/min的振荡器中振荡1～2h，然后在8000r/min条件下离心15min，分离出沉淀。然后将沉淀溶于少量pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中透析24h。将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，分离出上清液。将上清液上到已用pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液平衡的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值为7.0～7.2内含0.25mol/L氯化钠的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液线形洗脱梯度洗脱结合的苯并[a]芘降解酶，洗脱速度为20ml/h。运用容积为10ml的试管收集洗脱液，其中每支试管收集洗脱液5ml。用紫外分光光度计在吸收波长为280nm处检测洗脱液，收集吸光度大于0.01的洗脱液。
分别用pH值为3.0、4.0、5.0、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、9.0、10.0的含有苯并[a]芘浓度为3.5μg/L磷酸缓冲液与0.2mL的苯并[a]芘降解酶配成总体积为5.0mL的反应体系，在30℃条件下反应24小时，加入0.3mL浓度为2.0mol/L的HCl终止酶反应。同时分别设定不加酶的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力，以确定降解酶的最适宜反应pH值。结果表明，降解酶在pH值为3.0～10.0之间对苯并[a]芘均有不同程度的降解，其适宜的pH值为6.5～8.5，最适宜pH值为7.5，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，在最适宜pH值条件下反应24小时对苯并[a]芘的降解率为72.4％。
在pH值为7.5条件下，将含有苯并[a]芘浓度为3.5μg/L磷酸缓冲液与0.2mL的苯并[a]芘降解酶配成体积为5.0mL的反应体系，分别在10℃、20℃、25℃、30℃、35℃、40℃、45℃、50℃条件下反应24小时，然后加入0.3mL浓度为2.0mol/L的HCl终止酶反应。同时分别设定不加酶的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力，以确定降解酶的最适宜反应温度。结果表明，降解酶在温度为10～50℃之间对苯并[a]芘均有不同程度的降解，其适宜的温度为30～45℃，最适宜温度为35℃，当温度高于50℃易于失活变性，在最适宜温度条件下反应24小时对苯并[a]芘的降解率为75.6％。
分别向8份pH值为7.5含有苯并[a]芘浓度为3.5μg/L磷酸缓冲液中加入Cu2+、Zn2+、Fe2+、Pb2+、Co2+、Ni2+、Mg2+、Hg 2+，使离子的浓度为1mmol/L，然后加入0.2mL的苯并[a]芘降解酶配成总体积为5.0mL的反应体系，在30℃条件下反应24小时，加入0.3mL浓度为2.0mol/L的HCl终止酶反应。同时分别设定不加酶和不加金属离子的控制试验，取降解率的最大值为100计算各处理的相对酶活力，以确定各离子对降解酶活性的影响。结果表明，浓度为1mmol/L的Cu2+、Fe2+、Hg2+离子对酶活性有较强的抑制作用。
Claims (2)
1.一种苯并[a]芘降解酶，其特征在于，该苯并[a]芘降解酶由产碱菌Alcaligenes sp.的菌液经过提取与纯化得到的，产碱菌Alcaligenes sp.的菌种保藏号为CGMCC N0.3638，其中，从产碱菌Alcaligenes sp.中分离苯并[a]芘降解酶的具体方案为：
①向加入198ml诱导培养基、2.0ml微量金属液和0.2ml维生素c溶液的培养瓶内接种保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的菌株产碱菌Alcaligenes sp.；然后用透气膜密封瓶口，将培养瓶在培养温度为25～28℃、转速为100r/min的振荡器中培养30d后即可得到扩增培养后的菌液；
②将步骤①中的菌液进行超声波破碎15min；破碎后的菌液在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
③向由步骤②分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
④向由步骤③分离出的菌体中加入30ml去离子水，继续进行超声波破碎15min，在8000r/min条件下离心15min，分离出菌体和上清液；
⑤合并由步骤②、③和④所收集的上清液，即可得到苯并[a]芘降解酶粗提液；
⑥向由步骤⑤得到的苯并[a]芘降解酶粗提液中加入碾细的(NH4)2SO4固体至65～70％饱和度，在转速为100r/min的振荡器中振荡1～2h，然后在8000r/min条件下离心15min，分离出沉淀；
⑦将由步骤⑥得到的沉淀溶于少量pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液并装入透析袋中，将透析袋在pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液中透析24h；将透析后的样品在8000r/min条件下离心15min，分离出上清液；
⑧将由步骤⑦得到的上清液上到已用pH值为7.0～7.2的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液平衡的Q Sepharose Fast Flow阴离子交换柱上过滤，采用pH值为7.0～7.2内含0.25mol/L氯化钠的0.05mol/L三羟基甲基氨基甲烷-HCl缓冲液线形洗脱梯度洗脱结合的苯并[a]芘降解酶，洗脱速度为20ml/h；运用容积为10ml的试管收集洗脱液，其中每支试管收集洗脱液5ml；用紫外分光光度计在吸收波长为280nm处检测洗脱液，收集吸光度大于0.01的洗脱液；测定降解酶的活性，选择活性部分备用；
所述步骤①中诱导培养基的组成为：NaNO3：2.5g/L，NH4Cl：1.5g·L-1，KH2PO4：1.5g·L-1，MgCl2：0.2g·L-1，CaCl2·2H2O：0.15g·L-1，苯并[a]芘：0.01g·L-1；
所述步骤①中微量金属液的组成为：CoCl2·6H2O：35mg·L-1，CuCl2：0.25mg·L-1，H3BO3：6.0mg·L-1，MnCl2·4H2O：30mg·L-1，Na2MoO4·2H2O：3.0mg·L-1，NiCl2·2H2O：2.5mg·L-1，ZnCl2：2.5mg·L-1。
2.根据权利要求1所述苯并[a]芘降解酶，其特征在于，该苯并[a]芘降解酶在进行降解苯并[a]芘时，适宜pH值为6.5～8.5，最适宜pH值为7.5，当pH值小于4及大于10时容易失活变性，适宜反应温度为30～45℃，最适宜反应温度为35℃，当温度高于50℃易于失活变性，浓度为1mmol/L的Cu2+、Fe2+、Hg2+离子对降解酶活性有较强的抑制作用。
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