CN105255784B - 茶叶叶围优势菌及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了茶叶叶围优势菌及其在吡虫啉降解中的应用，菌株代号BCL‑1，经鉴定为不动杆菌Acinetobacter sp.于2015年9月8号在中国菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏号为：CGMCCNo.11343，16S rRNA基因序列在NCBI的序列号为KT370860。该菌从茶叶叶围中分离到，且可以在3d内降解100mg/l的吡虫啉达到93.2%。用途为：该菌用于茶叶鲜叶中吡虫啉残留的原位生物降解，还可用于受吡虫啉污染的水体、土壤和农产品的生物净化。

Description

茶叶叶围优势菌及其应用

技术领域

本发明属于微生物领域，设计茶叶叶围微生物开发及其在农药残留降解降污中的应用。

背景技术

叶围微生物以“联合”或者“粘附”方式附生在植物表面，参与植物生理活动，如光合作用的Ca²⁺信号传递、电子交换等物质和能量交换。在长期的进化过程中，与植物形成互助进化机制，大多具有运动性和趋化性，会对叶表面化学影响做出正反应，反过来，叶表面的化学组成也会影响叶面附着微生物的结构与特性。农药作为植物生长环境过程中一个重要的因素，在很大程度上影响植物叶面微生态环境也改变了叶表面附着物的化学组成结构，进而诱导附着微生物功能特性的协同进化。

茶是多年生灌木，整个生活史长达几十年，由于病虫害的发生以及茶叶自身强吸附性，使得农药施用容易导致茶叶农药残留超标，因此寻找降解茶叶农残超标的方法对于提高茶叶安全质量意义重大。而微生物通过分泌某些代谢物或者自身酶系统对外源农药进行解毒、氧化、还原等方式实现生物降解，无二次污染，环保，安全。因此微生物降解是治理农药残留超标的安全绿色方法。从茶叶叶围微生物筛选和分离对农药残留具有降解的作用的降解菌，可以实现原位降解，避免出现环境不兼容问题，也保证环境安全问题。

发明内容

本发明的目的在于提供一株高效、定植能力强的具有吡虫啉原位生物修复作用的不动杆菌及其应用。

本发明的技术方案为：一种茶叶叶围优势菌，经鉴定为不动杆菌（Acinetobactersp），编号BCL-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2015年9月8号，保藏编号为：CGMCCNo. 11343；菌株16 S rDNA的Genbank的登录号为KT370860，不动杆菌（Acinetobacter sp）BCL-1为革兰氏阴性，菌株杆状，大小约为：1.3×2.7μm，氧化酶、柠檬酸盐利用测定为阳性；淀粉水解、明胶液化、硫化氢、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖发酵测定为阴性。

一株茶叶叶围优势菌的应用，所述不动杆菌（Acinetobacter sp）BCL-1能以吡虫啉为唯一碳源和氮源进行生长，用于原位降解茶叶上残留的吡虫啉。

所述的原位降解为直接可以定植于茶叶鲜叶并进行茶叶鲜叶吡虫啉残留的生物降解。

茶叶叶围优势菌Acinetobacter sp对吡虫啉的降解，通过液态形式发酵液进行，所述降解在28-35℃、pH6.5-8.下进行；优选的，所述降解在30℃、pH=7.5下进行。

茶叶叶围优势菌Acinetobacter sp可原位净化茶叶鲜叶吡虫啉，实现茶叶鲜叶吡虫啉残留中的原位降解应用。

本发明的优点：本发明的不动杆菌BCL-1是常见细菌，经检索专利和其他相关文献，尚未发现其是茶叶叶围优势微生物组成结构，也未发现能够降解吡虫啉的不动杆菌属菌种，且该菌种能够在低浓度下对吡虫啉进行降解，在茶叶鲜叶上具有良好的定殖能力和对茶叶鲜叶吡虫啉的降解效能高。该菌从茶叶叶围中分离到，且可以在3d内降解100mg/l的吡虫啉达到93.2%。用途为：该菌用于茶叶鲜叶中吡虫啉残留的原位生物降解，还可用于受吡虫啉污染的水体、土壤和农产品的生物净化。

附图说明

图1 为本发明中茶叶叶围优势菌Acinetobacter sp的透射电镜照片；

图2为吡虫啉测定结果图；

图3为本发明中茶叶叶围优势菌Acinetobacter sp对吡虫啉的降解效果图（图中Retation time 表示物质分离的保留时间；Intensity 表示物质的丰度）；

图4为 pH对Acinetobacter sp降解吡虫啉效果的影响；

图5为温度对Acinetobacter sp降解吡虫啉效果的影响；

图6为底物浓度对Acinetobacter sp降解吡虫啉效果的影响；

图7为 Acinetobacter sp对茶叶鲜叶吡虫啉残留的降解能力评估。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不限于此。

实施例1：茶叶叶围优势菌的分离及吡虫啉降解菌BCL-1的驯化、筛选。

茶叶叶围优势菌的分离及吡虫啉降解菌的驯化和筛选，具体步骤如下：

茶叶叶围优势菌的分离：采用五点取样法，用无菌纸袋及无菌剪刀采集茶枝第一、二、三、四叶、老枝着生叶各50片，充分混匀，然后随机取20片，用直径1厘米的无菌打孔器取叶片组织块，随机取叶片组织40块，放入100毫升无菌水中充分振荡30min，制成含菌液。取1毫升含菌液体加到无菌培养皿内，将已融化、温度降至40-45℃的牛肉膏蛋白胨培养基导入有含有菌液体培养皿中，迅速混匀，待凝固后置于恒温培养箱中，30℃，培养2天。

所述牛肉膏蛋白胨(NA)培养基为（1L）：牛肉膏10.0 g，蛋白胨3.0 g，葡萄糖 5.0g，pH7.2。

吡虫啉降解菌的驯化培养：将NA培养基上分离到的菌株，进行纯化，并接种到NA液体培养液中制成菌悬液。取10ml菌悬液接入到50ml的吡虫啉无机盐培养基中（吡虫啉浓度为50mg/l），于30℃、180r/min摇床上震荡培养7d；每隔24小时进行菌株生长量和吡虫啉浓度的检测。

所述无机盐培养基（1L）为：每升无机盐培养基含磷酸氢二钠1.5g，磷酸二氢钾1.5g，硝酸铵1g，硫酸镁0.2g，氯化钙0.01g，硫酸亚铁0.001g，酵母提取物0.05g。

所述菌株生长量测定：菌株生长量的测定以菌体湿重作为指标，取5ml的培养液进行10000rmp离心，称取菌体湿重。

所述培养液中吡虫啉浓度的测定：取10 mL培养液于50 mL带磨口塞的三角瓶中，加入10 mL二氯甲烷，盖上瓶塞，超声波提取5 min，吸取下层于一新的锥形瓶中，上层清液再加入5 mL二氯甲烷超声提取2 min，取下层与第一次下层有机相合并，转移入一干净的旋转蒸发瓶中，调旋转蒸发仪温度至40℃，旋转蒸发干之后，向瓶中加入2 mL色谱级甲烷，旋转摇荡使瓶壁上残留农药尽量溶解，过0.45 µm有机滤膜，收集溶液于GC小瓶中，经高效液相色谱柱分析菌株对吡虫啉的降解率。高效液相色谱条件：色谱柱：Symmetry Cl8（0.5 um×4.5 min×250 mm）。检测器：L-2430检测器；流动相：水/甲醇(1：4，v/v)；流速：1 mL/min：进样量10μL，柱温30℃，检测波长270nm。

相对降解率=（CK含量-降解菌讲解后含量）/CK含量×100%

吡虫啉降解菌的筛选：菌株BCL-1在吡虫啉无机盐培养基内的生长量增长最快，5天内达到0.082mg/ml，及对无机盐培养基内吡虫啉的降解率最高，降解率为91.27%，因此茶叶叶围优势菌株BCL-1对吡虫啉显示很好的降解潜能。

实施例2：茶叶叶围优势菌BCL-1的鉴定。

通过16S rDNA序列分析和生理生化实验鉴定，确定菌株BCL-1为不动杆菌属。具体步骤如下：

采用DNA提取试剂盒（天根）提取和纯化菌株的DNA，4℃保存。选用细菌的16s通用引物由上海生工生物有限公司合成：

上游引物为：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3’

下游引物为：5’-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3’

扩增反应体系：10 Buffer (Mg2+) 2μL，dNTPs2μL，引物各1μL，菌体DNA1μL， TaqDNA聚合酶0.5μL，加去离子水至20μL。

PCR反应程序设定为：94℃预变性4min；然后94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35次，然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。PCR产物进行测序（上海生工生物技术有限公司）。

测序结果与Genbank数据库进行比对，发现其属于不动杆菌属。

基于测序结果和生理生化试验结果，确定BCL-1属于不动杆菌属。因此，将该菌命名为Acinetobacter sp BCL-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称CGMCC：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101），保藏日期为2015年9月8日，保藏编号为CGMCC No.11343。

实施例3：茶叶叶围菌BCL-1的对吡虫啉降解效果鉴定。

将BCL-1菌接种于液体LB中30℃、180r/min振荡培养至对数期。将5ml培养液于10000r/min离心2min，弃去上清液后用等体积的0.01PBS缓冲液重悬菌体后接种于50mg/L吡虫啉无机盐液体培养基内，30℃、180r/min，培养3d后用液相色谱仪进行检测菌体的降解率。降解实验设对照，三个重复。

由上述公式计算出吡虫啉降解菌BCL-1的降解率为93.2%。

实施例4：外界环境因素对降解效果的影响。

吡虫啉初始浓度对降解菌BCL-1降解率的影响：分别配置10ppm、20ppm、30ppm、40ppm、50ppm的吡虫啉无机盐分别转入100mL于三角瓶中灭菌待用。分别向上述吡虫啉无机盐中接种10%的活化好的BCL-1菌悬液，于30℃、180r/min的恒温摇床上培养5d后，测定各处理的降解效果。

培养温度对降解菌BCL-1降解率的影响：向灭好菌的50ppm吡虫啉无机盐培养基中接种10%活化好的BCL-1PBS菌悬液，分别与20、25、30、35、40℃下培养5d，测定各处理的降解率。

培养基pH对降解菌BCL-1降解率的影响：分别配置pH=5.5、6、6.5、7、7.5、8的50ppm吡虫啉无机盐培养基，接种5%的BCL-1的PBS菌悬液，于30℃、180r/min的恒温摇床上培养5d，测定各处理的降解效果

培养时间对降解菌BCL-1降解效果的影响：向50ppm、pH的吡虫啉无机盐培养基中接种5%的BCL-1PBS菌悬液，于30℃、180r/min的恒温摇床上培养5d，每隔24h取样一次，测定吡虫啉含量。

结果显示，吡虫啉降解菌BCL-1的最佳降解条件为：30℃、pH=6.5。吡虫啉初始质量浓度在10-50ppm都有较好的降解效果，降解率均可达89%。培养到第3天时，降解菌对吡虫啉的降解已较充分。

实施例5：降解菌BCL-1在茶叶鲜叶上的定植效果及对茶叶鲜叶吡虫啉残留的降解能力评估。

以喷雾的方式单位面积茶叶，24小时后，将对数期的BCL-1PBS菌悬液50ml，以喷雾的形式喷洒到茶叶上，5天后，取茶叶鲜叶进行吡虫啉提取和含量测定，试验设置3各重复和对照。

茶叶中吡虫啉的测定方法：称取10.0g茶叶样品，粉碎，转入250mL具塞三角瓶中，先后加入1mol/L盐酸3mL和100mL二氯甲烷摇匀，浸泡2-3h后震荡1h，二氯甲烷液经无水硫酸钠脱水，过滤入250mL平底烧瓶中。剩余残渣再加80mL二氯甲烷震荡1h，无水硫酸钠脱水过滤。滤液在旋转蒸发器上降压浓缩至干，待SPE-C18柱净化。

结果显示5天后，降解菌BCL-1对茶叶吡虫啉残留的降解率达到86.7%，茶叶鲜叶上吡虫啉残留浓度为5.7mg/kg。

Claims (3)

1.一种茶叶叶围优势菌，经鉴定为不动杆菌(Acinetobacter sp)，编号BCL-1，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期2015年9月8号，保藏编号为：CGMCCNo.11343；菌株16 S rDNA的Genbank的登录号为KT370860，其特征在于：不动杆菌(Acinetobacter sp)BCL-1为革兰氏阴性，菌株杆状，大小约为：1.3×2.7μm，氧化酶、柠檬酸盐利用测定为阳性；淀粉水解、明胶液化、硫化氢、葡萄糖、乳糖、蔗糖、果糖发酵测定为阴性。

2.一株茶叶叶围优势菌的应用，其特征在于：所述株茶叶叶围优势菌为权利要求1中的所述不动杆菌(Acinetobacter sp)编号BCL-1，能以吡虫啉为唯一碳源和氮源进行生长，用于原位降解茶叶上残留的吡虫啉。

3.如权利要求2所述的叶围优势菌的应用，其特征在于：所述的原位降解为直接可以定植于茶叶鲜叶并进行茶叶鲜叶吡虫啉残留的生物降解。