CN116064276B - 双效功能菌株wl及其在铜绿微囊藻控制与微囊藻毒素降解中的应用 - Google Patents
双效功能菌株wl及其在铜绿微囊藻控制与微囊藻毒素降解中的应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明公开了双效功能菌株WL及其在铜绿微囊藻控制与微囊藻毒素降解中的应用。通过从富营养化的三峡水库支流香溪河水体中筛选、分离得到了一株双效功能菌株WL(保藏编号为CGMCC 24976)，该菌株对铜绿微囊藻既具有溶藻作用，又可以降解微囊藻毒素。经16S rDNA序列对比分析鉴定，菌株WL属于异常球菌(Deinococcus sp.)。该菌株处理微囊藻毒素MC‑LR的第72小时降解效率为55.85％。菌株WL的初始浓度为1×105cells/mL时，7天后，对铜绿微囊藻的溶藻效率为97.40％。本发明可用于铜绿微囊藻水华污染和微囊藻毒素污染的治理中。
Description
技术领域
本发明属于蓝藻的污染治理领域，涉及双效功能菌株WL及其在铜绿微囊藻控制与微囊藻毒素降解中的应用。
背景技术
蓝藻是生长在水体表面和底部的生物，这些生物的大量繁殖可以在水体表面上形成蓝藻水华。由于难闻的气味及其有毒的蓝藻毒素，蓝藻水华已经成为一个严重的全球环境问题。大量繁殖的蓝藻通过阻挡阳光破坏水生生态系统，并消耗氧气。铜绿微囊藻形成的蓝藻水华现象在世界范围内具有普遍性、广泛性，并因其能够产生并释放出有毒的微囊藻毒素，给水生生物和人类健康的安全带来重大危害。微囊藻毒素是一类具有生物活性的环状七肽化合物，也是分布最广泛的肝毒素。微囊藻毒素能够抑制蛋白磷酸酶(PP1和PP2A)，诱导真核生物的氧化应激反应。2011年，根据世界卫生组织的要求，饮用水中微囊藻毒素(microcystin-LR，简称MC-LR)含量的阈值为1μg/L。微囊藻毒素具有稳定性和严重的毒性，对全球的生态系统和人类健康构成严重威胁。因此，控制铜绿微囊藻水华的形成，抑制微囊藻毒素的积累应该受到全球环境工作者的高度重视。
近年来，已经有不少研究工作者针对铜绿微囊藻分离了大量的溶藻细菌，以控制铜绿微囊藻的生长；也有部分研究工作者分离出了微囊藻毒素的降解菌株。然而，到目前为止，对能够抑制铜绿微囊藻生长，同时又可以降解微囊藻毒素的双效功能菌株的研究比较有限，这也限制了细菌在铜绿微囊藻水华污染及其微囊藻毒素污染治理中的应用。
发明内容
本发明目的是解决现有技术中存在的上述问题，提供双效功能菌株WL及其筛选方法，以及在铜绿微囊藻控制和微囊藻毒素MC-LR降解中的应用。所述菌株WL对铜绿微囊藻具有较强的溶藻作用，对微囊藻毒素MC-LR具有较强的降解作用。
本发明的技术方案
本发明首先提供了一株对铜绿微囊藻具有溶藻效果，同时对微囊藻毒素MC-LR具有降解效果的双效功能菌株WL。该菌株已于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏编号为CGMCC 24976，建议分类命名为Deinococcus sp.。
本发明从富营养化的三峡水库支流-香溪河水体中筛选、分离并纯化出一株异常球菌 WL，经16S rDNA序列对比分析鉴定，该菌株分类于异常球菌属(Deinococcus sp.)。该菌株为双效功能菌株，不仅可以对铜绿微囊藻具有溶藻效果，还可以降解微囊藻毒素 MC-LR。
所述的双效功能菌株WL为革兰氏阳性，菌落形态为圆形，橙色，光滑半透明，边缘整齐，较粘稠，易挑起。在扫描电子显微镜下为杆状，直径为2μm左右。
所述的双效功能菌株WL的16S rDNA序列如序列表SEQ ID NO.1所示。
本发明同时提供了所述双效功能菌株WL的筛选方法，所述筛选方法包括以下具体步骤：
(1)水样采集于湖北省宜昌市富营养化的香溪河，深度约1米左右。将水样经30μm的滤纸进行过滤，以去除较大的颗粒物，收集过滤液。
(2)将5mL经过滤的水样加入到45mL无菌的超纯水中，并在30℃条件下摇匀，转速设为120转/分钟。30分钟后，静置15分钟。
(3)取上清液1mL接种到9mL含有微囊藻毒素(MC-LR)的无机盐培养基(MSM) 培养瓶中，使MC-LR标准品的最终浓度为25mg/mL。
(4)将MC-LR作为细菌生长的唯一碳源和氮源，在恒温摇床30℃条件下对细菌进行培养，转速设置为120转/分钟。
(5)连续培养120小时后，用10mM的磷酸缓冲液PBS对样本进行梯度稀释。即吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的样本稀释液，分别接种到营养肉汤(NB)的固体平板中，进行稀释涂布。
(6)将涂布好的固体平板置于恒温培养箱中进行培养72～120小时，温度设置为30℃。
(7)观察恒温培养箱中的固体平板，将长有细菌群落的平板进行细菌分离与纯化。即挑取单菌到新的NB固体平板上，并进行划线、分离与培养，反复此步骤，直至获取纯化的单菌。
(8)对以上步骤(7)获得的单菌，利用NB液体培养基在恒温摇床30℃条件下培养24小时，转速设置为120转/分钟。
(9)对上述步骤(8)单菌培养液进行DNA提取，PCR扩增，然后进行16S rDNA 测序，对获得的序列在美国国家生物技术信息中心(NCBI)数据库网站(http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)中进行序列比对，鉴定该菌株为异常球菌Deinococcus sp.strain WL。
所述步骤(3)中的无机盐培养基MSM成分为：七水硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾4.0g，氯化钠1.0g，氯化钙0.02g,硫酸铁0.005g,四水氯化锰0.005g,氯化锌0.005g,氯化铜0.0005g，溶于1000mL超纯水，pH值用氢氧化钠或盐酸调节至7.0左右。
所述步骤(5)中的营养肉汤(NB)的培养基成分为：每升NB培养基需要蛋白胨 10g，牛肉浸粉3g，氯化钠5g，pH值用氢氧化钠或盐酸调节至7.0左右。营养肉汤(NB) 的固体培养基为：每100毫升NB培养基中加入2g琼脂粉。
本发明还提供了双效功能菌株WL的应用，可用于控制铜绿微囊藻的生长，还可用于降解微囊藻毒素MC-LR。并且该菌株对铜绿微囊藻同时具有直接和间接的溶藻作用，即菌株WL的细菌悬浮液和无菌过滤液对铜绿微囊藻均具有较强的溶藻作用，7天后，溶藻效率分别为99.93％和70.79％。
本发明的优点和有益效果：
(1)微囊藻毒素降解菌株的筛选，主要有两种方式，一种是通过筛选微囊藻的溶藻细菌来验证该菌株对微囊藻毒素是否具有降解效果，目前已分离的绝大多数溶藻细菌不具备降解微囊藻毒素的能力；另一种是直接对微囊藻毒素的降解菌株进行筛选，选用的常见培养基为以微囊藻毒素为唯一碳源和氮源的无机盐培养基，初步筛选时微囊藻毒素浓度一般不高于5mg/mL。本发明优先地对微囊藻毒素的降解菌株进行筛选，选用的培养基为浓度为25mg/mL的微囊藻毒素为唯一碳源和氮源的无机盐培养基，提高了微囊藻毒素降解菌株筛选的成功率；然后从微囊藻毒素的降解菌株里筛选出对铜绿微囊藻具有溶藻效果的菌株，即为双效功能菌株。
(2)本发明的双效功能菌株WL，以较低的浓度1×105cells/mL对铜绿微囊藻(初始浓度为1×106cells/mL)具有较强的溶藻效果，溶藻效率达到97.40％，与此同时，该菌株WL对微囊藻毒素MC-LR的降解效率达到55.85％，具有较强的降解效果。
(3)本发明的双效功能菌株WL，根据16S rDNA序列分析对比，该菌株分类于异常球菌属(Deinococcus sp.)，这也是首次发现异常球菌属的细菌对铜绿微囊藻具有溶藻效果，对微囊藻毒素具有降解效果。
(4)本发明的双效功能菌株WL，对铜绿微囊藻同时具有直接的和间接的溶藻作用，既可以通过与藻细胞直接接触的方式直接杀死藻细胞，也可以通过分泌某种活性物质间接地杀死藻细胞，而大部分溶藻细菌是通过其中一种方式来进行溶藻活动的。
(5)本发明的双效功能菌株WL，来自于富营养化的三峡水库支流-香溪河，水体中具有较高的藻类生物量，在常温或温度高达40℃环境下，均可良好的生长，具有良好的环境兼容性，成本低，在铜绿微囊藻水华及其微囊藻毒素污染的治理中具有较强的应用前景。
附图说明
图1为菌株WL的菌落形态。
图2为菌株WL的扫描电镜图。
图3为菌株WL的生物系统发育进化树。
图4为在微囊藻毒素MC-LR对菌株WL生长的促进作用。
图5为微囊藻毒素MC-LR的标准曲线图。
图6为菌株WL对微囊藻毒素MC-LR的降解图。
图7为菌株WL对铜绿微囊藻的溶藻作用。
图8为菌株WL的铜绿微囊藻的溶藻方式。
具体实施方式
下面结合实施例及说明书附图对本发明进行详细说明。
铜绿微囊藻(Microcystis aeruginosa)来源：购买自中国科学院水生生物研究所设立的淡水藻种库，该产品的编号为FACHB-573。
铜绿微囊藻培养基为BG11，每升BG11培养基需要硝酸钠1.5g，磷酸氢二钾0.04g，七水硫酸镁0.075g，二水氯化钙0.036g，柠檬酸0.006g，柠檬酸铁0.006g，EDTANa20.001g，碳酸钠0.02g，微量元素A5溶液1mL，pH值用氢氧化钠或盐酸调节至7.1。
微量元素A5溶液的成分是：硼酸2.86g，四水氯化锰1.86g，七水硫酸锌0.22g，钼酸钠0.39g，五水硫酸铜0.08g，六水硝酸钴0.05g，溶于1000mL超纯水中。
细菌的培养基为营养肉汤(NB)，成分组成为：蛋白胨10g，牛肉浸粉3g，氯化钠 5g，溶于1000mL超纯水中，pH值用氢氧化钠或盐酸调节至7.0左右。
营养肉汤NB的固体培养，每100毫升NB培养基中加入2g琼脂粉。
无机盐培养基MSM的成分组成为：七水硫酸镁1.0g，磷酸二氢钾0.5g，磷酸氢二钾4.0g，氯化钠1.0g，氯化钙0.02g,硫酸铁0.005g,四水氯化锰0.005g,氯化锌0.005g, 氯化铜0.0005g，溶于1000mL超纯水，pH值用氢氧化钠或盐酸调节至7.0左右。
实施例1
双效功能菌株WL的筛选
(1)水样采集于湖北省宜昌市富营养化的香溪河，深度约1米左右。将水样经30μm的滤纸进行过滤，以去除较大的颗粒物，收集过滤液。
(2)将5mL经过滤的水样加入到45mL无菌的超纯水中，并在30℃条件下摇匀，转速设为120转/分钟。30分钟后，静置15分钟。
(3)取上清液1mL接种到9mL含有微囊藻毒素(MC-LR)的无机盐培养基(MSM) 培养瓶中，使MC-LR标准品的最终浓度为25mg/mL。
(4)将MC-LR作为细菌生长的唯一碳源和氮源，在恒温摇床30℃条件下对细菌进行培养，转速设置为120转/分钟。
(5)连续培养120小时后，用10mM的磷酸缓冲液PBS对样本进行梯度稀释。即吸取10-1、10-2、10-3、10-4、10-5的样本稀释液，分别接种到营养肉汤(NB)的固体平板中，进行稀释涂布。
(6)将绘制好的固体平板置于恒温培养箱中进行培养72～120小时，温度设置为30℃。
(7)观察恒温培养箱中的固体平板，将长有细菌群落的平板进行细菌分离与纯化。即挑取单菌到新的NB固体平板上，并进行划线、分离与培养，反复此步骤，直至获取纯化的单菌。
(8)将上述纯化后的NB固体培养基上的菌落，置于4℃保存备用，并将其命名为Deinococcus sp.strain WL。
菌株WL的形态特征鉴定。如图1所示，菌株WL的菌落形态为圆形，橙色，光滑半透明，边缘整齐，较粘稠，易挑起。如图2所示，在扫描电子显微镜下为杆状，直径为 2μm左右。
从纯化的固体培养基上WL的菌落中挑取单菌接种于NB培养基中，在恒温摇床30℃条件下培养24小时，转速设置为120转/分钟。
菌株WL的鉴定。对培养24小时的菌株WL培养液进行DNA提取，PCR扩增，选用细菌通用引物为27F：(5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’)，1492R (5’-GGTTACCTTGTTACGACTT-3’)，然后进行16S rDNA测序，对获得的序列在NCBI 数据库网站中进行序列比对。最后，利用MEGAVersion 7.0软件中的Alignment程序对所得到的序列进行多重对比(Multiplealignments)，并构建系统发育进化树。采用邻位相连法(Neighbor-Joining)进行距离分析，用Maximum Composite Likelihood模式计算遗传距离，系统树的每个分支统计学显著性分析采用Bootstrap method进行检验，重复次数为1000次。菌株WL的系统发育进化树如图3所示，菌株WL与NCBI数据库中的 Deinococcus caeni strain Ho-08的序列最相近，相似度为99％，但在其系统发育进化树中，与菌株Ho-08的发育置信度仅为77％。
实施例2
菌株WL对微囊藻毒素MC-LR的降解实验
(1)从菌株WL的固体平板中，挑取单菌接种于NB培养基中，在恒温摇床30℃条件下培养20小时，转速设置为120转/分钟。
(2)菌株WL培养20小时后，吸取1mL的WL菌株培养液，在5000g条件下离心 15分钟，温度设置为25℃，弃去上清液，往底部沉淀的细菌团加入1mL的PBS缓冲溶液，进行重新悬浮，再次在5000g条件下离心15分钟，温度设置为25℃，弃去上清液，往底部沉淀的细菌团中加入1mL的PBS缓冲溶液，获得菌株WL的细菌悬浮液。
(3)利用流式细胞仪对上述菌株WL的细菌悬浮液进行浓度的测定，备用。
MC-LR降解实验按照表1设计进行。
表1MC-LR降解实验
每组设置3个平行，将各组样品置于恒温摇床上进行培养，温度设置为30℃，转速为120转/分钟。连续培养72小时，分别收集A组和B组的样品200μL，用于细菌浓度的测定；分别收集B组和C组的样品1mL，用于MC-LR浓度的测定，最后，计算细菌对MC-LR的降解效率，计算方法参考以下公式：
降解效率(％)＝(Mc–MB)/Mc×100
式中Mc代表C组中微囊藻毒素的平均浓度μg/L，MB代表B组中微囊藻毒素的平均浓度μg/L。
本发明分析比较A组和B组中菌株WL的生长浓度，如图4所示，MC-LR可以促进菌株WL的生长，菌株WL可以利用MC-LR为唯一的碳源和氮源而进行生长。[
本发明采用超高效液相色谱-质谱联用仪测定MC-LR的浓度，采用仪器的型号为Waters Xevo TQ-S(沃特世，美国)。该仪器为三重四极杆质谱，电喷雾离子源ESI以正离子模式对微囊藻毒素进行分析。MC-LR的标准曲线如图5所示，其相关系数R2为0.997，标准浓度分别设置为50、100、200、400、800ppb(ug/L)。MC-LR测定采用的是反向色谱柱(Waters，UPLC BEH C18,1.7μm，2.1mm，50mm)，柱温设定为40℃。进样量为 10μL，流速为0.3mL/min；流动相A由超纯水和0.2％的甲酸，流动相B由乙腈和0.1％的甲酸组成，分析的洗脱梯度为：0-5分钟，20％-80％B；5-6.5分钟，100％B。然后用 20％的流动相B平衡色谱柱2分钟。
本发明对比分析了B组和C组中MC-LR的浓度，如图6所示，不添加菌株WL的C 组中的MC-LR浓度基本保持不变，为574μg/L，而添加菌株WL处理组中MC-LR浓度呈降低趋势，直到第68小时浓度不再变化为250.4μg/L。这说明该菌株WL对微囊藻毒素MC-LR具有较强的降解作用，第72小时该菌株对微囊藻毒素MC-LR的降解效率为 55.85％。
实施例3
菌株WL对铜绿微囊藻的溶藻实验
(1)从菌株WL的固体平板中，挑取单菌接种于NB培养基中，在恒温摇床30℃条件下培养20小时，转速设置为120转/分钟。
(2)将培养20小时对数期WL菌株培养液接种于装有20mL铜绿微囊藻培养液的50mL无菌三角玻璃瓶中，铜绿微囊藻的初始浓度为1×106cells/mL左右，实验组中WL 的初始浓度分别设置为1×105cells/mL、1×106cells/mL和5×106cells/mL。不添加WL的铜绿微囊藻培养液设置为对照组，其他条件与其它三组实验组完全相同。
(3)将以上四组铜绿微囊藻培养液置于光照摇床下进行培养，设置如下：光照：黑暗＝12h：12h；光照强度为2000Lux；温度为25±1℃；震荡速度为80转/分钟。
(4)对以上四组铜绿微囊藻在0时刻，1d，3d，5d，7d分别进行取样1mL,利用流式细胞仪测定铜绿微囊藻的浓度。溶藻效率的计算采用以下公式：
溶藻效率(％)＝(Ac–At)/Ac×100
式中Ac代表对照组中铜绿微囊藻的浓度cells/mL，At代表实验组中铜绿微囊藻的浓度 cells/mL。
本发明分析了菌株WL在不同的浓度下对铜绿微囊藻的溶藻效果，如图7所示，对照组中铜绿微囊藻生长良好，浓度逐渐升高；添加1×105cells/mL、1×106cells/mL和5×106cells/mL的细菌WL的三个实验组，铜绿微囊藻的浓度远远低于对照组。这说明细菌WL对铜绿微囊藻具有较强的溶藻作用，且1×105cells/mL、1×106cells/mL和5×106cells/mL这三个浓度的细菌处理铜绿微囊藻7天后，溶藻效率分别为97.40％，82.67％和79.02％。
实施例4
菌株WL对铜绿微囊藻的溶藻方式
(1)从菌株WL的固体平板中，挑取单菌接种于NB培养基中，在恒温摇床30℃条件下培养20小时，转速设置为120转/分钟。
(2)实验组：将2mL的细菌悬浮液和2mL的无菌上清液分别接种于20mL对数期生长的铜绿微囊藻培养液中，藻细胞初始浓度为1×106cells/mL。细菌悬浮液的制备过程如下：利用NB培养基恒温培养菌株20小时后，细菌培养液在室温条件下10000g离心 10分钟，吸取上清液备用，底部剩余的沉淀细菌团用PBS缓冲液洗涤2次，用NB培养基重悬混匀即为细菌悬浮液。无菌上清液的制备过程如下：将细菌培养液离心后的上清液，用0.22μm聚碳酸酯滤器过滤，得到的无细胞滤液即为无菌上清液。以添加等体积NB培养基的铜绿微囊藻培养液为对照组，其他条件与实验组相同。
(3)将以上三组的铜绿微囊藻培养液，在0时刻，1d，3d，5d，7d分别进行取样1mL,利用流式细胞仪测定铜绿微囊藻的浓度。溶藻效率的计算采用以下公式：
溶藻效率(％)＝(Ac–At)/Ac×100
式中Ac代表对照组中铜绿微囊藻的浓度cells/mL，At代表实验组中铜绿微囊藻的浓度 cells/mL。
本发明分析了菌株WL对铜绿微囊藻的溶藻方式，如图8所示，与对照组相比，细菌悬浮液和无菌过滤液均显著抑制了铜绿微囊藻的溶藻效果，这说明菌株WL的细菌悬浮液和无菌过滤液对铜绿微囊藻均具有显著的溶藻效果，实验第7天对铜绿微囊藻的溶藻效果分别为99.93％和70.79％，即菌株WL对铜绿微囊藻同时具有直接的和间接的溶藻方式。
Claims (2)
1.双效功能菌株WL，其为异常球菌属(Deinococcus sp.)菌株WL，已于2022年5月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC NO. 24976。
2.权利要求1所述的双效功能菌株WL的应用，其特征在于，用于控制水体中铜绿微囊藻的生长，或用于水体中微囊藻毒素的降解。
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Legal Events
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| GR01 | Patent grant | ||
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Application publication date: 20230505 Assignee: TIANJIN SHENGJI GROUP Co.,Ltd. Assignor: NANKAI University Contract record no.: X2024980003317 Denomination of invention: Dual effect functional strain WL and its application in controlling Microcystis aeruginosa and degrading microcystins Granted publication date: 20230721 License type: Common License Record date: 20240321 |