CN109929785A - 一株能够降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株能够降解2,6‑二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂。经鉴定该降解菌株B5‑4为一株生物安全性较好的新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，已保藏于典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC M 2019088。本发明所述菌株可用于2,6‑二甲基苯酚的降解，24h内可完全降解50mg·L‑1的2,6‑二甲基苯酚；72h内对浓度在1～300mg·L^‑1的2,6‑二甲基苯酚的降解率高达99％以上；短时间内可将土壤中的2,6‑二甲基苯酚残留量降低99％，该菌株可用于清除环境中2,6‑二甲基苯酚残留污染。

Description

一株能够降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂

技术领域

本发明属于生物高技术领域，公开了一株能够高效降解2,6-二甲基苯酚的细菌及其生产的菌剂。

背景技术

二甲基苯酚(dimethylphenol，DMP)是自然界中一类常见的芳香烃，共有6种异构体：2,3-DMP，2,4-DMP，2,5-DMP，2,6-DMP，3,4-DMP和3,5-DMP。作为一类重要的化工中间体，DMP广泛应用于合成树脂、农药、香料、染料、抗氧剂、阻聚剂和抗菌剂等化合物。例如，2,6-二甲基苯酚(2,6-DMP)可用于合成工程塑料聚苯醚、农药甲霜灵和呋酰胺等，世界五大聚苯醚生产商里中国占两家(即“蓝星”和“鑫宝”)，由此可见，我国对2,6-DMP的需求量之大可见一斑。

2,6-DMP可以从煤炭裂解产生的煤焦油、石油裂解的混合酚中提取或通过化学合成。我国煤炭资源丰富，炼焦和煤焦油提取工业发达，产生大量含有2,6-DMP的废水。由于处理这些废水的能力不足且存在泄漏和违法偷排情况，每年有大量的2,6-DMP被释放到自然环境中。进入环境中的2,6-DMP对鱼类和水生无脊椎动物具有高的毒性；对人体而言，2,6-DMP容易被皮肤、粘膜和呼吸系统吸收，造成烧伤、肠道紊乱和神经错乱等伤害。环境中残留的2,6-DMP污染问题亟待解决。

微生物降解是清除环境中残留的2,6-DMP的一种理想方法，但是还缺乏相应的降解菌株资源。目前已报道的可以将2,6-DMP彻底分解代谢的菌株只有一株细菌(Ewers等，1989)，但由于该菌株分离获得至今已有40年，菌株已无从获得且其降解2,6-DMP能力的稳定性也需要进一步验证。因此，有必要继续分离筛选能降解代谢2,6-DMP的菌株并实现菌剂的大规模工业化生产，以应对修复环境中2,6-DMP的污染问题。

发明内容

技术问题本发明针对以上问题，分离筛选出一株可以高效降解2,6-DMP的菌株，该菌株72h内对浓度范围在1～300mg·L^-1的2,6-DMP的降解率高达99％以上。

技术方案下面为本方案的主要内容：

本发明提供一种催化2,6-DMP的降解菌B5-4，于2019年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC NO:M 2019088。该菌株经鉴定为一株新金分枝杆菌(Mycobacterium neoaurum)，该种属极少被报道为病原菌且其模式菌株Mycobacteriumneoaurum ATCC 25795的生物安全等级为一级，因此我们初步认为该菌株的生物安全性较好。该菌株在LB平板上的菌落形态为金黄色、边缘光滑、不透明；无芽孢、无鞭毛、不能运动、好氧的长杆状细菌。在实验室摇瓶条件下，24h内可完全降解50mg·L^-1的2,6-DMP(pH 7.0,30℃)；菌株B5-4催化2,6-DMP的浓度范围为从1mg·L^-1到500mg·L^-1，特别地，72h内对浓度在1～300mg·L^-1的2,6-DMP的降解率高达99％以上。

本发明所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在降解2,6-二甲基苯酚中的应用。

本发明所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在制备降解2,6-二甲基苯酚的菌剂中的应用。

一种用所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4生产的降解菌剂。

2,6-DMP降解菌株B5-4生产菌剂的流程：斜面接种——摇瓶种子液——发酵菌剂生产。

本发明所用培养基：

1、LB培养基：酵母粉，5.0g；蛋白胨，10.0g；NaCl，5.0g；去离子水，1L。(固体培养基加1.5％的琼脂粉)

2、发酵培养基：葡萄糖，10.0g；柠檬酸，1.5g；柠檬酸铁胺，0.1g；NH₄NO₃，2.0g；MgSO₄·7H₂O，0.2g；去离子水，1L。

3、基础盐培养基(MSM培养基)：NH₄NO₃,1.0g；KH₂PO₄,0.5g；K₂HPO₄,1.5g；NaCl,1.0g；MgSO₄·7H₂O,0.2g；去离子水，1L。(固体培养基加1.5％的琼脂粉)

本发明的详细实施步骤为：

1、将降解菌株B5-4划线LB试管斜面并置于30℃条件下培养；

2、挑取上述培养好的菌株单菌落至液体LB摇瓶中在30℃,180rpm条件下振荡培养至对数生长期作为种子液；

3、将培养好的种子液按5％的接种量接种至25L的发酵罐中扩大培养种子液，培养至对数生长期后再以5％的接种量接种至500L的发酵罐中继续发酵培养，所用培养基为发酵培养基，培养温度为30℃，通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2，搅拌速度为180-200转/分钟，整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后，将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。

4、本发明所述的菌剂在降解2,6-二甲基苯酚中的应用；优选在降解土壤中残留的2,6-二甲基苯酚中的应用。

有益效果

本发明提供一种能够高效快速降解2,6-DMP的菌株B5-4。在24h内可完全降解50mg·L^-1的2,6-DMP，特别是在72h内对浓度在1～300mg·L^-1的2,6-DMP的降解率高达99％以上，适用于2,6-DMP污染较轻、严重或非常严重的地区，因此该菌株具有广泛的应用潜力和价值。

该菌剂的生产具有成本低、使用方便、去除效果好等优点，适合在全国2,6-DMP污染区域，特别是煤矿开采行业地区大面积推广使用。本发明对于保护生态环境和保护人民身体健康都具有重要的意义。

附图说明

图1菌株B5-4的菌落形态(A)和透射电镜(B)照片

图2菌株B5-4的16S rRNA基因进化树分析

图3菌株B5-4对2,6-DMP的降解及生长曲线

图4菌株B5-4降解2,6-DMP的中间代谢物LC-MS分析

图5菌株B5-4降解2,6-DMP的代谢物途径

图6温度对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响

图7pH对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响

图8 2,6-DMP的初始浓度对菌株B5-4降解的影响

生物材料保藏信息

菌株B5-4，分类命名为分枝杆菌B5-4Mycobacterium sp.B5-4，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，菌株的保藏编号为CCTCC NO:M 2019088，保藏日期为2019年1月28日，保藏地址为中国武汉武汉大学。

具体实施方式

实施例1菌株的分离与鉴定

本发明提供一种高效降解2,6-DMP的菌株B5-4，分离自江苏省某长期受二甲基苯酚污染的土壤中。具体的菌株筛选方法为：取1g土样加入到含有50mg·L^-1 2,6-DMP的100mLMSM培养基中，于30℃、180rpm条件下振荡富集培养，5天后以5％的接种量转移到含有50mg·L^-1 2,6-DMP的100mL MSM新鲜培养基中继续振荡富集培养，以此方式连续进行四次传代富集培养。将第四次传代的富集液稀释涂布于含有50mg·L^-1 2,6-DMP的MSM固体培养基上，30℃条件下培养5天后挑取单菌落于含有50mg·L^-1 2,6-DMP的液体MSM试管中振荡培养，一周后取1mL培养液并加入等体积的二氯甲烷萃取，采用紫外分光光度计分析检测降解效果。将有降解效果的菌株经进一步纯化后保存于-80℃冰箱中待用。

经分离培养，筛选到一株可以高效降解2,6-DMP的菌株，命名为B5-4。该菌株经鉴定属于Mycobacterium neoaurum,并于2019年1月28日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M 2019088。菌株B5-4在LB平板上的菌落形态为金黄色、边缘光滑、不透明(图1A)；主要生物学特征为无芽孢、无鞭毛、不能运动、好氧的长杆状细菌(图1B)。菌株B5-4的16S rRNA基因序列经构建系统进化树比对分析，结果表明该菌株与Mycobacteriumneoaurum模式株ATCC 25795进化关系最近，二者的16S rRNA基因序列完全一致(图2)。根据以上形态、生理和16S rRNA基因序列分析结果，最终将菌株B5-4鉴定为Mycobacteriumneoaurum。

实施例2实验室降解实验

2.1降解菌液制备

挑取单菌落接种至LB培养基中振荡培养至对数生长期(30℃,180rpm)；离心收集菌体(4℃，6000rpm离心10min)，经MSM培养基洗涤两次后重悬于液体MSM培养基中，加入50mg·L^-1 2,6-DMP诱导培养细胞，12h后，6000rpm离心10min收集菌体，经MSM培养基洗涤两次后重悬于液体MSM培养基中作为降解菌液。

2.2菌株B5-4对2,6-DMP的降解

将降解菌液的OD₆₀₀调节至0.25左右接种至加了50mg·L^-1 2,6-DMP的新鲜MSM培养基中，30℃，180rpm条件下培养24h，定时取样，测定相应的OD₆₀₀值，同时采用高效液相色谱(HPLC)检测培养基中残留的2,6-DMP浓度，绘制菌株B5-4对2,6-DMP的降解及生长曲线。如图3所示，菌株B5-4能以2,6-DMP作为唯一碳源生长，24h内可完全降解50mg·L^-1的2,6-DMP。与此同时，采用高效液相色谱质谱联用仪(LC-MS)鉴定菌株B5-4降解2,6-DMP的代谢中间产物(图4)，并由此推测了一条2,6-DMP的微生物代谢途径(图5)。

2.3温度对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响

将降解菌液的OD₆₀₀调节至0.5接种到加了50mg·L^-1 2,6-DMP的新鲜MSM培养基中，在180rpm条件下振荡培养12h，温度分别设定为10℃、20℃、30℃、40℃和50℃，HPLC检测培养基中的2,6-DMP残留量并计算出相应的降解率。如图6所示，菌株B5-4在30℃时对2,6-DMP的降解率最高，高温(大于40℃)对降解效率的影响较为显著。

2.4pH对菌株B5-4降解2,6-DMP的影响

向pH为4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0和11.0的MSM培养基中分别加入终浓度为50mg·L^-1的2,6-DMP，再向其中分别加入OD₆₀₀为0.5的降解菌液，在30℃、180rpm条件下振荡培养12h，HPLC检测培养基中的2,6-DMP残留量并计算出相应的降解率。如图7所示，菌株B5-4在pH为7.0时对2,6-DMP的降解率最高；在pH在5.0到11.0范围内，菌株B5-4对2,6-DMP均表现出较高的降解活性，这表明菌株B5-4对催化环境的酸碱度具有极强的适应能力，特别是在碱性环境中仍然表现出很高的降解活性。

2.5 2,6-DMP的初始浓度对菌株B5-4降解的影响

在自然环境中，2,6-DMP的浓度很低。因此，菌株降解低浓度2,6-DMP具有非常重要的意义。相反，菌株对高浓度2,6-DMP污染物的耐受性和降解能力也需要进一步测定。本发明将OD₆₀₀为0.5的降解菌液分别加入含有不同2,6-DMP初始浓度的MSM中，2,6-DMP浓度分别设定为1mg·L^-1、2mg·L^-1、5mg·L^-1、10mg·L^-1、50mg·L^-1、100mg·L^-1、200mg·L^-1、300mg·L^-1和500mg·L^-1；定时取样，HPLC检测培养基中的2,6-DMP残留量。如图8所示，菌株B5-4在72h内对浓度在1～300mg·L^-1的2,6-DMP的降解率高达99％以上，特别是对1mg·L^-1或300mg·L^-1的2,6-DMP的降解率达到了99％以上，这表明菌株B5-4是修复环境中2,6-DMP污染物的良好候选菌株。

实施例3土壤降解实验

供试土样采自江苏南京紫金山下田园土，经磨碎过2mm筛，按20mg·kg^-1的终浓度将水溶的2,6-DMP母液均匀地喷洒到土壤中，置于通风橱中挥干搅拌均匀待用。每份土壤样品的质量为1kg，含水量维持在35％；调节降解菌液的OD₆₀₀为1，按5％(v/m)的接种量向土壤样品接种50mL菌液，混匀后置于30℃黑暗条件下恒温培养，并以不接菌的土壤作为对照。15天后，通过HPLC检测土壤样品中2,6-DMP的残留量并计算降解效率。结果表明菌株B5-4对土壤中残留的2,6-DMP降解效率达到99％。

实施例4菌剂制备

将本发明的2,6-DMP降解菌株B5-4经试管斜面活化测定其降解性能后，接种于LB培养基中振荡培养至对数生长期作为种子液；将培养好的种子液准备接种至25L的发酵罐中扩大培养种子液，所用的培养基为发酵培养基，投料量20L，投料完成后121℃高压湿热灭菌，经冷却至30℃后，将LB中培养的种子液按5％的接种量接种至该25L的发酵罐中，培养至对数生长期，培养温度设定为30℃，通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2，搅拌速度为180-200转/分钟；将培养好的25L的发酵罐中的菌液按5％的接种量接种至500L的发酵罐中扩大发酵培养，投料量400L，所用培养基、灭菌过程及发酵过程中条件参数与25L发酵罐相同，整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后，将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。

Claims (7)

1.一株2,6-二甲基苯酚的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4，于2019年1月28日保藏于中国典型培养物保藏中心，菌种保藏号为CCTCC M 2019088。

2.权利要求1所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在降解2,6-二甲基苯酚中的应用。

3.权利要求1所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4在制备降解2,6-二甲基苯酚的菌剂中的应用。

4.一种用权利要求1所述的降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4生产的降解菌剂。

5.根据权利要求4所述的降解菌剂，其特征在于所述的降解菌剂是通过以下方法生产而成：

1)将降解菌株Mycobacterium neoaurum B5-4划线LB试管斜面并置于30℃条件下培养；

2)挑取上述培养好的菌株单菌落至液体LB摇瓶中在30℃,180rpm条件下振荡培养至对数生长期作为种子液；

3)将培养好的种子液按5％的接种量接种至25L的发酵罐中扩大培养种子液，培养至对数生长期后再以5％的接种量接种至500L的发酵罐中继续发酵培养，所用培养基为发酵培养基，培养温度为30℃，通入无菌空气的通气量体积比为1:0.8-1.2，搅拌速度为180-200转/分钟，整个菌剂的生产流程耗时5-7天。发酵结束后，将发酵菌液出罐用塑料包装桶分装成液体菌剂。

6.权利要求5所述的菌剂在降解2,6-二甲基苯酚中的应用。

7.根据权利要求6所述的应用，其特征在于权利要求5所述的菌剂在降解土壤中残留的2,6-二甲基苯酚中的应用。