CN105132305A - 假单胞菌属菌株及其筛选方法 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一株与三叶草共生的、降解多氯联苯的菌株及其筛选方法。所述细菌为假单胞菌属菌株（<i>Pseudomonas？</i>sp<i>.</i>），名为SYC01，该菌株于2015年5月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号为CGMCC？No.10784。该菌株来源于三叶草根际共生的微生物，能够降解多氯联苯（polychlorinated？biphenyls，PCBs）。而利用与三叶草共生的<i>Pseudomonas？</i>sp<i>.</i>降解PCBs的应用尚未见报道。该发明的确立，将在与植物共生的条件下消减土壤中的PCBs、防止PCBs对环境及生物的危害的治理工作中，扮演积极角色。同时，本发明还提供了一种通过联苯为唯一碳源和能源，从非PCBs污染点的、三叶草根际的土壤中分离筛选SYC01菌株的方法。

Description

假单胞菌属菌株及其筛选方法

技术领域

本发明特别涉及一种假单胞菌属菌株（Pseudomonassp.）SYC01及其筛选方法。

背景技术

多氯联苯(polychlorinatedbiphenyls，PCBs)是在Fe³⁺催化剂催化下、以联苯为母体的、人工合成的含氯有机物，因氯的取代位不同，理论上共有209个同系物。作为一种理化性能稳定的化工产品，曾在欧洲、亚洲、北美洲等地的多个工业生产领域中广泛应用，全球生产总量已超150万吨，并且许多已曝露于环境之中。

自然环境中的PCBs，呈现出多个侧面的特性。首先，由于氯原子的存在，PCBs具有抗生物降解性，仅在土壤中的半衰期就长达几年甚至几十年。其次，随着“蒸馏效应”、“蛙跳效应”等大气环流活动，PCBs被从生产使用地远距离地输送到了从南极到北极的全球各地，例如在中国上海，居民生活区域的室内、室外灰尘和农田土壤等样品中，均已检出PCBs(1.0~1.97×10³ng·g^-1，n.d.~1.96×10³ng·g^-1和n.d.~261ng·g^-1)，远距输送性使PCBs从点源性污染转变为面源性污染，成为更难解决的环境问题。再次，PCBs具有在食物链中传递、在高级生物体中富集的特性，在全球各类哺乳动物的乳汁中，PCBs的检出浓度亦达到了6.78~360ug·kg^-1，在高级生物体中的浓度更是相应环境浓度的几十万倍。最后，PCBs还具有生物毒性，并随着氯原子数的增加而增大，微量的PCBs就可能对生物产生致癌、致畸和致突变的作用，对人类的生命活动造成重大负面影响。因此，世界卫生组织全球环境监测系统/食品污染监测和评估计划（GEMS/FOOD）监控的7种PCBs中，有6种为四氯取代或以上，并将海产品中之这7种PCBs的总和量限定为0.5mg·kg^-1(或0.5ppm)。

为扼制及预防泄露PCBs对环境及生物的危害，消减PCBs在环境中的总量是从根源上解决该问题的优先策略。土壤中的PCBs占到环境中总量的93.1%，土壤是PCBs的最终的汇聚之地，因此消减土壤中的、尤其是面源污染的PCBs，成为PCBs总量减量化的关键。

最初的、并沿用至今的获取降解菌的方法，是PCBs污染点样品中菌株的筛选分离法。迄今报道的PCBs降解菌株中，大多以这种主流的方法获得。然而，这些菌株在实际污染土壤中的应用结果却不甚理想，解效率只是实验室悬浮细胞的1/50、实验室土壤模拟的1/2。众多的研究表明，最主要的原因是这些从特殊地点获得菌株的生存模式特殊，与土著微生物菌群之间产生了生存竞争，使得实际土壤中很难保持住PCBs有效降解所需的生物量，成为了面源污染减量化的障碍。

微生物与植物的共生，是一种自然界现象。在植物根际土壤中，共生细菌因不与其它微生物菌群生存竞争而能保持较高水平的生物量。从非PCBs污染点的、植物根际土壤中筛选出降解PCBs的共生菌株，既能解决生物量的问题，也能解决生存竞争的问题。有基于此，本文从非PCBs污染点的、三叶草的根际微生物中，分离筛选出的一株对PCBs有降解能力的细菌SYC01，并发现其对PCB52（邻位氯取代）和PCB77（对位氯取代）的四氯联苯均有静息降解能力，表明SYC01对不同类型氯取代位的高氯代PCBs均有良好的降解能力，具有良好的应用前景。

发明内容

本发明的目的之一在于提供一株假单胞菌属菌株（Pseudomonassp.）SYC01，该菌株能降解PCBs。

本发明的目的之二在于提供该菌株的筛选方法。

为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：

一株假单胞菌菌株，该菌株的保藏号为CGMCCNo.10784。

一种筛选上述的假单胞菌菌株的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.采集三叶草根际土壤，用无菌水打散，形成悬浊液，取该悬浊液于液体合成培养基LSM中，28℃、150rpm下培养5~7d，得到菌悬液，取该菌悬液于LSM培养基中，转代5次；所述的三叶草根际土壤与无菌水的质量体积比为1g：10～12ml；所述的悬浊液与LSM培养基的体积比为10ml：（100～120）ml；所述的菌悬液与LSM培养基的体积比为10ml：（100～120）ml；

b.将步骤a所得菌悬液涂布于固体合成培养基SSM中，30℃静置培养4d，获得单菌落，挑取单菌落在固体LB培养基SLB上划线纯化3次，获得纯菌种；

c.将步骤b中的纯菌种制成菌悬液，并涂布于SSM平板上，28℃静置培养，得到假单胞菌菌株。

一种根据权利要求1所述的假单胞菌菌株在降解多氯联苯中的应用。。

本发明的该菌株来源于三叶草根际共生的微生物，能够降解多氯联苯（polychlorinatedbiphenyls，PCBs）。该发明的确立，将在与植物共生的条件下消减土壤中的PCBs、防止PCBs对环境及生物的危害的治理工作中，扮演积极角色。

生物材料保藏信息

本发明的假单胞菌菌株SYC01，已于2015年5月7日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（CGMCC），保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮编：100101。该菌株的保藏编号为：CGMCCNo.10784。该菌株的分类命名是假单胞菌Pseudomonassp，名称为SYC01。

附图说明

图1为本发明的假单胞菌菌株静息细胞催化降解PCB52的动力学曲线。

图2为图解法表示的本发明的假单胞菌菌株静息细胞催化降解PCB52的动力学双倒数曲线。

具体实施方式

下述实验例中所使用的实验方法如无特殊说明均为常规方法。

实施例1、培养基的制备

1)合成培养基：

A溶液：56.77g·L^-1K₂HPO₄，21.94g·L^-1KH₂PO₄，12.96g·L^-1(NH₄)₂SO₄；

B溶液：0.3g·L^-1CaCl₂·H₂O，19.5g·L^-1MgSO₄，5g·L^-1MnSO₄·H₂O，1g·L^-1FeSO₄·7H₂O；

C溶液：0.1g·L^-1酵母浸膏。

液体合成培养基(LSM)：77.5mLA溶液+10mLB溶液+910mLC溶液+2g联苯，pH7.2。

固体合成培养基(SSM)：77.5mLA溶液+10mLB溶液+910mLC溶液+2g联苯+15g琼脂，pH7.2。

2)LB培养基:

液体LB培养基(LLB)：10g·L^-1蛋白胨，5g·L^-1酵母浸膏，10g·L^-1NaCl，pH7.2。

固体LB培养基(SLB)：1000mLLLB+15g琼脂，pH7.2。

实施例2、菌株的获得

1)筛选：采集未被PCBs污染过的三叶草根际土壤1g，用10mL无菌水打散，取1mL悬浊液于100mLLSM中，28℃、150rpm下培养5~7d；取1mL菌悬液于新的100mLLSM中，转代5次；

2)分离：吸取最后一次转代培养的菌悬液200μL并涂布于SSM中，30℃静置培养4d，获得单菌落；

3)纯化：挑取单菌落在SLB培养基上划线纯化3次，获得纯菌种；

4)获得：将3)中的纯菌种制成菌悬液，并涂布于SSM平板上。28℃静置培养，挑选其中生长快且好的一株菌株，并命名为SYC01，并接于SLB斜面上保藏。

实施例3、菌株的鉴定

一、形态及生理生化特征

将菌株SYC01接种于SSM平板上，28℃，静置培养4d，观察菌落及细胞的形态特征，并进行生理生化实验。

观察结果及实验结果如下：

1）菌落特征：菌落直径为0.5-1.0mm，菌落呈圆形，表面光滑湿润，边缘整齐，微凸起，黄色。

2）细胞形态特征：细胞为杆状，顶端圆钝；革兰氏染色阴性；细胞菌体大小为0.5-0.6μm×1.0-2.6μm。

3）生理生化特征：

二、菌株SYC01的16SrDNA基因的PCR扩增和序列测定

制备SYC01总基因组DNA。用于PCR扩增的正向引物为5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'(nt8-27)，反向引物为5'-AAGGAGGTGATCCAGCC-3'(nt1541-1557)。扩增体系为2μL10×buffer，2μL25mmol·L^-1MgCl₂，1.5μL10mmol·L^-1dNTP,1μLTaq酶，13.4μLDDH₂O，1μL模板，30pmol·L^-1引物各1μL，总体积20μL。扩增条件为95℃，10min；95℃，1min；55℃，1min；72℃，1min，共30个循环；72℃10min，4℃保存。

PCR产物的测序采用ABIBigDye3.1测序试剂盒(AppliedBiosystems)和DNA自动测序仪(modelABI3730;AppliedBiosystems)。

测序结果表明，菌株SYC01(CGMCCNo.10784)16SrDNA基因序列长度为1553bp。其16SrDNA基因的核苷酸序列为SEQIDNO.1所示的碱基序列。

将16SrDNA基因序列在GenBank中进行同源比对分析，结果表明，其序列与Pseudomonasmonteilii和Pseudomonasputeda的16SrDNA基因序列的相似性均为99%。

参照《Bergey’sMannualofSystematicBacteriology》（第二版），根据其形态特征和生理生化特征，以及根据16SrDNA基因序列在GenBank中的搜索结果，菌株SYC01(CGMCCNo.10784)被鉴定为新种假单胞菌属菌株（Pseudomonassp.）。

实施例4、降解特性研究

一、PCBs的降解体系

将SYC01接于LLB中培养16h，离心收集菌体，用pH7.2的无菌磷酸缓冲液PBS(15.6g·L^-1K₂HPO₄+4.3g·L^-1KH₂PO₄)洗涤3次后，以PBS重悬，并调OD_600nm为1.0。

在玻璃瓶中分别加入一定浓度的PCB正己烷溶液，待正己烷挥发后，静息细胞降解组中加入2mL的PBS菌悬液(OD_600nm=1.0)，对照组中加入2mL相同浓度的热杀菌液，盖上内衬锡纸的盖子，于28℃、150rpm下进行实验。每组样品均设3组平行样。

二、PCBs的提取及测定

1)萃取：取待测样品于分液漏斗并加入4mL丙酮，充分摇匀后静置15-20min，加入12mL正己烷:二氯甲烷（1:3，v/v）混合溶剂，充分振荡后静置15-20min，收集下层清液于鸡心瓶中；再重复2次，每次加入2mL丙酮和6mL正己烷:二氯甲烷混合溶剂，其它操作同前；

2)过柱：取萃取液1mL和3uL回收率指示物¹³C-PCB141过酸碱硅胶-氧化铝复合层析柱(层析柱从下至上依次为：抽提过的脱脂棉、6cm氧化铝、2cm中性硅胶、5cm碱性硅胶、2cm中性硅胶、6cm酸性硅胶、1cm无水硫酸钠。)，用70mL正己烷:二氯甲烷（1:1，v/v）混合溶剂淋洗并收集；

3)浓缩：收集的淋洗液旋转蒸发浓缩为约1mL，用正己烷淋洗鸡心瓶并转移至棕色样品瓶中，氮吹，加20uL内标¹³C-PCB208后定容至100uL，于4℃冰箱中保存待分析。

4)分析：PCB的分析是在Agilent6890N/5975GC-MS上采用电子冲击离子源(EI)完成。色谱柱为DB-5MS毛细管色谱柱(60m×0.25mm×0.25um)，以高纯氦气为载气，柱流速为1mL·min^-1。进样口和离子源温度分别为280℃和230℃。

升温程序:110℃保留1min，以10℃·min^-1升至200℃，以1℃·min^-1升至250℃，再以8℃·min^-1升至290℃，保留10min。1uL无分流进样，采用选择离子模式（SIM）。

三、菌株降解PCBs的计算

1）降解率：

降解率η%=(C _对照组-C _降解组)/C _对照组×l00%。

经计算，SYC01静息细胞对PCB52及PCB77的5d的降解速率分别为61和28%。

2）降解动力学：

当PCB52初始浓度分别为0.1、0.2、0.5、1.0和2.0ug·mL^-1时，28℃，150rpm下测定了SYC01静息细胞5d的降解动力学曲线(图1)，同时以Lineweaver-Burk法做出了相应的动力学双倒数曲线(图2)，并求得了相关的动力学参数，其中K _m值为6.05×10^-6mol·L^-1，V _max为0.28μg·mL^-1·d^-1。

<110>上海大学

<120>徦单胞菌属菌株及其筛选方法

<160>3

<210>1

<211>1527

<212>DNA

<213>Paenibacillussp.

<400>1

AAGGAGGTGATCCAGCCGCAGGTTCCCCTACGGCTACCTTGTTACGACTTCACCCCAGTC60

ATGAATCACACCGTGGTAACCGTCCTCCCGAAGGTTAGACTAGCTACTTCTGGTGCAACC120

CACTCCCATGGTGTGACGGGCGGTGTGTACAAGGCCCGGGAACGTATTCACCGCGACATT180

CTGATTCGCGATTACTAGCGATTCCGACTTCACGCAGTCGAGTTGCAGACTGCGATCCGG240

ACTACGATCGGTTTTGTGAGATTAGCTCCACCTCGCGGCTTGGCAACCCTCTGTACCGAC300

CATTGTAGCACGTGTGTAGCCCAGGCCGTAAGGGCCATGATGACTTGACGTCATCCCCAC360

CTTCCTCCGGTTTGTCACCGGCAGTCTCCTTAGAGTGCCCACCATAACGTGCTGGTAACT420

AAGGACAAGGGTTGCGCTCGTTACGGGACTTAACCCAACATCTCACGACACGAGCTGACG480

ACAGCCATGCAGCACCTGTGTCAGAGTTCCCGAAGGCACCAATCCATCTCTGGAAAGTTC540

TCTGCATGTCAAGGCCTGGTAAGGTTCTTCGCGTTGCTTCGAATTAAACCACATGCTCCA600

CCGCTTGTGCGGGCCCCCGTCAATTCATTTGAGTTTTAACCTTGCGGCCGTACTCCCCAG660

GCGGTCAACTTAATGCGTTAGCTGCGCCACTAAAATCTCAAGGATTCCAACGGCTAGTTG720

ACATCGTTTACGGCGTGGACTACCAGGGTATCTAATCCTGTTTGCTCCCCACGCTTTCGC780

ACCTCAGTGTCAGTATCAGTCCAGGTGGTCGCCTTCGCCACTGGTGTTCCTTCCTATATC840

TACGCATTTCACCGCTACACAGGAAATTCCACCACCCTCTACCGTACTCTAGCTCGCCAG900

TTTTGGATGCAGTTCCCAGGTTGAGCCCGGGGCTTTCACATCCAACTTAACGAACCACCT960

ACGCGCGCTTTACGCCCAGTAATTCCGATTAACGCTTGCACCCTCTGTATTACCGCGGCT1020

GCTGGCACAGAGTTAGCCGGTGCTTATTCTGTCGGTAACGTCAAAACAGCAAGGTATTAA1080

CTTACTGCCCTTCCTCCCAACTTAAAGTGCTTTACAATCCGAAGACCTTCTTCACACACG1140

CGGCATGGCTGGATCAGGCTTTCGCCCATTGTCCAATATTCCCCACTGCTGCCTCCCGTA1200

GGAGTCTGGACCGTGTCTCAGTTCCAGTGTGACTGATCATCCTCTCAGACCAGTTACGGA1260

TCGTCGCCTTGGTGAGCCATTACCCCACCAACTAGCTAATCCGACCTAGGCTCGTCTGAT1320

AGCGCAAGGCCCGAAGGTCCCCTGCTTTCTCCCGTAGGACGTATGCGGTATTAGCGTTCC1380

TTTCGAAACGTTGTCCCCCACTACCAGGCAGATTCCTAGGCATTACTCACCCGTCCGCCG1440

CTGAATCAAGGAGCAAGCTCCCGTCATCCGCTCGACTTGCATGTGTTAGGCCTGCCGCCAGC1500

GTTCAATCTGAGCCATGATCAAACTCT1527

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<400>1

AGAGTTTGATCCTGGCTCAG20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>人工引物

<400>1

AAGGAGGTGATCCAGCC20

Claims (3)

1.一株假单胞菌菌株，该菌株的保藏号为CGMCCNo.10784。

2.一种筛选根据权利要求1所述的假单胞菌菌株的方法，其特征在于该方法的具体步骤为：

a.采集三叶草根际土壤，用无菌水打散，形成悬浊液，取该悬浊液于液体合成培养基LSM中，28℃、150rpm下培养5~7d，得到菌悬液，取该菌悬液于LSM培养基中，转代5次；所述的三叶草根际土壤与无菌水的质量体积比为1g：10～12ml；所述的悬浊液与LSM培养基的体积比为10ml：（100～120）ml；所述的菌悬液与LSM培养基的体积比为10ml：（100～120）ml；

b.将步骤a所得菌悬液涂布于固体合成培养基SSM中，30℃静置培养4d，获得单菌落，挑取单菌落在固体LB培养基SLB上划线纯化3次，获得纯菌种；

c.将步骤b中的纯菌种制成菌悬液，并涂布于SSM平板上，28℃静置培养，得到假单胞菌菌株。

3.一种根据权利要求1所述的假单胞菌菌株在降解多氯联苯中的应用。