CN114317336A - 一株解淀粉芽孢杆菌gdutan15及其在降解二甲基二硫醚中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株解淀粉芽孢杆菌GDUTAN15及其在降解二甲基二硫醚中的应用。本发明所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDUTAN15菌株于2021年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 20211471。通过富集培养后对GDUTAN15菌株进行二甲基二硫醚降解实验发现，其在相同条件下对二甲基二硫醚的降解效率最高，具有良好的二甲基二硫醚降解效果，可用于二甲基二硫醚的生物法处理中，用于降解二甲基二硫醚，也可用于制备降解二甲基二硫醚的产品。

Description

一株解淀粉芽孢杆菌GDUTAN15及其在降解二甲基二硫醚中的 应用

技术领域

本发明属于微生物技术与环境应用领域。更具体地，涉及一株解淀粉芽孢杆菌GDUTAN15及其在降解二甲基二硫醚中的应用。

背景技术

随着我国经济发展和城市化建设，大气环境污染形势日趋严峻，挥发性有机硫化物的排放严重影响了我国环境空气质量以及居民生活质量和身心健康。二甲基二硫醚作为一种典型的挥发性有机硫化物，具有强烈的恶臭和毒性，其与甲硫醚、甲硫醇、硫化氢等同属于嗅阈值非常低的恶臭化合物，是我国现行标准《恶臭污染物排放标准》(GB 14554—1993)中优先控制的八种恶臭污染物之一。二甲基二硫醚主要来源于石油、化工等相关行业，以及城镇污水处理厂，黑臭河道和垃圾填埋场等，短期暴露于含二甲基二硫醚的臭气会引起头痛、恶心和呕吐等身体不适，长期暴露甚至会引起溶血性贫血、呼吸麻痹等症状。鉴于挥发性有机硫化物对环境的污染越来越严重，二甲基二硫醚的危害也逐渐得到重视，对其进行有效治理已迫在眉睫。生物法是一种科学、合理、高效且低成本的挥发性有机硫化物的处理方法，对环境友好，该处理措施得到了环境科学工作者的关注。而发掘具有二甲基二硫醚降解能力的微生物是生物法处理的关键之一，丰富二甲基二硫醚降解菌对其生物法治理具有重要意义。

解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)是一种广泛分布于大自然中的革兰氏阳性菌，因其可以产生液化淀粉酶分解淀粉而得名，具有很强的应用潜力。解淀粉芽孢杆菌是一种常见的生防菌，对多种细菌及植物病原菌具有明显的抑制效果。例如，赵洪新等公开了一株保藏号为CGMCC NO.13492的解淀粉芽孢杆菌，该菌不仅对大肠杆菌、葡萄球菌、四联球菌和枯草芽孢杆菌等细菌具有抑制作用，其还可以抑制毛霉、黑曲霉、青霉，以及抑制小麦纹枯病菌、百合根腐病菌、棉花枯萎病菌、西瓜枯萎病菌、辣椒炭疽病菌、番茄灰霉病菌、苹果轮纹病菌和桃褐腐病菌等植物病原真菌。除抑制病原菌外，解淀粉芽孢杆菌还具有促进动植物生长的作用。例如，中国专利CN111893066A公开了一株解淀粉芽孢杆菌SCAU-070菌株，该菌株能够显著促进水产动物的生长，抑制水产动物养殖水体环境中的水生动物致病菌无乳链球菌、海豚链球菌、藤黄微球菌和副溶血性弧菌的生长，提高水产动物组织的抗氧化能力，并调节水产动物组织中细胞因子的含量，对于减少抗生素和违禁药物的使用具有重要意义。此外，解淀粉芽孢杆菌还可用于有机污染物的降解。例如，赵静等公开的保藏号为CGMCC No.11950的解淀粉芽孢杆菌CB-019菌株能够降解石油、瓜胶等高分子聚合物，可应用于含油污水、压裂返排液和含聚废水处理。综上，对解淀粉芽孢杆菌进行广泛挖掘或可以丰富二甲基二硫醚降解菌的种类，目前也还未有关于利用解淀粉芽孢杆菌降解环境中二甲基二硫醚的相关报道。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有二甲基二硫醚降解微生物较少的缺陷和不足，提供一株解淀粉芽孢杆菌GDUTAN15及其在降解二甲基二硫醚中的应用。

本发明的第一个目的是提供一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GDUTAN15菌株。

本发明的第二个目的是提供所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在降解二甲基二硫醚中的应用。

本发明的第三个目的是提供所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在修复二甲基二硫醚污染环境中的应用。

本发明的第四个目的是提供所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在制备降解二甲基二硫醚的微生物制剂中的应用。

本发明的第五个目的是提供一种用于降解二甲基二硫醚的微生物制剂。

本发明的第六个目的是提供一种修复二甲基二硫醚污染环境的方法。

本发明上述目的通过以下技术方案实现：

本发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDUTAN15菌株，其16S rDNA序列如SEQ ID NO.1所示。本发明所述GDUTAN15菌株2021年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为中国武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M 20211471。

本发明所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDUTAN15菌株源于垃圾填埋场的垃圾渗滤液中，通过使用不同浓度的二甲基二硫醚进行驯化筛选分离得到。同时，通过富集培养后对GDUTAN15菌株进行二甲基二硫醚降解实验发现，其在相同条件下对二甲基二硫醚的降解效率最高，在72h时对浓度为25mg/L的二甲基二硫醚的降解效率仍在90％以上，表明GDUTAN15菌株具有良好的二甲基二硫醚降解效果，可用于二甲基二硫醚的生物法处理中，用于降解二甲基二硫醚。因此，本发明申请保护GDUTAN15菌株的以下应用：

本发明申请保护GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在降解二甲基二硫醚中的应用。

本发明申请保护GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在修复二甲基二硫醚污染环境中的应用。

具体地，所述环境为土壤、空气或水体。

本发明还申请保护GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在制备降解二甲基二硫醚的微生物制剂中的应用。

鉴于GDUTAN15菌株具有良好的二甲基二硫醚降解效果，还可将其用于制备用于降解二甲基二硫醚的产品。

本发明提供了一种用于降解二甲基二硫醚的微生物制剂，所述制剂中含有GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液。

本发明还申请保护所述微生物制剂在修复二甲基二硫醚污染环境中的应用。

具体地，所述环境为土壤、空气或水体。

本发明还提供了一种修复二甲基二硫醚污染环境的方法，通过将GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液施加到待修复环境中进行降解修复。

具体地，所述环境为土壤、空气或水体。

本发明具有以下有益效果：

发明提供了一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDUTAN15菌株，通过富集培养后对GDUTAN15菌株进行二甲基二硫醚降解实验发现，其在相同条件下对二甲基二硫醚的降解效率最高，在72h时对浓度为25mg/L的二甲基二硫醚的降解效率仍在90％以上，表明GDUTAN15菌株具有良好的二甲基二硫醚降解效果，可用于二甲基二硫醚的生物法处理中，用于降解二甲基二硫醚，也可用于制备降解二甲基二硫醚的产品，极具应用潜力。

附图说明

图1为解淀粉芽孢杆菌GDUTAN15菌株在固体培养基上的菌落形态图。

图2为解淀粉芽孢杆菌GDUTAN15菌株在电子扫描显微镜下的形态图。

具体实施方式

以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。

除非特别说明，以下实施例所用试剂和材料均为市购。

实施例1具有二甲基二硫醚降解能力的菌株的筛选、分离和纯化

本发明以二甲基二硫醚为碳源和能源物质，从垃圾填埋场的垃圾渗滤液中筛选、分离、纯化具有二甲基二硫醚降解能力的微生物。

具体的筛选、分离、纯化方法如下：

配制无机盐培养基，以二甲基二硫醚作为驯化底物，在无机盐培养基中添加不同浓度的二甲基二硫醚，通过不同的浓度梯度筛选具有二甲基二硫醚降解能力的微生物。

所述无机盐培养基中含有浓度为1.2g/L的K₂HPO₄·3H₂O，1.2g/L的KH₂PO₄，0.4g/L的NH₄Cl，0.2g/L的MgSO₄·7H₂O，0.01g/L的FeSO₄·7H₂O，0.2g/L的CaCl₂·2H₂O，0.2g/L的MnSO₄·4H₂O，0.01g/L的CuSO₄·2H₂O，0.2g/L的ZnSO₄·7H₂O，0.09g/L的CoCl₂·6H₂O，0.12g/L的Na₂MoO₄·2H₂O和0.006g/L的H₃BO₃。

用于筛选的含二甲基二硫醚的无机盐培养基中，二甲基二硫醚的终浓度依次为1mg/L、5mg/L、10mg/L、15mg/L和20mg/L。

筛选的具体步骤为：首先取10mL的垃圾渗滤液，加入含1mg/L二甲基二硫醚的无机盐培养基中，于37℃驯化5天后，以10％接种量移入下一浓度的含二甲基二硫醚的无机盐培养基中接着驯化，以此类推，逐步提高二甲基二硫醚的浓度进行驯化。驯化结束后，将不同驯化底物浓度下培养得到的菌液稀释10^-1～10^-7倍，再分别取0.2mL稀释菌液，分别涂布在以二甲基二硫醚为碳源的固体培养基中，挑选生长速度快、边缘整齐的单菌落，富集培养后进行二甲基二硫醚降解实验，将降解效果最好的菌落进行保存并做菌种鉴定。

实施例2富集培养后进行二甲基二硫醚降解实验

富集培养及二甲基二硫醚降解实验过程如下：

1、培养基的配制

配制与实施例1相同的无机盐液体培养基，分装100mL至顶空瓶中，置于121℃下高压灭菌30min。

2、菌株的富集培养

将实施例1中筛选得到的具有二甲基二硫醚降解能力的菌株接种在肉汤培养基(含3.0g/L的牛肉膏，10.0g/L的蛋白胨以及5.0g/L的NaCl)中富集增菌培养24h，离心后收集菌体，用PBS洗涤三次；然后以10％的接种量接种于装有100mL无机盐培养基的血清瓶中，再在瓶中加入一定量的二甲基二硫醚，使无机培养基中二甲基二硫醚的终浓度分别为5mg/L、8mg/L、10mg/L、15mg/L、20mg/L、25mg/L，加盖密封后置于37℃恒温摇床，在140r/min下振荡72h进行降解试验。

3、二甲基二硫醚的降解能力检测

测试菌株在含有二甲基二硫醚的无机培养基中降解72h后，从血清瓶顶空取样，使用含硫化学发光检测器(SCD)的Agilent GC 8850气相色谱仪(Agilent DB SULFUR SCD毛细管柱(60m×0.32mm×4.2μm)，测定气相中二甲基二硫醚的浓度，并利用亨利定律来检测其在液相中浓度，从而计算出其降解率。

检测条件为：进样口气化室温度80℃，检测器氧化气流量50mL/min；加热器250℃；燃烧器850℃；升温程序：35℃保持3min，然后10℃/min升至200℃，保持3min。

采用Agilent 1mL气密针进样，进样量为1mL，分流比10：1。

其中，二甲基二硫醚降解能力最好的菌株的降解结果如表1所示，暂将其命名为GDUTAN15菌株，后续对该菌株进行鉴定并保藏。

表1不同初始浓度的二甲基二硫醚的降解率

实施例3菌种鉴定

依据实施例2所述二甲基二硫醚降解实验结果，对其中降解能力最好的菌株(GDUTAN15菌株)进行鉴定并保藏。

1、菌落形态特征

将GDUTAN15菌株接种于NA(营养琼脂)培养基，培养24h后观察其菌落形态，结果如图1所示。由图1可知，GDUTAN15菌株的菌落不规则，呈乳白色，不透明，有胞外分泌物产生，菌落直径为7～12mm。

2、菌体形态特征

对GDUTAN15菌株进行革兰氏染色并观察，结果表明GDUTAN15菌株为革兰氏阳性菌；将其放在SEM下观察，可观察到其形态为杆状，菌体大小为(1.2～1.5)μm×(0.6～0.7)μm，无鞭毛，如图2所示。

3、主要生理生化特征

GDUTAN15菌株的主要生理生化特征如表2所示。

表2 GDUTAN15菌株的主要生理生化特征

注：反应状态分为阳性和阴性，阳性形状编码为“+”，阴性形状编码为“-”。

4、分子鉴定

以GDUTAN15菌株的基因组DNA为模板，利用细菌16S rDNA通用引物扩增GDUTAN15菌株的16S rDNA并测序比对。

利用DNA提取试剂盒(B610367EZ-10柱式DNA纯化试剂盒；生工生物工程股份有限公司)提取GDUTAN15菌株的基因组DNA；所用细菌16S rDNA通用引物的序列如下所示：

上游引物：27F(5'-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3')

下游引物：1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')

GDUTAN15菌株的16S rDNA测序结果如下(SEQ ID No.1)所示：

AAAATTGCGCTGCTATACTGCAAGTCGAGCGGACAGATGGGAGCTTGCTCCCTGATGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGGTTGTCTGAACCGCATGGTTCAGACATAAAAGGTGGCTTCGGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTGCCGTTCAAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGGGCTCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGGGGGTTTCCGCCCCTTAGTGCTGCAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAATCCTAGAGATAGGACGTCCCCTTCGGGGGCAGAGTGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGATCTTAGTTGCCAGCATTCAGTTGGGCACTCTAAGGTGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACAGAACAAAGGGCAGCGAAACCGCGAGGTTAAGCCAATCCCACAAATCTGTTCTCAGTTCGGATCGCAGTCTGCAACTCGACTGCGTGAAGCTGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCACGAGAGTTTGTAACACCCGAAGTCGGTGAGGTAACCTTTATGGAGCCAGCCGCCGAAGGGATGAGGGG

将测序所得长为1451bp的GDUTAN15菌株的16S rRNA基因序列与Genbank中已登录的基因序列进行比对分析，比对结果显示GDUTAN15菌株与Bacillus amyloliquefaciensstrain DYOK6-1的16S rRNA最相似，相似度为70％。

综合上述形态特征、生理生化特性以及16S Rrna的序列比对结果可知，本发明筛选、分离、纯化所得GDUTAN15菌株应归属于芽孢杆菌属的解淀粉芽孢杆菌种。故将其命名为解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDUTAN15菌株，并于2021年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号为CCTCC NO：M 20211471，保藏地址为湖北省武汉市武昌区八一路299号(武汉大学)。

结合实施例2实验结果可知，本发明所述解淀粉芽孢杆菌(Bacillusamyloliquefaciens)GDUTAN15菌株具有良好的二甲基二硫醚降解能力，故可将其用于二甲基二硫醚的降解，用于修复环境中的二甲基二硫醚污染，或用于制备降解二甲基二硫醚的微生物制剂等。

上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。

序列表

<110> 广东工业大学

<120> 一株解淀粉芽孢杆菌GDUTAN15及其在降解二甲基二硫醚中的应用

<160> 1

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1451

<212> DNA

<213> 解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)

<400> 1

aaaattgcgc tgctatactg caagtcgagc ggacagatgg gagcttgctc cctgatgtta 60

gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120

aaccggggct aataccggat ggttgtctga accgcatggt tcagacataa aaggtggctt 180

cggctaccac ttacagatgg acccgcggcg cattagctag ttggtgaggt aacggctcac 240

caaggcgacg atgcgtagcc gacctgagag ggtgatcggc cacactggga ctgagacacg 300

gcccagactc ctacgggagg cagcagtagg gaatcttccg caatggacga aagtctgacg 360

gagcaacgcc gcgtgagtga tgaaggtttt cggatcgtaa agctctgttg ttagggaaga 420

acaagtgccg ttcaaatagg gcggcacctt gacggtacct aaccagaaag ccacggctaa 480

ctacgtgcca gcagccgcgg taatacgtag gtggcaagcg ttgtccggaa ttattgggcg 540

taaagggctc gcaggcggtt tcttaagtct gatgtgaaag cccccggctc aaccggggag 600

ggtcattgga aactggggaa cttgagtgca gaagaggaga gtggaattcc acgtgtagcg 660

gtgaaatgcg tagagatgtg gaggaacacc agtggcgaag gcgactctct ggtctgtaac 720

tgacgctgag gagcgaaagc gtggggagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc 780

cgtaaacgat gagtgctaag tgttaggggg tttccgcccc ttagtgctgc agctaacgca 840

ttaagcactc cgcctgggga gtacggtcgc aagactgaaa ctcaaaggaa ttgacggggg 900

cccgcacaag cggtggagca tgtggtttaa ttcgaagcaa cgcgaagaac cttaccaggt 960

cttgacatcc tctgacaatc ctagagatag gacgtcccct tcgggggcag agtgacaggt 1020

ggtgcatggt tgtcgtcagc tcgtgtcgtg agatgttggg ttaagtcccg caacgagcgc 1080

aacccttgat cttagttgcc agcattcagt tgggcactct aaggtgactg ccggtgacaa 1140

accggaggaa ggtggggatg acgtcaaatc atcatgcccc ttatgacctg ggctacacac 1200

gtgctacaat ggacagaaca aagggcagcg aaaccgcgag gttaagccaa tcccacaaat 1260

ctgttctcag ttcggatcgc agtctgcaac tcgactgcgt gaagctggaa tcgctagtaa 1320

tcgcggatca gcatgccgcg gtgaatacgt tcccgggcct tgtacacacc gcccgtcaca 1380

ccacgagagt ttgtaacacc cgaagtcggt gaggtaacct ttatggagcc agccgccgaa 1440

gggatgaggg g 1451

Claims (10)

1.一株解淀粉芽孢杆菌(Bacillus amyloliquefaciens)GDUTAN15菌株，其特征在于，所述GDUTAN15菌株于2021年11月22日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCCNO：M 20211471。

2.权利要求1所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在降解二甲基二硫醚中的应用。

3.权利要求1所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在修复二甲基二硫醚污染环境中的应用。

4.根据权利要求3所述应用，其特征在于，所述环境为土壤、空气或水体。

5.权利要求1所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液在制备降解二甲基二硫醚的微生物制剂中的应用。

6.一种用于降解二甲基二硫醚的微生物制剂，其特征在于，所述制剂中含有权利要求1所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液。

7.权利要求6所述微生物制剂在修复二甲基二硫醚污染环境中的应用。

8.根据权利要求7所述应用，其特征在于，所述环境为土壤、空气或水体。

9.一种修复二甲基二硫醚污染环境的方法，其特征在于，将权利要求1所述GDUTAN15菌株或其富集增菌培养菌液施加到待修复环境中。

10.根据权利要求9所述方法，其特征在于，所述环境为土壤、空气或水体。

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