CN105112345A - 一种鞘脂菌(Sphingobium sp.)IBY及其在吸附降解疏水性有机物中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种鞘脂菌(Sphingobium？sp.)IBY及其在吸附降解疏水性有机物中的应用。该菌于2015年7月1日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC？NO：M？2015419。本发明提供了一种具有降解疏水性有机物能力的疏水细菌新种：鞘脂菌(Sphingobium？sp.)IBY，为疏水性有机物的环境污染治理提供了有效的降解菌种资源。

Description

一种鞘脂菌(Sphingobium sp.)IBY及其在吸附降解疏水性有机物中的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一种鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY及其在吸附降解疏水性有机物中的应用。

背景技术

细菌细胞的疏水相互作用是指疏水性较强的细胞能够避开水而易与疏水性较强的物质发生作用。疏水性是决定细菌非特异性黏附到各种生物和非生物表面及界面的最重要因素之一，也是影响细菌吸收和降解疏水性有机物的主要因素之一。在利用微生物降解疏水性有机物的过程中，细胞表面疏水性影响细菌对污染物的黏附，能促进细菌对疏水性有机物的吸附和降解。

结构决定性质，细菌细胞表面疏水性是菌体的表面性质之一，也必定是菌体表面结构所决定的。研究表明，革兰氏阴性菌的脂多糖和外膜蛋白与菌体表面疏水性具有一定的关联。鞘脂菌(Sphingobium)属细菌属于广义上的鞘氨醇单胞菌(Sphingomonas)，其细胞膜组成不同于一般的革兰氏阴性菌特有的脂多糖，而取而代之的是鞘糖脂，因此推测广义鞘氨醇单胞菌比其他革兰氏阴性菌具有更强的细胞表面疏水性。

虽然广义鞘氨醇单胞菌被认为比其他革兰氏阴性菌具有更强的细胞表面疏水性，但目前所报道的广义鞘氨醇单胞菌都是亲水菌，它们细胞表面疏水性都不高，仍不属于疏水细菌，而且细胞表面疏水性随着细菌生长状态的不同而表现差异，并与培养过程添加的碳源物质和电子受体有关。一种性质稳定的真正意义上的疏水细菌的获得，无疑将给疏水性有机物的污染问题的解决带来曙光。

发明内容

本发明的第一个目的是提供一种疏水鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY，该细菌于2015年7月1日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2015419。

本发明的鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY是通过对广东汕头某电子垃圾集中处理区的河床底泥进行富集培养、分离、纯化，得到Sphingobium属的一个新种。

鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的形态学和生理生化特征：该菌24h平板培养物菌落圆形、黄色，突出培养基，透明，直径0.5-1.0mm。菌体革兰氏阴性，不形成芽孢，端生鞭毛。菌体呈现长1.0-3.0μm宽0.6-0.9μm的长杆状形态。氧化酶和过氧化氢酶阳性。该菌能在好氧和兼性厌氧条件下生长，生长pH4.0～9.0。

鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的分子分类学地位：按照常规方法提取鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的总DNA。采用16SrRNA通用引物8F和1492R利用高保真酶扩增其16SrRNA基因，将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测序，获得其16SrRNA基因序列，其序列如SEQIDNO.1所示。将该序列与NCBI的GenBank中序列进行比对，进行BLAST分析，结果发现鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的16SrRNA基因序列与Sphingobium属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与SphingobiumxenophagumBN6的序列相似性为99％。再扩增其gyrB基因，将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测序，获得的gyrB基因序列，其序列如SEQIDNO.2所示。经BLAST分析，其与SphingobiumxenophagumBN6相似度为96％。采用复性速率液相杂交法测得鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY与SphingobiumxenophagumBN6的全基因组DNA-DNA杂交率为54.5％。

鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的细胞表面疏水性：通过微生物黏着碳氢化合物(MATH)法测得该菌的细胞表面疏水性为58.9％；水相接触角测量(CAM)法测得该菌的水相接触角为60.4°。上述两种结果均远远大于同属亲缘性最高的SphingobiumxenophagumBN6，并且属于疏水细菌范畴。

综合上述形态学、生理生化特征和分子分类学结果，认为(Sphingobiumsp.)IBY属于Sphingobium属的一个新种，于2015年7月1日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2015419。

本发明的第二个目的是提供鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY在吸附降解疏水性有机物中的应用，优选为在吸附降解多溴联苯醚或苯系物中的应用，更优选的为在吸附降解十溴二苯醚中的应用。

本发明的鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY具有很强的细胞表面疏水性，在纯有机溶剂十六烷烃中能较长时间保持较高存活率，能有效地吸附十溴二苯醚、苯系多种疏水性有机物，在疏水有机物(比如十溴二苯醚)为碳源的培养基中能较快降解多种疏水性有机污染物。

本发明提供了一种具有降解疏水性有机物能力的疏水细菌新种——鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY，为疏水性有机污染物的环境污染治理提供了有效的降解菌种资源。

本发明的Sphingobiumsp.IBY已于2015年7月1日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2015419。

附图说明

图1是鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY在水相/十六烷烃两相系统中分离不同时间的照片。图中分别表示SphingobiumxenophagumBN6(B)和鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY(C1)在水相/十六烷烃两相系统中20min和18h的存活情况。

图2是鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的水相接触角照片。其中，B为SphingobiumxenophagumBN6的水相接触角，C1为鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的水相接触角。

具体实施方式

以下实施例是对本发明的进一步说明，而不是对本发明的限制。

实施例1：鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的分离和鉴定

取20g广东汕头某电子垃圾集中处理区的河床底泥，加入80mL无菌水搅匀打散后，过筛去掉植物残渣及大颗粒物；滤液再经过2000×g，常温，离心2min，去掉小颗粒物；得到的上清液经过6000×g，常温，离心10min，收集沉淀物；沉淀物加入80mL无菌水，洗涤、离心处理三次。最后获得的沉淀物作为种源，接种到无机盐培养基中(Na₂HPO₄5.7mM，KH₂PO₄3.3mM，NH₄Cl18.0mM，酵母抽提物0.2g/L，β-环糊精10mM)，培养基中同时加入1μM的BDE209和2.8g/L的零价铁粉。固体培养基中加入20g/L琼脂。培养物置于30℃静置避光培养，每月经过6000×g，常温，离心10min，收集沉淀物，重新转入新的培养基进行培养。连续培养12个月以后，将富集培养物在固体培养基上划线培养，得到单菌落。由此获得菌株IBY。

将菌株IBY进行形态学和生理生化鉴定，其形态学和生理生化特征如下：该菌24h平板培养物菌落圆形、黄色，突出培养基，透明，直径0.5-1.0mm。菌体革兰氏阴性，不形成芽孢，端生鞭毛。菌体呈现长1.0-3.0μm宽0.6-0.9μm的长杆状形态。氧化酶和过氧化氢酶阳性。该菌能在好氧和兼性厌氧条件下生长，生长pH4.0～9.0。

按照常规方法提取菌株IBY的基因组总DNA。采用16SrRNA基因通用引物8F和1492R扩增其16SrRNA基因，8F：5’-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'，M＝A/C；1492R：5’-GGTACCTTGTTACGACTT-3'。选择如下PCR反应体系和程序：10×PCRbuffer5.0μL，10.0mmol/LdNTP1.0μL，10.0pmol/uL8F引物1.0μL，10.0pmol/uL1492R引物1.0μL，10ng/uL基因组DNA1.0μL，2.5U/μL高保真Taq酶0.5μL，去离子水补足50.0μL。94℃预变性5min后，94℃变性45s、56℃退火45s、68℃延伸1.5min，30个反应循环后，68℃延伸10min；扩增其16SrRNA基因。将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测序，获得的16SrRNA基因序列，其序列如SEQIDNO.1所示。将该序列与NCBI的GenBank中序列进行比对，进行BLAST分析，结果发现菌株IBY的16SrRNA基因序列与Sphingobium属的已有模式菌株具有较高的相似性，其中与SphingobiumxenophagumBN6的序列相似性为99％。

采用引物gyrB-U：5’-ATGAGCGASGAAMCCCAGAA-3'，S＝C/G，M＝A/C以及引物gyrB-D：5’-GTCCAGATTGGCGACGTTC-3'，并选择如下PCR反应体系和程序：10×PCRbuffer5.0μL，10.0mmol/LdNTP1.0μL，10.0pmol/uLgyrB-U引物1.0μL，10.0pmol/uLgyrB-D引物1.0μL，10ng/uL基因组DNA1.0μL，2.5U/μL高保真Taq酶0.5μL，去离子水补足50.0μL。94℃预变性5min后，94℃变性45s、53℃退火45s、68℃延伸3min，30个反应循环后，68℃延伸10min；扩增其gyrB基因。将PCR产物连接T载体后挑选阳性克隆进行测序，获得的gyrB基因序列，其序列如SEQIDNO.2所示。经BLAST分析，其与SphingobiumxenophagumBN6相似度为96％。

按照常规方法提取菌株IBY和BN6的基因组总DNA，测定DNA在A₂₃₀、A₂₆₀和A₂₈₀波长的吸光值，若比值符合A₂₃₀∶A₂₆₀∶A₂₈₀＝1∶0.450∶0.515的比例关系，则进行后续操作，否则继续纯化DNA。将符合要求的DNA置于冰浴中40W超声4次，每次15s。超声剪切后的DNA样品用0.1×SSC缓冲液配制成OD₂₆₀为1.5～2.0的DNA样品。分别取IBY、BN6的DNA样品各500μL于两个比色皿中，IBY、BN6各250μL混合装于第三个比色皿中，置于相应样品槽中。99℃变性10min，并用预热的吸管吸取预热的10×SSC缓冲液500μL加入变性样品中，混匀，在最适复性温度71℃复性30min，记录吸光值OD₂₆₀，每隔5min记录一次。采用以下公式求得样品IBY、BN6和混合样品的复性速率V_IBY、V_BN6和V_M，复性速率V＝(0min吸光值-30min吸光值)/30。采用以下公式计算DNA-DNA杂交率：D％＝[4V_M-(V_IBY+V_BN6)]/2V_IBYV_BN6。最后测得菌株IBY与SphingobiumxenophagumBN6的全基因组DNA-DNA杂交率为54.5％。

综合上述形态学、生理生化特征和分子分类学结果，认为菌株IBY属于Sphingobium属的一个新种，定名为鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY，于2015年7月1日保存于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，地址：中国武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCCNO：M2015419。

实施例2：鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的细胞表面疏水性

采用微生物黏着碳氢化合物(MATH)法测定细菌的细胞表面疏水性。从平板上挑取菌株(鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY或SphingobiumxenophagumBN6)单克隆于5mLLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。按1％接种量转接过夜培养物于新鲜LB培养液中，30℃振荡培养至菌体对数生长期的中后期。9000×g离心10min收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)洗涤两次后，最后用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)重悬菌体至OD₆₀₀＝0.4。在玻璃试管中加入3mL菌悬液，测定此时OD₆₀₀值，记为OD₆₀₀1。加入0.15mL正十六烷烃，涡旋30s后静置45min，测定此时OD₆₀₀值，记为OD₆₀₀2。采用以下公式计算菌体细胞表面疏水性：CSH％＝[OD₆₀₀1-OD₆₀₀2]/OD₆₀₀1×100％。通过这种方法测得鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的细胞表面疏水性为58.9％，属于中等疏水细菌(36-70％)；SphingobiumxenophagumBN6的细胞表面疏水性为14.5％，属于亲水细菌(0-36％)。

采用水相接触角测量(CAM)法测定细菌的疏水性。从平板上挑取菌株单克隆于5mLLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。按1％接种量转接过夜培养物于新鲜LB培养液中，30℃振荡培养至菌体对数生长期的中后期。9000×g离心10min收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)洗涤两次后，最后用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)重悬菌体至OD₆₀₀＝0.4。使用直径为35mm、孔径为0.22μm的滤膜过滤菌悬液至滤膜表面完全覆盖细菌无水漏过状态，制备的菌膜置于琼脂/水平板上(无营养成分)保湿。在测量前两小时取出滤膜风干，然后通过光学接触角测定仪测定菌膜的水相接触角。通过这种方法测得鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的水相接触角为60.4°，属于疏水细菌(>50°)；SphingobiumxenophagumBN6的水相接触角为11.9°，属于亲水细菌(<20°)，结果如图2所示。

上述两种结果表明鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY的细胞表面疏水性均远远大于同属亲缘性最高的SphingobiumxenophagumBN6，并且属于疏水细菌范畴。

实施例3：鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY在有机溶剂中的存活能力

从平板上挑取菌株单克隆于5mLLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。按1％接种量转接过夜培养物于新鲜LB培养液中，30℃振荡培养至菌体对数生长期的中后期。9000×g离心10min收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)洗涤两次后，最后用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)重悬菌体至OD₆₀₀＝0.4。在玻璃试管中加入3mL菌悬液和0.50mL正十六烷烃，涡旋30s后静置，每隔一段时间取适量菌液进行电子显微镜观察，并取适量菌液涂布LB平板后30℃培养，计算长出的活菌数。取样的20min和18h测得鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY在有机相正十六烷烃中的存活率为95％和63％，而相应的SphingobiumxenophagumBN6的存活率为51％和0％，结果如图1所示。表明疏水鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY在纯有机溶剂中能较长时间保持较高存活率。

实施例4：鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY对多溴二苯醚的吸附能力

从平板上挑取菌株单克隆于5mLLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。按1％接种量转接过夜培养物于新鲜LB培养液中，30℃振荡培养至菌体对数生长期的中后期。9000×g离心10min收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)洗涤两次后，最后用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)重悬菌体至OD₆₀₀＝0.4。使用直径为35mm、孔径为0.22μm的滤膜过滤菌悬液至滤膜表面完全覆盖细菌无水漏过状态，制备的菌膜置于玻璃平板上风干。

配制缓冲液：含有2.0g/LNa₂HPO₄·12H₂O，0.7g/LKH₂PO₄，0.5g/LNH₄Cl，0.2g/LNaCl，0.1g/LMgSO₄·7H₂O，0.05g/LCaSO₄·2H₂O，0.2×10^-3g/LFeCl₃·6H₂O，0.2×10^-3g/LNaMoO₄，0.2×10^-3g/LMnCl₂·4H₂O，0.2×10^-3g/LCuCl₂·2H₂O，0.2×10^-3g/LZnSO₄，0.3×10^-3g/LH₃BO₃和0.4×10^-3g/LCoCl₂·6H₂O，余量为水，调节pH7.0。添加十溴二苯醚使其终浓度为4mg/L。将风干的菌膜置于添加了十溴二苯醚的缓冲液中，静置，不同时间后取出菌膜于一个棕色培养瓶中，50℃烘干。加入等体积的正己烷萃取菌膜吸附的十溴二苯醚，用0.22μm有机相膜过滤正己烷后，进行HPLC测定。吸附时间为15min、30min、60min、120min时，鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY吸附的十溴二苯醚的量分别为1.03、1.38、1.82、2.08mg/L；而相应的SphingobiumxenophagumBN6吸附的十溴二苯醚的量仅为0.38、0.60、0.67、0.61mg/L；表明疏水鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY对疏水性有机物多溴二苯醚具有较强的吸附能力。

实施例5：鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY对苯系物的吸附能力

从平板上挑取菌株单克隆于5mLLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。按1％接种量转接过夜培养物于新鲜LB培养液中，30℃振荡培养至菌体对数生长期的中后期。9000×g离心10min收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)洗涤两次后，最后用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)重悬菌体至OD₆₀₀＝0.4。在玻璃试管中加入3mL菌悬液，测定此时OD₆₀₀值，记为OD₆₀₀1。分别加入0.15mL甲苯、乙苯、二甲苯，涡旋30s后静置45min，测定此时OD₆₀₀值，记为OD₆₀₀2。采用以下公式计算菌体在苯系物中的吸附能力：[OD₆₀₀1-OD₆₀₀2]/OD₆₀₀1×100％。通过这种方法测得鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY对苯系物的吸附能力分别为甲苯51.39％、乙苯79.25％、二甲苯74.70％，说明鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY对苯系物有较高的吸附能力。

实施例6：鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY对多溴联苯醚的降解能力

从平板上挑取菌株单克隆于5mLLB液体培养基中，30℃振荡培养过夜。按1％接种量转接过夜培养物于新鲜LB培养液中，30℃振荡培养至菌体对数生长期的中后期。9000×g离心10min收集菌体沉淀，用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)洗涤两次后，最后用磷酸盐缓冲液PBS(pH7.0)重悬菌体至OD₆₀₀＝0.4。配制含有十溴二苯醚的培养液：含有2.0g/LNa₂HPO₄·12H₂O，0.7g/LKH₂PO₄，0.5g/LNH₄Cl，0.2g/LNaCl，0.1g/LMgSO₄·7H₂O，0.05g/LCaSO₄·2H₂O，0.2×10^-3g/LFeCl₃·6H₂O，0.2×10^-3g/LNaMoO₄，0.2×10^-3g/LMnCl₂·4H₂O，0.2×10^-3g/LCuCl₂·2H₂O，0.2×10^-3g/LZnSO₄，0.3×10^-3g/LH₃BO₃，0.4×10^-3g/LCoCl₂·6H₂O和20mg/L十溴二苯醚，余量为水，调pH7.0；按1％接种量转接菌悬液于该含有十溴二苯醚的培养液中，透光振荡培养。不同时间后取出一个棕色培养瓶并加入1/2积的培养液，然后加入1/2积的二氯甲烷萃取培养液中的十溴二苯醚，转移二氯甲烷于氮吹瓶中，再加入同样体积的二氯甲烷到棕色培养瓶中重新萃取两次，合并所有萃取剂于氮吹瓶中吹干。吹干后将溶剂转换为正己烷后，定容，用0.22μm有机相膜过滤正己烷后，进行HPLC测定。在5d、10d、20d、30d时，鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY降解的十溴二苯醚的量分别为0.27、1.69、3.46、3.57mg/L；表明疏水鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY对疏水性有机物多溴二苯醚具有较强的降解能力，为环境中多溴二苯醚的污染治理提供了新型的降解微生物。

Claims (4)

1.一种鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY，其保藏编号为CCTCCNO：M2015419。

2.权利要求1所述的鞘脂菌(Sphingobiumsp.)IBY在吸附降解疏水性有机物中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的疏水性有机物为多溴联苯醚或苯系物。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于，所述的多溴联苯醚为十溴二苯醚。